Artigo abmba v2_n1_2014_01

ISSN 2318-4752 – Volume 2, N1, 2014
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IDENTIFICAÇÃO DE Lactobacillus spp. ISOLADOS DO CONTEÚDO FECAL DE
SUÍNOS ORIUNDOS DE CRIAÇÕES INTENSIVAS PELA TÉCNICA DE BIOLOGIA
MOLECULAR (PCR-ARDRA)
IDENTIFICATION OF Lactobacillus spp. ISOLATED FROM THE FECAL MICROBIOTA OF SWINES
FROM INTENSIVE BREEDING BY THE MOLECULAR BIOLOGY TECHNIQUE (PCR-ARDRA)
FLÁVIO HENRIQUE FERREIRA BARBOSA1; FELIPE HENRIQUE SILVA BAMBIRRA2; LEANDRO
HENRIQUE SILVA BAMBIRRA3; RUBENS ALEX DE OLIVEIRA MENEZES4
RESUMO
A produção de alimentos saudáveis e nutritivos em grande quantidade tem se tornado um desafio para todos
os profissionais que trabalham com toda a cadeia produtiva alimentícia. A produção mundial de suínos
cresceu e o Brasil teve um aumento significativo nas exportações de carne suína. Para que a atividade de
criação de suínos se mantenha produtiva, com a geração de lucros, promotores de crescimento têm sido
incorporados às rações, com objetivo de melhorar o processo digestivo e o desempenho zootécnico dos
animais, resultando em maior ganho de peso e redução do número de doenças. Entretanto, nos últimos anos
tem aumentado a conscientização sobre o uso excessivo destes produtos, bem como se tornado evidente os
possíveis transtornos à saúde destes animais e do homem, como consequências desta suplementação. As
alternativas disponíveis para substituição dos antimicrobianos na suinocultura incluem a utilização de
probióticos, prebióticos, simbióticos e agentes fitoterápicos. Seguindo esta linha de raciocínio, este trabalho
se propôs a isolar, identificar por técnicas de biologia molecular (PCR-ARDRA16S-23S rRNA) os Lactobacillus
spp. e caracterizar alguns aspectos da fisiologia destes microrganismos produtores de ácido láctico, presentes
no trato gastrintestinal (TGI) de suínos criados de forma intensiva (sem o fornecimento de antimicrobianos em
sua dieta), com idades diferentes (primeiros dias de vida e época de abate). Sendo assim, foi dado o primeiro
passo visando a prospecção de microrganismos probióticos a serem utilizadas em suinocultura. Destaca-se,
porém, a necessidade de testes in vitro, ex vivo e in vivo nos animais de criação, visando garantir o sucesso
da utilização das linhagens aqui identificadas.
PALAVRAS-CHAVE: Lactobacillus, bactérias lácticas, suínos, probiótico.
ABSTRACT
The production of healthy and nutritious food in large quantities has become a challenge for all professionals
who work with the entire food production chain. World swine production grew and Brazil saw a significant
increase in exports. In order for the pig breeding activity to remain productive, with the generation of profits,
growth promoters have been incorporated into the rations, with the objective of improving the digestive process
and the zootechnical performance of the animals, resulting in greater weight gain and reduced number of
diseases. However, in recent years there has been an increase in awareness about the excessive use of these
products, as well as the possible health disorders of these animals and man, as consequences of this
supplementation, have become evident. The alternatives available to replace antimicrobials in pig farming
include the use of probiotics, prebiotics, symbiotics and herbal agents. Following this line of reasoning, this
work aimed to isolate, identify by molecular biology techniques (PCR-ARDRA16S-23S rRNA) Lactobacillus
spp. and to characterize some aspects of the physiology of these lactic acid-producing microorganisms,
present in the gastrointestinal tract (GIT) of swine raised intensively (without the supply of antimicrobials in
their diet), with different ages (first days of life and slaughter season) . Therefore, the first step was taken with
a view to prospecting probiotic microorganisms to be used in pig farming. However, the need for in vitro, ex
vivo and in vivo tests on farm animals is highlighted, in order to guarantee the successful use of the strains
identified here.
KEYWORDS: Lactobacillus, lactic bacteria, swine, probiotic.

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INTRODUÇÃO
A produção de alimentos saudáveis e
nutritivos em grande quantidade tem se
tornado um desafio para todos os profissionais
que trabalham com toda a cadeia produtiva
alimentícia. Estimativas indicam que o
suprimento de alimentos necessários para
atender aos requerimentos nutricionais da
população humana durante os próximos
quarenta anos equivale à quantidade
previamente produzida ao longo de toda a
história. Para atender a esta grande demanda
de alimentos de origem animal, os
pesquisadores têm se esforçado na busca de
novas tecnologias a fim de aumentar a
eficiência e a produtividade dos animais de
criação.
A suinocultura é um dos setores
agropecuários que mais tem crescido nas
últimas décadas. Segundo dados da
EMBRAPA, a produção de carne suína no
Brasil vem crescendo mais 5% ao ano desde
o ano de 2006. A produção mundial de suínos
cresceu sistematicamente nos últimos 30
anos e o Brasil teve um aumento significativo
nas exportações de carne suína, chegando à
quarta colocação mundial e, atualmente, esse
produto pode ser encontrado até na Rússia. A
este fato, associa-se um marcante aumento
no comércio e consumo de carne de suínos
em todo o mundo, sendo que sua produção
está rapidamente se expandindo em muitos
países em desenvolvimento, como o Brasil, o
que faz aumentar o rigor no manejo dos
animais e na produção da carne.
Para que a atividade de criação de
suínos se mantenha produtiva, com a geração
de lucros, muitos aditivos (incluindo
promotores de crescimento, como drogas
antimicrobianas) têm sido incorporados às
rações, com objetivo de melhorar o processo
digestivo e o desempenho zootécnico dos
animais, resultando em maior ganho de peso
e redução do número de doenças. Entretanto,
nos últimos anos tem aumentado a
conscientização sobre o uso excessivo destes
produtos, bem como se tornado evidente os
possíveis transtornos à saúde destes animais
e do homem, como consequências desta
suplementação.
Os antimicrobianos promotores de
crescimento podem alterar a microbiota do
trato digestivo e deprimir os mecanismos de
defesa dos animais, além de deixar resíduos
indesejáveis à saúde do homem na carne.
Além disso, a presença de concentrações
baixas de antimicrobianos pode ser
responsável pelo aumento dos fenômenos de
resistência bacteriana aos mesmos.
Recentemente, novos microrganismos
resistentes a uma ou várias drogas
antimicrobianas têm surgido e sido motivo de
preocupação para a saúde pública mundial.
Estes microrganismos modificados podem se
difundir pelo meio ambiente e estarem
presentes na carne dos animais.
Por causa destas evidências, a
ausência de microrganismos potencialmente
patogênicos e a ausência de resíduos de
produtos químicos têm se tornado os
principais indicadores de qualidade da carne
de suínos, bem como de outros alimentos.
Assim, a suinocultura brasileira precisará se
adaptar às futuras normas de comércio
internacional, pois alguns países
importadores, principalmente da União
Europeia, não mais aceitarão adquirir carne
de suínos oriunda de produtores que utilizam
antimicrobianos para aumentar os índices de
produtividade de seus plantéis.
Assim, tem gerado a necessidade de se
buscar alternativas que possam promover os
mesmos efeitos de produtividade
relacionados ao uso dos aditivos alimentares,
porém, sem causar as mesmas
consequências indesejáveis destes. Além
disto, ainda existem prejuízos relacionados ao
impacto econômico da retirada destas drogas
antimicrobianas da alimentação de suínos.
Isto representa aumento nos custos de
produção, sendo, principalmente, causados
por aumento no consumo de ração e no
período de ocupação dos galpões, menos
ciclos produtivos por ano, além de mais gastos
com a mão-de-obra.
As alternativas disponíveis para
substituição dos antimicrobianos na

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suinocultura incluem a utilização de
probióticos, prebióticos, simbióticos e agentes
fitoterápicos. Dentre estas, a utilização dos
microrganismos probióticos constitui uma
perspectiva extremamente interessante, pois
as próprias bactérias benéficas da microbiota
intestinal dos animais poderiam ser
empregadas em substituição aos
antimicrobianos. Nestes casos, estes
microrganismos poderiam favorecer o
equilíbrio do ecossistema gastrintestinal, o
que seria refletido em melhoria da saúde e
boa produtividade. Trabalhos científicos têm
sido conduzidos tentando avaliar a eficiência
da utilização dos probióticos, em substituição
aos produtos químicos, para modular a saúde
de suínos comerciais e proporcionar um
ganho de peso adequado. Bactérias do
gênero Lactobacillus são os principais
microrganismos desejáveis encontrados em
grandes quantidades por todo o trato
gastrintestinal (TGI) de suínos, mostrando ser
fortes candidatas como probióticos para estes
animais.
Seguindo esta linha de raciocínio, este
trabalho se propôs a isolar, identificar por
técnicas de biologia molecular (PCR-
ARDRA16S-23S rRNA) os Lactobacillus spp.
e caracterizar alguns aspectos da fisiologia
destes microrganismos produtores de ácido
láctico, presentes no TGI de suínos criados de
forma intensiva (sem o fornecimento de
antimicrobianos em sua dieta), com idades
diferentes (primeiros dias de vida e época de
abate).
Considerações Éticas
Este trabalho foi submetido à avaliação
pelo Comitê de Ética para Experimentação
Animal da Universidade Federal de Minas
Gerais (CETEA/UFMG) para ensaio com os
animais suínos recém-nascidos e jovens
recebendo parecer positivo, registrado sob o
número de protocolo: 108/08.
MATERIAL E MÉTODOS
Microrganismos
Isolamento e Caracterizações Morfo-
tintorial, Bioquímica e Fisiológica de
Microrganismos Produtores de Ácido
Láctico Isolados do TGI de Suínos (Sus
scrofa domesticus), Criados de Forma
Intensiva (granja).
Amostragem
A amostragem dos suínos (Sus scrofa
domesticus) oriundos de criação comercial foi
composta por quatro animais, sendo dois com
21 dias de idade e outros dois com 140 dias
de idade, todos provenientes da Fazenda
Experimental “Professor Hélio Barbosa”, da
Escola de Veterinária da UFMG, localizada no
município de Igarapé, Minas Gerais. Os
animais utilizados foram da genética Dan Bred
(raças Large White e Landrace). A
alimentação fornecida foi baseada em
fórmulas específicas para cada fase da
criação (pré-inicial, inicial, crescimento e
terminação), elaborada por técnicos
especializados, descritas no item anterior.
Estes animais não fizeram uso de promotores
de crescimento, visando à eliminação de
fatores interferentes durante o isolamento dos
microrganismos.
Os animais foram selecionados nos
locais de criação e, imediatamente, foi
realizada a coleta das fezes. O material
coletado foi pesado e recuperado em um tubo
contendo solução salina tamponada (5,61 g
de NaCl, 1 g de KH2PO4, 2 g de Na2PO4 e 0,11
g de KCl em 1.000 mL de água destilada).
Esses tubos foram introduzidos, no menor
intervalo de tempo a seguir, dentro de uma
câmara anaeróbica (Forma Scientific
Company, Marietta, USA), contendo uma
atmosfera de 85% de N2, 10% de H2 e 5% de
CO2. Dentro da câmara anaeróbia, os
materiais colhidos foram suspensos e
homogeneizados, com auxílio de um bastão
de vidro. Em seguida, diluições decimais até
10-7 foram preparadas com salina tamponada.
A partir de diluições adequadas (10-5 e 10-7) foi
usada uma alíquota de 0,1 mL de cada
diluição para semear uma placa de Petri
contendo ágar MRS, de Man - Rogosa -
Sharpe (Difco, Darmstadt, Alemanha). Após
espalhar o inóculo com alça de Drigalski, as

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placas foram incubadas a 37oC, na câmara
anaeróbica, durante 48 horas, quando foram
feitas as contagens (UFC/g de fezes) e o
isolamento.
Características Morfo-tintoriais,
Bioquímicas e Fisiológicas dos
Microrganismos Isolados
Numa placa contendo em torno de 100
unidades formadoras de colônia (UFC), as
colônias morfologicamente diferentes e mais
significativas do ponto de vista populacional
foram repicadas, a partir do ágar MRS (Difco),
no mesmo meio. A partir de colônias, de cada
amostra, que apresentarem aspectos
morfológicos distintos foram feitos esfregaços
em lâminas para coloração pelo método de
Gram. Além disto, a partir dessas mesmas
colônias foram feitos testes de catalase em
lâmina, utilizando-se H2O2 (30%). Aqueles
que se apresentaram como Gram-positivo e
catalase negativa, sugestivos de pertencerem
ao gênero Lactobacillus, foram submetidos à
identificação, utilizando técnicas de biologia
molecular.
Teste Respiratório
As amostras foram repicadas, em
triplicata, para placas de Petri contendo ágar
MRS (Difco). As placas foram incubadas sob
três condições de cultivo diferentes:
aerobiose, microaerofilia e anaerobiose. O
material foi incubado durante 48 horas a 37oC.
Purificação e Manutenção dos
Os microrganismos isolados e
avaliados pelas características morfo-
tintoriais, bioquímicas e fisiológicas e pelo
teste respiratório foram inoculados em 5 mL
de caldo MRS (Difco), sendo em seguida
incubados em anaerobiose, à 37ºC durante 48
horas. Após o crescimento, uma alíquota de
500 µL de cada tubo foi transferida para tubo
eppendorf e adicionada de glicerol esterilizado
(50 µL), sendo, em seguida, congelados a -
18ºC e -86ºC, para posterior utilização,
quando necessário. O restante dos cultivos foi
destinado às análises baseadas em técnicas
de biologia molecular, com a finalidade de
identificação das espécies isoladas.
Ativação das culturas
Amostras de Lactobacillus spp.
isoladas a partir do TGI dos suínos (Sus scrofa
domesticus), oriundos de criação intensiva, e
pré-identificadas pelo perfil de fermentação de
carboidratos (kit API 50 CHL, BioMérieux,
Marcy l’Etoile, France), foram descongeladas
e inoculadas (200 µL) em caldo MRS (Difco).
O meio foi incubado, sob condições de
anaerobiose, a 37ºC, durante 48 horas. Após
cinco passagens em caldo, 50 µL de cada
amostra foram repicados em ágar MRS
(Difco), por três métodos diferentes: pour-
plate, espalhamento com auxílio da alça de
Drigalski e estria. Então, as placas foram
incubadas em anaerobiose, sendo mantidas a
37ºC, durante 48 horas.
Identificação de Microrganismos
Produtores de Ácido Láctico, Isolados do
Conteúdo Fecal de Suínos Oriundos de
Criações Intensivas (Granja) pela Técnica
de Biologia Molecular - PCR-ARDRA
Estas análises foram realizadas no
Laboratório de Genética de Protozoários
Parasitos do Instituto de Ciências Biológicas
da Universidade Federal de Minas Gerais.
Extração de DNA Total
A extração do DNA total dos
microrganismos isolados de ágar MRS (Difco)
foi realizada a partir do cultivo recente em
caldo MRS (Difco), incubado sob
anaerobiose, a 37ºC, durante 24 horas, como
descrito anteriormente.
Obtenção dos Protoplastos e Lise
das Células
De cada cultivo dos microrganismos
que crescerem em caldo MRS, 10 mL foram
centrifugados a 1.500 g, durante 30 minutos,
à temperatura de 4ºC, para obtenção dos
pellets. Os sobrenadantes foram descartados.

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Os pellets foram lavados com 10 mL de água
deionizada e centrifugados a 1.500 g, durante
10 minutos. Os pellets foram suspensos em 1
mL de cloreto de lítio (5 M), transferidos para
tubos eppendorf e incubados, sob agitação
constante, à temperatura ambiente, por uma
hora, com a finalidade de extrair proteínas
associadas à parede bacteriana. Em seguida,
os tubos foram centrifugados a 15.350 g,
durante 5 minutos, descartando-se os
sobrenadantes. Os pellets foram novamente
suspensos e lavados com 1 mL de água
deionizada, para retirar o excesso de sal. Os
tubos foram centrifugados a 15.350 g, durante
5 minutos e os sobrenadantes descartados.
Os pellets foram suspensos em 1 mL de
tampão (25 mM de sacarose, 50mM Tris HCl
pH 8,0; 10 mM EDTA; 10 mg de lisozima mL-1
e 100 µg de RnaseA mL-1) para obtenção dos
protoplastos. O material foi incubado por uma
hora, sob agitação a 37ºC. Os tubos foram
centrifugados a 15.350 g, durante 5 minutos e
os sobrenadantes foram descartados. Em
seguida, os pellets foram suspensos em 500
µL de tampão descrito acima (sem sacarose e
lisozima) e as células foram lisadas com a
adição de 100 µL de dodecil sulfato de sódio
(SDS) 2%.
Extração do DNA
Em cada tubo, foram acrescentados
600 µL de fenol, sendo agitados à temperatura
ambiente, durante 5 minutos. Em seguida, os
mesmos foram centrifugados a 15.350 g, a
20ºC, durante 10 minutos. Os sobrenadantes
foram transferidos para tubos contendo 600
µL de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico
(25:24:1), sendo agitados à temperatura
ambiente, durante 5 minutos. Em seguida, os
mesmos foram centrifugados a 15.350 g, a
20ºC, durante 5 minutos. Os sobrenadantes
foram transferidos para tubos contendo 600
µL de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1),
sendo agitados à temperatura ambiente,
durante 5 minutos. Em seguida, os mesmos
foram centrifugados a 15.350 g, a 20ºC,
durante 5 minutos. Os sobrenadantes foram
transferidos para tubos contendo 600 µL de
isopropanol, sendo centrifugados a 15.350 g,
durante 30 minutos, para precipitação do
DNA. Os sobrenadantes foram retirados e os
pellets foram lavados com 500 µL de etanol
(70%), sendo centrifugados a 15.350 g,
durante 10 minutos, a 20ºC. O álcool foi
retirado e o pellet foi suspenso em 100 µL de
TE sem RNAse.
Quantificação do DNA
Com o objetivo de visualizar a
quantidade de DNA total extraído na etapa
anterior, as amostras de DNA extraído foram
submetidas à eletroforese em gel de agarose.
Cinco µL de cada amostra de DNA total
extraído foram misturados com 1 µL de
tampão (glicerol adicionado de azul de
bromofenol). Em seguida, foi realizada a
eletroforese em gel de agarose (1%),
adicionado de 3 µL de brometo de etídeo,
utilizando 100 V, durante 40 minutos.
Paralelamente, no mesmo gel, foi utilizado o
marcador de peso molecular de 1 Kb. Ao
término da corrida, os géis foram fotografados,
por meio de equipamento de
fotodocumentação, sob incidência de luz
ultravioleta.
Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR)
Posteriormente, as amostras de DNA
total foram submetidas à reação de PCR,
visando amplificar a região intergênica
espaçadora entre as subunidades ribosomais
(16S e 23S) de Lactobacillus, de acordo com
metodologia proposta por TILSALA &
ALATOSSAVA (1997), utilizando iniciadores
universais que se anelam nas regiões
conservadas dos genes 16S e 23S rRNA. Esta
região do DNA é bastante variável entre as
espécies de microrganismos, porém, bastante
conservada em microrganismos da mesma
espécie, sendo então, utilizada em pesquisas
de identificação microbiana, ao nível
molecular (BARRY et al., 1991).

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Em seguida, os tubos eppendorf,
contendo as amostras de DNA com os
reagentes, foram colocados dentro da
máquina termocicladora MJ Research
(Watertown, Massachussets, United States),
sendo utilizado o seguinte programa:
Posteriormente, 5 µL de cada produto
de PCR foram misturados com 1 µL do
tampão glicerol com azul de bromofenol, e
então, submetidos à nova eletroforese em gel
de agarose (1,4 %), adicionado de 3 µL de
brometo de etídeo, utilizando 100 V, durante
45 minutos. Ao final da corrida, os géis foram
fotografados, para visualização das regiões
amplificadas.
Restrição Enzimática dos Produtos
de PCR 16S-23S rRNA Com Endonucleases
Específicas (ARDRA – Amplified
Ribosomal DNA Restriction Analysis)
Após a obtenção dos produtos de PCR,
os mesmos foram submetidos à ação de
endonucleases (ARDRA), de acordo com
compilação de sequências de nucleotídeos
disponíveis no GenBank, para a identificação
das espécies de bactérias isoladas. As
enzimas utilizadas foram: Sph I, Nco I, Nhe I
(que cortam o DNA dentro do gene 16S), Ssp
I, Sfu I, Dra I, Vsp I, Eco RI (que clivam o DNA
na região espaçadora), Hinc II ou Hpa I e Hind
III (que clivam o DNA dentro do gene 23S).
Também foi utilizada a enzima Eco RV, que
cliva o DNA de Lactobacillus do grupo casei
na região intergênica 16S-23S e dentro do
gene 23S no grupo acidófilo. Todas as
enzimas utilizadas foram adquiridas da
companhia Promega Corporation (Madison,
Wisconsin, United States). Como algumas
destas enzimas necessitam de albumina
sérica bovina (BSA) para sua melhor
atividade, foram preparadas duas misturas
diferentes:
Após o preparo dos tubos, os mesmos
foram mantidos à 37ºC, durante uma a seis
horas, para proceder à reação enzimática. Em
seguida, 5 µL de cada produto foram
misturados com 1 µL do tampão glicerol com
azul de bromofenol, e então, submetidos à
eletroforese em gel de agarose (1,4%),
adicionado de 3 µL de brometo de etídeo,
utilizando 100 V, durante 45 minutos. Os
resultados foram visualizados por
transluminador, com luz ultravioleta, e foram
fotografados. O perfil de restrição enzimática
de cada produto de PCR-ARDRA 16S-23S foi
comparado com o perfil de restrição
característico de cada espécie de bactéria
produtora de ácido láctico, sendo assim
confirmada a identificação específica.

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RESULTADOS E DISCUSSÃO
Microrganismos
Isolamento e Caracterizações Morfo-
tintorial, Bioquímica e Fisiológica de
Microrganismos Produtores de Ácido
Láctico Isolados do TGI de Suínos (Sus
scrofa domesticus), Criados de Forma
Intensiva (granja).
A amostragem dos suínos (Sus scrofa
domesticus) oriundos de criação comercial foi
composta por quatro animais, sendo dois com
21 dias de idade e outros dois com 140 dias
de idade. Ao todo, foram obtidas 50 amostras
de microrganismos das fezes dos animais
estudados. A concentração microbiana em
UFC/g de conteúdo fecal foi 109 (Log). Todos
apresentaram características típicas de
bactérias produtoras de ácido láctico, como
morfologia de bastonetes ou cocos, coloração
Gram-positivo e teste de catalase com
resultado negativo. Destes isolados, foram
selecionadas 31 amostras de microrganismos
os quais se apresentavam como bastonetes
(sugerindo microrganismos do gênero
Lactobacillus) para que fosse realizada a
identificação por meio de técnicas
moleculares. Estes resultados se mostraram
semelhantes àqueles demonstrados por
outros pesquisadores (ROBINSON, 1991;
SALMINEM & VON WRIGHT, 1993),
confirmando a seletividade do meio de cultura
utilizado para o isolamento inicial (MRS -
Difco).
Nove tipos morfológicos diferentes de
colônias foram observados nas placas de ágar
MRS, cultivado sob anaerobiose, a partir da
inoculação de material fecal de suínos com 21
dias de vida. Destes, seis (66,66 %)
apresentaram-se como bastonetes Gram-
positivo, catalase negativa e três (33,34 %)
como cocos Gram-positivo, catalase negativa.
Sete tipos morfológicos diferentes
foram obtidos das fezes de suínos
(jovens/terminados) com 140 dias de vida.
Destes, 5 (71,42 %) apresentaram-se como
bastonetes Gram-positivo, catalase negativa e
dois (28,58 %) como cocos Gram-positivo,
catalase negativa.
A maior parte dos microrganismos
isolados demonstrou crescimento sob as
condições respiratórias investigadas
(anaerobiose, aerobiose e microaerofilia),
porém com melhor desenvolvimento sob
microaerofilia ou anaerobiose e menor sob
aerobiose. Estes resultados relacionam-se às
baixíssimas concentrações de oxigênio
existentes nos intestinos de suínos e,
também, relativos às características dos
microrganismos do gênero Lactobacillus.
Desta forma, acaba ocorrendo uma seleção
para que os microrganismos presentes neste
habitat sejam, predominantemente,
anaeróbios ou microaerófilos.
A presença de bastonetes Gram-
positivo, anaeróbios facultativos ou
microaerófilos, catalase negativa confirma a
ocorrência de bactérias do gênero
Lactobacillus observados em outros trabalhos
(GUILLOT, 2001; GONG et al., 2002; ZHU &
JOERGER, 2002; APAJALAHTI et al., 2004 e
MACARI & FURLAN, 2005).
Características Morfo-tintoriais,
Bioquímicas e Fisiológicas dos
Quando foram avaliadas amostras de
Lactobacillus spp. isolados a partir das fezes
de suínos adultos (Sus scrofa domesticus),
oriunda de criação intensiva e identificados
pelo perfil de fermentação de carboidratos (kit
API 50 CHL, BioMérieux, Marcy l’Etoile,
France), verificou-se que os mesmos
apresentaram crescimento satisfatório, após
três passagens em caldo MRS, incubado sob
anaerobiose a 37ºC, durante 24-48 horas. As
culturas inoculadas em ágar MRS
apresentaram crescimento nas placas
indiferente ao tipo de metodologia adotada
para a semeadura (espalhamento em
superfície com auxílio da alça de Drigalski,
esgotamento por estrias e técnica pour-plate).
Os resultados do teste respiratório das
culturas de Lactobacillus spp., cultivadas sob
aerobiose, microaerofilia e anaerobiose, se
mostraram bem diversificados reforçando a
habilidade das bactérias estudadas em
crescer sob diferentes condições de cultivo.
Entretanto, da mesma forma que

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demonstrada por Cerqueira (2000), os
resultados obtidos com as amostras de
microrganismos produtores de ácido láctico
isolados das fezes de suínos jovens e adultos,
foram melhores quando as mesmas foram
incubadas sob condições de anaerobiose.
Este fato também pode ser justificado pelas
baixíssimas concentrações de oxigênio
normalmente presentes nos locais em que os
microrganismos se apresentam em maior
número no TGI dos animais.
O crescimento sob diferentes
condições de cultivo apresentado por
microrganismos isolados no presente trabalho
pode significar uma grande vantagem
evolutiva para estas amostras, facilitando a
sua adaptação e sobrevivência em diferentes
ecossistemas. Isso pode resultar também em
melhor adaptação ao processamento
industrial pela qual estes microrganismos
poderão vir a sofrer caso sejam utilizados na
elaboração de produtos probióticos.
Identificação de Microrganismos
Produtores de Ácido Láctico, Isolados do
Conteúdo Fecal de Suínos Oriundos de
Criações Intensivas (Granja) pela Técnica
de Biologia Molecular - PCR-ARDRA
Estas análises foram realizadas no
Laboratório de Genética de Protozoários
Parasitos do Instituto de Ciências Biológicas
da Universidade Federal de Minas Gerais.
Foram submetidas à identificação ao nível
molecular 31 amostras de microrganismos do
conteúdo fecal de suínos jovens (21 dias) e
terminados (140 dias) provenientes de
sistema de criação intensiva.
Os microrganismos isolados neste
estudo, caracterizados como bastonetes
Gram-positivo, catalase negativa, com
crescimento anaeróbio facultativo (n=31, ou
seja, 62,00%) apresentaram três ou mais
cópias da região intergênica 16S-23S em seu
DNA (amplificação de três ou mais segmentos
de DNA). Este fato é indicativo de espécies de
bactérias ácido-lácticas, como Lactobacillus,
Carnobacterium, Pediococcus e Weissella
(TANNOCK et al., 1999). Por outro lado, a
presença de cocos de crescimento facultativo,
Gram-positivo, catalase negativa (n=19, ou
seja, 38,00%) possuindo, no mínimo, uma e
duas cópias da região intergênica 16S-23S
em seu DNA (amplificação de um ou mais e
dois ou mais segmentos de DNA) sugere o
isolamento de espécies pertencentes aos
gêneros Streptococcus e Enterococcus,
respectivamente (TANNOCK et al., 1999).
Destaca-se que estes dois gêneros
microbianos anteriormente citados, não foram
utilizados neste trabalho.
A figura que se segue apresenta
exemplos de fotos dos géis de agarose
relativos a PCR-ARDRA 16S-23S rRNA,
realizadas para amplificação desta região
intergênica utilizada para a identificação dos
microrganismos isolados.
Figura 1. Perfil eletroforético dos espaçadores longo,
médio e curto, amplificados, das regiões intergênicas
16S-23S do rDNA de Lactobacillus, em gel de agarose
1,4%. PM: padrão de peso molecular 1 Kb (Promega).
Amostras aplicadas nas canaletas: numeração de 1 à
15.
A região intergênica 16S-23S
representada como três bandas de DNA, com
pesos moleculares diferentes sugere material
genético de Lactobacillus spp., indicando que
existem três versões diferentes (ou mais)
destes genes no genoma destas bactérias.
Isto ocorre porque uma banda pode
representar uma ou mais regiões intergênicas
com pesos moleculares semelhantes,
amplificadas na reação de PCR. Como estes
fragmentos de DNA apresentam velocidade
de migração muito parecida durante a
eletroforese, ao final desta análise, os
mesmos irão se localizar muito próximos,
produzindo a imagem de uma só banda. A

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mesma discussão pode ser aplicada onde
ocorreu a amplificação de uma e duas bandas
no gel de agarose, sugerindo a presença de
Streptococcus spp. e Enterococcus spp.,
respectivamente.
Estes resultados estão de acordo com
a literatura consultada, pois Lactobacillus
spp., são bactérias produtoras de ácido
láctico, encontradas em grandes quantidades
no TGI de suínos e diversos outros animais
(GUILLOT, 2001; GONG et al., 2002; ZHU E
JOERGER, 2002; APAJALAHTI et al., 2004 e
MACARI & FURLAN, 2005). A identificação de
Lactobacillus por meio de estudos do DNA
ribosomal 16S (rDNA) provém uma base
acurada para sua análise filogenética e
identificação. Uma identificação perfeita seria
obtida por meio do sequenciamento de todo o
gene rDNA 16S, porém isto significa que cerca
de 1,5 kp de DNA tivessem de ser
sequenciados (TANNOCK et al., 1999).
Apesar dos resultados da reação de
PCR-ARDRA 16S-23S rRNA e das análises
de coloração morfo-tintoriais indicarem que
algumas amostras podem pertencer a
gêneros, como Lactobacillus (amostras de
número 12A, 19A e 28A) e Streptococcus
(amostra de número 14A) - não mostradas
neste trabalho - as mesmas foram
consideradas como bactérias produtoras de
ácido láctico (BAL), pois o perfil de restrição
enzimática de produto de PCR-ARDRA 16S-
23S das mesmas não permitiu a identificação
ao nível de espécie. Estas amostras poderão
ser sequenciadas no futuro.
Já as figuras a seguir, mostram
exemplos de fotos de géis de agarose após a
restrição enzimática dos produtos de PCR
16S-23S rRNA, utilizada para a identificação
dos microrganismos ao nível de espécie.
Figura 2. Gel de agarose (1,4%) contendo o perfil de
restrição enzimática dos espaçadores longo, médio e
curto, amplificados, da região intergênica 16S-23S do
rDNA, utilizada para a identificação dos
microrganismos ao nível de espécie. Lactobacillus
acidophilus no 13 A – origem suína.
salivarius no 08 A – origem suína.
reuteri no 11 A – origem suína.
mucosae no 06 J – origem suína.

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johnsonii no 18 J – origem suína.
ruminis no 14 J – origem suína.
A Figura 8, abaixo, mostra a
distribuição total de espécies de Lactobacillus
isoladas do conteúdo fecal de suínos em
criação intensiva, considerando as idades
estudadas – recém-desmamados (21 dias) e
adultos jovens/terminados (140 dias). É
importante destacar que os gráficos refletem
somente os morfotipos identificados como
Lactobacillus.
Figura 8. Distribuição total de espécies de
Lactobacillus isoladas do conteúdo fecal de suínos em
criação intensiva, considerando as idades estudadas –
animais recém-desmamados (21 dias) e animais
terminados (140 dias).
Das fezes de suínos recém-
desmamados com 21 dias de idade foram
identificadas 18 bactérias, sendo que 100%
destas eram Lactobacillus spp..
Das fezes de suínos jovens/terminados
com 140 dias de idade foram identificadas 13
bactérias, sendo que 100% destas eram
Lactobacillus spp..
A presença em elevado número de
Lactobacillus na microbiota do TGI de suínos,
foi descrita por Leser et al. (2002). A presença
destes microrganismos nos intestinos e até
mesmo no estômago deste tipo de animal
estudado pode ser considerada
extremamente benéfica, principalmente por se
considerar Lactobacillus como uma bactéria
potencialmente probiótica (FULLER, 1988;
FULLER, 1989 e GUILLOT, 2001). Os efeitos
desejáveis destas bactérias neste
ecossistema podem ser causados por
produção de ácidos láctico e acético (este em
menor quantidade), além da redução do pH
local, o que inviabiliza o desenvolvimento de
bactérias indesejáveis, como as putrefativas e
as patogênicas (SALMINEM & VON WRIGHT,
1993).
Em relação à diversidade de
Lactobacillus, seis espécies diferentes foram
identificadas nas fezes dos animais
estudados. Suínos recém-desmamados e
terminados apresentaram números diferentes,
porém bem próximos, de espécies de
Lactobacillus no conteúdo analisado, seis e
três, respectivamente. Portanto, estes dados
mostram que a diversidade da população de
Lactobacillus nos animais não aumentou
muito ao longo da vida. Este fato também foi
observado por Fuller e Brooker (1974) e Lu et
al. (2003).

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Tabela 2. Distribuição de espécies identificadas de
Lactobacillus spp., isoladas do conteúdo fecal de
suínos recém-desmamados e terminados criados em
sistema intensivo.
Sabe-se, também, que o ambiente
influencia a sequência de colonização dos
sítios do TGI. Isto pode estar relacionado com
as condições gerais de manejo, sanidade e
também da dieta (MACARI & FURLAM, 2005).
Estes fatores, associados, podem explicar a
pequena diferença em relação à diversidade
(em animais recém-desmamados foi maior a
quantidade de espécies microbianas)
observada na microbiota dos animais.
Aqueles animais que estão acabando de ser
desmamados e passando a receber outro tipo
de dieta ainda não apresentam uma
microbiota tão estável como se supõe
encontrar em animais terminados/adultos.
Vegetais, água, fezes de animais adultos
podem ser fontes ricas de Lactobacillus
(SALMINEN, 1998; MENTEM & PEDROSO,
2005).
Dentre os vários fatores exógenos e
endógenos que influenciam a microbiota
intestinal, dieta e nível de estresse podem ter
determinado as diferenças verificadas entre
as espécies de microrganismos presentes na
microbiota fecal de suínos, como sugerido por
vários pesquisadores em estudos envolvendo
outras espécies animais (ALZUETA et al.,
2003 e WAGE, 2003). O uso de drogas
antibacterianas não pode ser aplicado neste
caso já que os suínos criados na fazenda da
UFMG não recebem promotores de
crescimento, os quais poderiam influenciar
ativamente na diversidade e concentração de
microrganismos.
Foram observadas diferenças em
relação aos Lactobacillus das microbiotas
fecais dos animais estudados, em relação aos
fatores estudados. Saavedra e Tschermia
(2002) justificaram que a variedade de
microbiotas de TGI entre animais diferentes
ocorre devido a diversos fatores exógenos,
como: alimentação, ambiente de criação,
estresse, localização geográfica, dentre
outros, apesar de Tannock (2003) considerar
que microrganismos deveriam ser
encontrados em todos os indivíduos de uma
determinada espécie animal,
independentemente de sua localização
geográfica.
Lactobacillus acidophilus foi a espécie
bacteriana encontrada em maior número,
embora não se possa afirmar o mesmo quanto
à sua concentração nas fezes dos suínos,
independentemente da idade, já que esta
análise não foi realizada. Considerando que,
talvez, esta seja a espécie de Lactobacillus
presente em TGI de suínos com maior número
de evidências probióticas descritas na
literatura (FULLER, 1989), este fato seria uma
vantagem para o equilíbrio do ecossistema
dos suínos.
Lactobacillus reuteri foi a segunda
espécie mais numerosa nas fezes dos
animais, tanto jovens quanto adultos. O
padrão de dominância de Lactobacillus reuteri
no TGI de suínos e outros animais podem ser
determinados pela produção da reuterina
(metabólito intermediário do glicerol), a qual
possui efeito bactericida contra diversos
microrganismos (TALARICO et al., 1988),
determinando uma vantagem para esta
espécie de acordo com o princípio de
exclusão competitiva (EDENS, 2003). É
importante destacar que, como citado acima,
não se possa afirmar o mesmo quanto à sua
dominância (concentração nas fezes dos
suínos), independentemente da idade, já que
esta análise não foi realizada. Refere-se
nestes casos aos números de morfotipos
isolados e identificados. Lactobacillus
mucosae, Lactobacillus salivarius,
Lactobacillus ruminis e Lactobacillus johnsonii
foram encontrados em menor número nas
amostras fecais de suínos.

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CONCLUSÃO
Pelos resultados obtidos e nas
condições em que foram realizados os testes,
foi possível avaliar e constatar, que o
isolamento, enumeração e identificação dos
Lactobacillus presentes na microbiota fecal de
suínos mostrou níveis populacionais em torno
de 109 e uma preponderância de L.
acidophilus e L. reuteri. O Isolamento e
identificação por técnicas de biologia
molecular (PCR-ARDRA16S-23S rRNA) foi
viável, alcançando resultados confiáveis em
curto espaço de tempo, provando mais uma
vez sua aplicação prática e rápida em
processos de identificação.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALZUETA, C.; RODRIGUEZ, M.L.; CUTULI,
M.T. Effect of whole and demucilaged linsed in
broiler chicken diets on digesta viscosity,
nutrient utilization and intestinal microflora.
British Poultry Sci., v. 44, p. 67-74, 2003.
APAJALAHTI, J.; KETTUNES, A; GRAHAM,
H. Characteristics of the gastrointestinal
microbial communities, with special reference
to the chicken. World´s Poultry Science
Journal, v. 60, p. 223-232, 2004.
BARRY, T.; COLLERAN, G.; GLENNON, M.;
DUNICAN, L.K.; GANNON, F. The 16S/23S
ribosomal spacer region as a target for DNA
probes to identify eubacteria. PCR Method.
Appl., v. 1, p. 51-56, 1991.
CERQUEIRA, M.M.O.P. Isolamento, seleção
e efeitos de um probiótico na modulação da
infeccção por Eimeria acervulina e no
desempenho de frangos de corte. Belo
Horizonte: UFMG, 2000. 95 p. (Tese de
Doutorado)
EDENS, F.W. An alternative for antibiotic use
in poultry: probiotics. Rev. Bras. Ciência
Avícola, v. 5, p. 1-40, 2003.
FULLER, R. Probiotics in man and animals. J.
Appl. Bacteriol., v. 66, p. 365-378, 1989.
FULLER, R.; BROOKER, B.E. Lactobacilli
which attach to the crop epithelium of the fowl.
American J. of Clin. Nutr., v. 27, p. 1305-1312,
1974.
FULLER, R.; COLE, C.B. The Scientific Basic
of the Probiotic Concept. In: Probiotic: Theory
and Applications. Marlows: Chalcombe
Publications, p. 1-14, 1988.
GONG, J.; FORSTER, R.J.; YU, H.;
CHAMBERS, J.R.; WHEATCROFT, R.;
SABOUR, P.M.; CHEN, S. Molecular analysis
of bacterial populations in the ileum of broiler
chickens and comparison with bacterial in the
caecum. FEMS Microbiology, v. 41, p. 171-
179, 2002.
GUILLOT, J.F. Como utilizar correctamente
los probióticos en avicultura. Avicul. Indust., v.
19, p. 33-36, 2001.
LESER, T.D.; AMENUVOR, J.Z.; JENSEN,
T.Z.; LINDECRONA, R.H.; BOYE, M.;
MØLLER, K. Culture-Independent Analysis of
Gut Bacteria: the Pig Gastrointestinal Tract
Microbiota Revisited Appl. Environ. Microbiol.
v. 68, p. 673-690, 2002.
LU, J.; IDRIS, U.; HARMON, B.; HOFACRE,
C.; MAURER, J.J.; LEE, M.D. Diversity and
succession of the intestinal bacteria
community of the maturing broiler chicken.
Appl. and Environ. Microbiol., v. 69, p. 6816-
6824, 2003.
MACARI, M.; FURLAN, R.L. Probióticos. In:
Anais da Conferência APINCO 2005 de
Ciência e Tecnologia Avícolas. Campinas
(Brasil): FACTA, v. 1, p. 53-77, 2005.
MENTEM, J.F.M..; PEDROSO, A.A. Fatores
que interferem na eficácia de probióticos. In:
Anais da Conferência APINCO 2005 de
Ciência e Tecnologia Avícolas. Campinas
(Brasil): FACTA, v. 1, p. 41-52, 2005.
ROBINSON, R. Therapeutics Properties of
Fermented Milks. England: Elsevier, 185 p.,
1991.

ISSN 2318-4752 – Volume 2, N1, 2014
13
RUTZ, F.; LIMA, G.J.M.M. O uso de
antimicrobianos como promotores de
crescimento no Brasil, Artigos Técnicos
Embrapa Suínos e Aves, 2001. Acessado em
10 de julho de 2006. Online. Disponível em
http://www.cnpsa.embrapa.br.
SAAVEDRA, J.M.; TSCHERMIA, A. Human
studies with probiotics and prebiotics: clinical
implications. British J. of Nutr., v. 87, p. 241-
246, 2002.
SALMINEN, S. Clinical applications of
probiotic bacteria. Int. Dairy J., v. 8, p. 563-
572, 1998.
SALMINEN, S.; VON WRIGHT, A. Lactic acid
bacteria. New York: Marcel Dekker, 442 p.,
1993.
TALARICO, T. L.; CASAS, I.A.; CHUMG, T.C.;
DOBROGOSZ, W.J. Production and isolation
of reuterin, a growth inhibitor produced by
Lactobacillus reuteri. Antimicrob. Agents
Chemother, v. 32, p. 1854-1858, 1988.
TANNOCK, G.W. Probiotics and prebiotics:
where we are going? Wymondham: Caister
Academic Press. 54 p., 2003.
TANNOCK, G.W.; TILSALA-TIMISJARVI, A.;
RODTONG, S.; NG, J.; MUNRO, K;
ALATOSSAVA, T. Identification of
Lactobacillus isolates from the gastrointestinal
tract, silage, and yoghurt by 16S-23S rRNA
gene intergenic spacer region sequence
comparisons. Appl. Environ. Microbiol., v. 65,
p. 4264-4267, 1999.
TILSALA, A.T.; ALATOSSAVA, T.
Development of oligonucleotide primers from
the 16S-23S rDNA intergenic sequences for
identifying different dairy and probiotic lactic
acid bacteria by PCR. Inter. J. Food Microbiol.,
v. 35, n. 1, p. 49-56, 1997.
WAGE, S.W. The role of enteric antibiotics in
livestock production. Camberra: Avcare
Limited. 338 p., 2003.
ZHU, X.Y.; JOERGER, R.D. Composition of
microbiota in content and mucus from caecae
of broiler chickens as measured by fluorescent
in situ hibridization with group-specific, 16S
rRNA-tarbeted oligonucelotides probes. Appl
and Environ Microbiol, v. 68, p. 124-137, 2002.
________________________________________
1 - Graduação em Ciências Biológicas.
Professor Adjunto do Departamento de
Morfologia (DMO – CCBS) da Universidade
Federal de Sergipe - UFS, Brasil.
E-mail: flaviobarbosaufs@gmail.com
2 - Graduação em Fisioterapia. Mestrado em
Microbiogia. Departamento de Microbiologia
(ICB) da Universidade Federal de Minas
Gerais - UFMG, Brasil.
3 - Graduação em Medicina Veterinária.
Departamento de Microbiologia (ICB) da
Universidade Federal de Minas Gerais -
UFMG, Brasil.
4 - Graduação em Enfermagem. Professor
Adjunto do Curso de Enfermagem da
Universidade Federal do Amapá (UNIFAP),
Brasil.

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