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BIOFILMES BUCAIS
Page e Korman (1997) DESAFIO MICROBIANO RESPOSTA IMUNO-INFLAMATÓRIA METABOLISMO DO TECIDO ÓSSEO E CONJUNTIVO Fatores de Risco Ambientais e Adquiridos Fatores de Risco Genéticos SINAIS CLÍNICOS DA DOENÇA PROGRESSÃO
TOLERÂNCIA AO O 2 Aeróbias: bactérias crescem muito bem em atmosfera normal; Microaerófilas: bactérias crescem melhor em atmosfera de O 2  reduzido; Anaeróbias: crescimento na ausência de O 2 ; Anaeróbicas facultativas: crescem tanto em ambiente anaeróbio quanto aeróbio; Capnofílicas:  bactérias crescem em ambiente com ótimas concentrações de CO 2  .
ECOLOGIA BUCAL estuda a relação entre a microbiota e a cavidade bucal (competição pela sobrevivência) desequilíbrio ecológico doença infecciosa
OBJETIVOS estudo dos mecanismos de implantação e de colonização bacteriana; estudo das influências da microbiota bucal sobre o hospedeiro; estudo das relações bióticas entre os diversos componentes da microbiota bucal; estudo das influências do meio ambiente bucal sobre a microbiota.
ECOSSISTEMA BUCAL epitélio bucal; dorso lingual; superfície dentária supragengival; região subgengival; saliva.
ECOSSISTEMA BUCAL dorso da língua região supragengival
MICROBIOTA BUCAL Podemos observar: 500 espécies de bactérias; 1 indivíduo -150 espécies 750 milhões de bactérias/ml de saliva; 160 bilhões de bactérias/g de material do sulco gengival; 200 bilhões de bactérias/g de biofilme.
Estágios ecológicos no estabelecimento da comunidade microbiana transmissão (número de bactérias e freqüência) aquisição espécies pioneiras ( S. salivarius – bacteriocinas ) ( S. oralis  e  S. sanguis  / adesinas) sucessão aumento da diversidade microbiana comunidade clímax
MICROBIOTA BUCAL   MICROBIOTA autóctone espécies >1% (sítio particular) MICROBIOTA suplementar espécies < 1% Lactobacillus  (10 -5  – 10 -3   / microbiota viável) e  S. mutans MICROBIOTA transitória   Loesche (1994)
ANIMAIS germ-free convencionais gnotobióticos
Fatores que influenciam a aquisição ou que interferem no equilíbrio da microbiota bucal.
ANAEROBIOSE
Tensões de O 2  na cavidade bucal meio ambiente 21% (160mmHg) cavidade bucal 12 – 14% bolsa periodontal 1 – 2%
Potencial de Óxido-Redução (Eh) reflete a quantidade de oxigênio Eh da saliva = +200mV
“ O sucesso universal dos anaeróbios nas membranas mucosas indica que esta relação é tão estável que deve ser considerada uma relação simbiótica.” Loesche (1994)
temperatura  - 36°C – 36,5°C  influencia na atividade enzimática, pH, solubilidade, crescimento; pH ( saliva) = 6,25 - 7,25;
SALIVA fluxo salivar; fatores agregantes - proteínas Ac; capacidade tampão; atividade antimicrobiana.
Aderência ou Adesão aderência às superfícies bucais – mucosa e dentes –  S. salivarius – S. sanguis ; aderência interbacteriana – coagregação / coadesão.
Fluido Gengival atividade mecânica atividade microbiana
Descamação Epitelial Fatores Sistêmicos do Hospedeiro Higiene Bucal Uso de Antimicrobianos
FONTE DE NUTRIENTES DIETA
composição química consistência física freqüência
SALIVA glicoproteínas sais inorgânicos aminoácidos vitaminas glicose neuraminidase  ácido siálico
FLUIDO GENGIVAL exsudato sérico aminoácidos livres glicose vitaminas
CONSIDERAÇÕES HISTÓRICAS Leeuwenhoek, 1683 animálculos Facinus pequenas formas de vida Black placa microbiana gelatinosa  Gibbons, 1970 conceito da aderência específica
Até a década de 60: etiologia obscura - cálculo dentário como fator irritante; Estudos pioneiros da microbiota subgengival  (Mac Donald  et al. , 1960; Socransky  et al , 1963); Estudos pioneiros da etiologia infecciosa  (Jordan & Keyes, 1964; Keyes & Jordan, 1964; Löe  et al ., 1965; Theilade  et al ., 1966). Década de 70 - consenso da etiologia infecciosa  (Genco  et al .,1969; Ellison, 1970; Keyes, 1970; Socransky, 1970).
Placa (biofilme) bacteriana (o) 1,7 X 10 11  por grama de peso seco  Socransky  et al . (1963)
POTENCIAL PATOGÊNICO DO BIOFILME hipótese do biofilme não-específico hipótese do biofilme específico
HIPÓTESE DOS SURTOS CASUAIS
MATÉRIA ALBA microrganismos células epiteliais descamadas restos alimentares componentes salivares
IMPORTÂNCIA CLÍNICA Estudos Epidemiológicos; Animais Germ free – sinais de DP; Gengivite Experimental (Löe et al., 1965; Theilade et al., 1966); Periodontite Experimental (Lindhe, 1976); Estudos Longitudinais.
BIOFILME DENTÁRIO Agregado estruturado e não calcificado de microrganismos contíguos em matriz orgânica, constituída por polímeros bacterianos e por substâncias da saliva e da dieta do hospedeiro.
BIOFILMES BUCAIS  (Darveau  et al.,  1977)   comunidades ecológicas de bactérias desenvolvidas p/ permitir a sobrevivência da comunidade; exibe cooperatividade metabólica; sistema circulatório primitivo; numerosos microambientes com diferentes pHs, tensão de oxigênio, potencial elétrico;  comportamento total/ diferente do que em culturas planctônicas,
BIOFILMES BUCAIS Mais de 65 novas proteínas interligadas entre si; Resistentes a resposta imuno-inflamatória; PMNs não podem c/ agregados superiores a 5 bactérias; Concentração de antibióticos superior 1500X; Anticorpos são efetivos dentro de um campo elétrico.
Biofilme Supragengival Biofilme Subgengival associado ao dente associado ao epitélio associado ao conjuntivo microbiota móvel intra-sucular
FORMAÇÃO DO BIOFILME DENTÁRIO SUPRAGENGIVAL
PELÍCULA ADQUIRIDA espessura 0,01µm - 1µm grupamentos sulfatos e carboxila orientados para saliva COMPOSIÇÃO QUÍMICA proteínas (albumina), lisozima, lactoferrina, amilase, IgA, IgG, fosfolipídios, glicoproteínas
PELÍCULA ADQUIRIDA FUNÇÕES BIOLÓGICAS proteção da superfície do esmalte confere permeabilidade seletiva ao esmalte interfere na aderência dos microrganismos à superfície dentária nutre e serve de substrato p/ os microrganismos
BIOFILME DENTÁRIO FASE DE COLONIZAÇÃO INICIAL (DE 0 A 8 HORAS)  MECANISMOS DE ADESÃO E ESTRUTURAÇÃO
superfície dentária Streptococcus mutans S. sanguis Lactobacillus A. viscosus dorso da língua S. salivarius A. naeslundii
FORMAÇÃO DO BIOFILME fase reversível adsorção de bactérias livres S.sanguis; A.viscosus; S. mitis ; adesão bacteriana à superfície dentária
fase irreversível interações hidrofóbicas (LTA) ( S. sanguis, A. viscosus, A. naeslundii, S. mutans ) lecitina (fibrila) X carboidrato (receptor) ( S. sanguis, S. oralis ) especificidade à galactose e ao ácido siálico interações eletrostáticas – Ca ++ salivar ( S. mutans ) interação envolvendo IgAs ( S. sanguis )
interação c/ proteínas salivares ricas em prolina ( A. viscosus, S. mutans ) interações com amilase ( S. gordonii ) interação c/ proteína salivar submandibular e sublingual ( S. mutans ) interações com glicosiltransferase e glucanos ( S. mutans, S. sobrinus ) (Rölla  et al ., 1984)
FASE DE CRESCIMENTO RÁPIDO (DE 4 A 48 HORAS) predominam mecanismos de aderência interbacteriana
MATRIZ INTERMICROBIANA 25% do volume do Biofilme
por meio de polissacarídeos ( S. mutans, sanguis, mitis, salivarius e Lactobacillus ) por meio de constituintes da saliva e do fluido gengival ( S. sanguis, S. oralis, A. naeslundii )
PEC S. mutans  enzima  invertase s a c a r o s e glicosiltransferase / frutosiltransferase polímero de glicose (glucan binding proteins – GBP) glucanos (mutano e dextrano)  levano (frutano)
 
PIC GLICOGÊNIO
Veillonella  e  Neisseria fermentadoras de ácido láctico modifica o pH final do biofilme
por meio de constituintes de superfície de bactérias de diferentes espécies ( A. viscosus ou A. naeslundii e  Estreptococos orais) ( S. sanguis e S. oralis  e  F. nucleatum ) ( S. sanguis e P. gingivalis ) ( Capnocytophaga gingivalis e A. israelli ) ( C. ochracea e A. naeslundii ) ( Prevotella loeschei e S. oralis )
FASE DE REMODELAÇÃO produtos extracelulares reações de co-agregação ecologia da placa mudanças na dieta (ingestação de sacarose) oxigênio no ambiente interações nutricionais produção de bacteriocinas
O 2  Carboidratos  Saliva Streptococcus  /  Actinomyces Lactato  Acetato  Formiato
Lactato  Veilonella   Acetato   Formiato   H 2   Menadiona Campylobacter   Pi / Pg
tiamina, putrescina, isobutirato   Formato   Fusobacterium / Eubacterium   Bacteroides / Micromonas     Co 2     Aa,  Capnocytophaga , Ec
SAÚDE PERIODONTAL Células bacterianas aderentes, predomínio de cocos Gram-positivos; Baixo número de Gram-negativos; Ausência de Espiroquetas; Ausência de bactérias com flagelos.  Listgarten, 1976
FORMAÇÃO DO BIOFILME DENTÁRIO SUBGENGIVAL
Cemento Radicular   Capnocytophaga  sp. Células Epiteliais Eikenella corrodens
BIOFILME DENTÁRIO SUBGENGIVAL associado ao dente formação do cálculo cáries radiculares
BIOFILME DENTÁRIO SUBGENGIVAL associado ao epitélio bastonetes e cocos G- bactérias flageladas espiroquetas
BIOFILME DENTÁRIO SUBGENGIVAL associado ao conjuntivo GN / PJL
Espiroquetas - GUNA (Listgarten, 1965) Espiroquetas e bastonetes fusiformes - epitélio gengival vital (Listgarten, 1965; Heylings, 1967) Bastonetes; filamentosos; cocos – espaços intercelulares e epiteliais da bolsa periodontal (Frank & Voegel, 1978; Frank, 1980) Invasão Bacteriana
Cocos; bastonetes; filamentosos; espiroquetas – epitélio das bolsas periodontais profundas. Aa.;  C. sputigena ; Mycoplasma; Espiroquetas - PJL (Saglie, 1982) Invasão X translocação - gengivite induzida em ratos (Sanavi  et al . - 1985) Invasão bacteriana gengival - sítios recorrentes (Pertuiset  et al . - 1987) Invasão   Bacteriana
Infecções periodontais: crescimento de bactérias comensais ou transmissão de bactérias ? Transmissão de Aa e Pg: membros da família (Petit  et   al. , 1993; Alaluusua  et al ., 1993; Di Rienzo  et al ., 1990). Transmissão de Aa e Pg: casais (Saarela  et al ., 1993; Van Stenhbergen  et al ., 1993). Ausência de evidências de transmissão de Aa: famílias com -  PJL (Tinoco  et al ., 1998). Ausência de evidência de transmissão de Pg: população (Indonésia) (Van Winkelhoff  et al ., 1996).
Principais Bactérias Bucais G+ Staphylococcus –  cocos, anaeróbios facultativos,  S. aureus e S. epidermidis -  saliva e biofilme supra e subgengival; Streptococcus  – cocos, anaeróbios facultativos, metabolismo predominante/ fermentativo, gênero predominante na cavidade bucal. S. oralis –  bactéria pioneira na formação do biofilme, IgA1-protease, produz PEC a partir de sacarose;
Principais Bactérias Bucais G+ S. mutans  – alta/ acidogênico e acidúrico, sua colonização e sua cariogenicidade são principal/ determinadas pela produção de PEC, que esta diretamente relacionada à ingestão de sacarose, isolado de casos de endocardite; S. salivarius : colonizador inicial da cavidade bucal, alta afinidade de ligação às células epiteliais bucais, língua e saliva; S. vestibularis : coloniza mucosa, não produz PEC.
Principais Bactérias Bucais G+ S. sanguis  – espécie predominante no biofilme, parece ser adaptado à colonização de superfícies lisas, produz H 2 O 2 , , papel protetor nas doenças periodontais, produz IgA1- protease e PEC, tem sido isolado de casos de endocardite;
Principais Bactérias Bucais G+ Lactobacillus  - bacilos regulares, anaeróbios facultativos, metabolismo oxidativo e fermentativo, acidúricos, crescimento ótimo em anaerobiose, mas se desenvolvem bem em 5-10% CO 2 ; encontrados na saliva, cavidades de cárie e biofilme dentário cariogênico;
Principais Bactérias Bucais G+ Actinomyces  – bacilos irregulares curtos ou longos, anaeróbios facultativos, biofilme dentário supra e subgengival; A. israelli  – é o principal causador de actinomicose, e é a espécie de  Actinomyces  dominante no biofilme dentário maduro; A. viscosus  -  associado a gengivite e presente em alta prevalência no biofilme dentário; A. odontolyticus –  habitat principal é o cálculo dentário, placa dentária e cavidades profundas de cárie.
Principais Bactérias Bucais G- Veillonella  – cocos pequenos, anaeróbios estritos, não fermentam carboidratos, utilizam principal/ piruvato e lactato, produzindo acetato, propionato, CO 2 , H 2 , assim, reduz o potencial cariogênico do biofilme dentário, não são consideradas patogênicas;
Principais Bactérias Bucais G-   Actinobacillus actinomycetemcomitans é anaeróbio facultativo, imóvel, bacilo pequenos, retos ou encurvados, possuem vesículas de membrana, com vários sorotipos; sorotipos mais comuns: periodontite do adulto - a PJL – b   (Aa 97% EUA, 50% São Paulo – Genco  et al. , 1986)
Porphyromonas gingivalis anaeróbio estrito, Gram -, imóvel, cocobacilo, assacarolítico
Prevotella  espécies Prevotella intermedia -  bacilos curtos, sacarolíticos, pigmentados em negro ou não anaeróbios estritos Bacteroides  espécies B. forsythus  (T. forsythensis)–  sacarolíticos, não pigmentados, bacilos com extremidades afiladas
Espiroquetas são microrganismos móveis, helicoidais, anaeróbios estritos e Gram –   são categorizadas baseado no diâmetro celular (pequeno,médio e grande); todas as espiroquetas cultivadas da cavidade bucal são do gênero  Treponema 30% nas lesões de GN com evidências de invasão tecidual
PRINCIPAIS FATORES DE VIRULÊNCIA DOS ORGANISMOS PERIODONTOPATOGÊNICOS
Propriedades que permitem uma espécie bacteriana colonizar um órgão alvo, defendido pelo hospedeiro, causando dano tecidual. Socransky e Haffajee (1991) Fatores de Virulência
ENZIMAS DE AGRESSÃO DIRETA PROTEASES colagenases (Pg, Pi, Aa, Td) ação semelhante à tripsina (P, Bf,Td) aminopeptidases (C, Pg) gelatinases (Pg, Pi)
FOSFOLIPASE A precursores da prostaglandina (Pg, Pi) FOSFATASE ALCALINA E ÁCIDA (Pg, Pi, C, Aa) PRODUTOS TÓXICOS EPITELIOTOXINA (Pg, Pi, Aa, C)
Fator inibidor da proliferação de fibroblastos suprime síntese de DNA e RNA dos fibroblastos (Pg, Pi, C, Aa, Td) Toxina de distensão citoletal efeito tóxico sobre os fibroblastos e células epiteliais (algumas cepas - Aa) Endotoxinas - LPS
Toxina indutora de reabsorção óssea (microvesículas de Aa) Butirato e Propionato – substâncias tóxicas Catabólitos de Proteólise substâncias fétidas – indol, NH 3  e compostos sulfurosos voláteis – aumentam a permeabilidade das mucosas e reduzem a síntese protéica (Pg, Pi)
Fatores de evasão das defesas do hospedeiro Fibrinolisina – invasão (Pg, Pi, Td) Inibição da atividade de LPMNs substâncias que competem com as quimiotáticas / bloqueio dos receptores de LPMNs (Pg, Pi, C, Aa, Td) Leucotoxina (Aa)
Componentes antifagocitários de superfície ligação de LPMNs (Pg, Aa) Resistência a digestão intracelular superoxidodismutase (Pg, Pi) catalase (Aa) Proteases para IgA e IgG (Pg, Pi, Bf, Aa, TD) Resistência às ações opsonizante e lítica do sistema C proteases para C3b e C5b (Pg)
Fatores de virulência das  Porphyromonas gingivalis   hematoglutinina Células endoteliais e musculares lisas da artéria coronária humana Progulske-Fox et al. (1999)
Postulados de Koch p/ especificidade bacteriana (clássico): o agente (bactéria) deve ser isolado em todos os casos da doença; culturas puras da bactéria causadora da doença podem ser obtidas; quando inoculada em animais experimentais, a bactéria causa a doença; a bactéria deve ser isolada dos tecidos doentes do animal experimental.
Socransky (1977) presença de patógenos putativos nas lesões periodontais e em concentrações elevadas comparados também c/ a ausência da bactérias ou a presença em concentrações muito menores em indivíduos saudáveis; pacientes infectados c/ esses patógenos periodontais, freqüente/ desenvolvem altos níveis de anticorpos no soro, saliva e fluido gengival e podem também desenvolver uma resposta imune.
Socransky (1977) essas bactérias podem muitas vezes demonstrar  in   vivo ,  produção de fatores de virulência que podem ser correlacionados  c/ a histopatologia clínica; a implantação experimental da bactéria em um modelo animal deve conduzir pelo menos a algumas características que ocorrem naturalmente com o aparecimento da doença periodontal; tratamento clínico que elimina essas bactérias das lesões periodontais devem resultar em melhora nos sinais clínicos da doença.
Complexidade da microbiota Dificuldades na coleta: 1. Atividade de doença no sítio selecionado 2. Representatividade do material coletado 3. Diâmetro do sulco gengival Dificuldades no cultivo e caracterização bacteriana.
Diluições VMGAIII 0,5ml 10 -1 0,5ml 10 -2 0,5ml 10 -3 0,5ml 10 -4
Semeadura em Meio Seletivo 10 -2 pura 100  L 100  L
Incubação
Biofilmes O’ TOOLE, G. et alli. Biofilms formation as microbial development.  Annu. Ver. Microbiol., 54:49-79 2000 KOLENBRANDER, P. Oral Microbial Communities: Biofims, interactions, and Genetic Systems  Annu. Rev. Microbiol., 54:413-37 2000 STOODLEY, P. et alli.  Biofilms as complex differentiaied communities  Ann. Rev. Microbiol., 56:1877-209 2002

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B I O F I L M E S B U C A I S

  • 2. Page e Korman (1997) DESAFIO MICROBIANO RESPOSTA IMUNO-INFLAMATÓRIA METABOLISMO DO TECIDO ÓSSEO E CONJUNTIVO Fatores de Risco Ambientais e Adquiridos Fatores de Risco Genéticos SINAIS CLÍNICOS DA DOENÇA PROGRESSÃO
  • 3. TOLERÂNCIA AO O 2 Aeróbias: bactérias crescem muito bem em atmosfera normal; Microaerófilas: bactérias crescem melhor em atmosfera de O 2 reduzido; Anaeróbias: crescimento na ausência de O 2 ; Anaeróbicas facultativas: crescem tanto em ambiente anaeróbio quanto aeróbio; Capnofílicas: bactérias crescem em ambiente com ótimas concentrações de CO 2 .
  • 4. ECOLOGIA BUCAL estuda a relação entre a microbiota e a cavidade bucal (competição pela sobrevivência) desequilíbrio ecológico doença infecciosa
  • 5. OBJETIVOS estudo dos mecanismos de implantação e de colonização bacteriana; estudo das influências da microbiota bucal sobre o hospedeiro; estudo das relações bióticas entre os diversos componentes da microbiota bucal; estudo das influências do meio ambiente bucal sobre a microbiota.
  • 6. ECOSSISTEMA BUCAL epitélio bucal; dorso lingual; superfície dentária supragengival; região subgengival; saliva.
  • 7. ECOSSISTEMA BUCAL dorso da língua região supragengival
  • 8. MICROBIOTA BUCAL Podemos observar: 500 espécies de bactérias; 1 indivíduo -150 espécies 750 milhões de bactérias/ml de saliva; 160 bilhões de bactérias/g de material do sulco gengival; 200 bilhões de bactérias/g de biofilme.
  • 9. Estágios ecológicos no estabelecimento da comunidade microbiana transmissão (número de bactérias e freqüência) aquisição espécies pioneiras ( S. salivarius – bacteriocinas ) ( S. oralis e S. sanguis / adesinas) sucessão aumento da diversidade microbiana comunidade clímax
  • 10. MICROBIOTA BUCAL MICROBIOTA autóctone espécies >1% (sítio particular) MICROBIOTA suplementar espécies < 1% Lactobacillus (10 -5 – 10 -3 / microbiota viável) e S. mutans MICROBIOTA transitória Loesche (1994)
  • 12. Fatores que influenciam a aquisição ou que interferem no equilíbrio da microbiota bucal.
  • 14. Tensões de O 2 na cavidade bucal meio ambiente 21% (160mmHg) cavidade bucal 12 – 14% bolsa periodontal 1 – 2%
  • 15. Potencial de Óxido-Redução (Eh) reflete a quantidade de oxigênio Eh da saliva = +200mV
  • 16. “ O sucesso universal dos anaeróbios nas membranas mucosas indica que esta relação é tão estável que deve ser considerada uma relação simbiótica.” Loesche (1994)
  • 17. temperatura - 36°C – 36,5°C influencia na atividade enzimática, pH, solubilidade, crescimento; pH ( saliva) = 6,25 - 7,25;
  • 18. SALIVA fluxo salivar; fatores agregantes - proteínas Ac; capacidade tampão; atividade antimicrobiana.
  • 19. Aderência ou Adesão aderência às superfícies bucais – mucosa e dentes – S. salivarius – S. sanguis ; aderência interbacteriana – coagregação / coadesão.
  • 20. Fluido Gengival atividade mecânica atividade microbiana
  • 21. Descamação Epitelial Fatores Sistêmicos do Hospedeiro Higiene Bucal Uso de Antimicrobianos
  • 23. composição química consistência física freqüência
  • 24. SALIVA glicoproteínas sais inorgânicos aminoácidos vitaminas glicose neuraminidase ácido siálico
  • 25. FLUIDO GENGIVAL exsudato sérico aminoácidos livres glicose vitaminas
  • 26. CONSIDERAÇÕES HISTÓRICAS Leeuwenhoek, 1683 animálculos Facinus pequenas formas de vida Black placa microbiana gelatinosa Gibbons, 1970 conceito da aderência específica
  • 27. Até a década de 60: etiologia obscura - cálculo dentário como fator irritante; Estudos pioneiros da microbiota subgengival (Mac Donald et al. , 1960; Socransky et al , 1963); Estudos pioneiros da etiologia infecciosa (Jordan & Keyes, 1964; Keyes & Jordan, 1964; Löe et al ., 1965; Theilade et al ., 1966). Década de 70 - consenso da etiologia infecciosa (Genco et al .,1969; Ellison, 1970; Keyes, 1970; Socransky, 1970).
  • 28. Placa (biofilme) bacteriana (o) 1,7 X 10 11 por grama de peso seco Socransky et al . (1963)
  • 29. POTENCIAL PATOGÊNICO DO BIOFILME hipótese do biofilme não-específico hipótese do biofilme específico
  • 31. MATÉRIA ALBA microrganismos células epiteliais descamadas restos alimentares componentes salivares
  • 32. IMPORTÂNCIA CLÍNICA Estudos Epidemiológicos; Animais Germ free – sinais de DP; Gengivite Experimental (Löe et al., 1965; Theilade et al., 1966); Periodontite Experimental (Lindhe, 1976); Estudos Longitudinais.
  • 33. BIOFILME DENTÁRIO Agregado estruturado e não calcificado de microrganismos contíguos em matriz orgânica, constituída por polímeros bacterianos e por substâncias da saliva e da dieta do hospedeiro.
  • 34. BIOFILMES BUCAIS (Darveau et al., 1977) comunidades ecológicas de bactérias desenvolvidas p/ permitir a sobrevivência da comunidade; exibe cooperatividade metabólica; sistema circulatório primitivo; numerosos microambientes com diferentes pHs, tensão de oxigênio, potencial elétrico; comportamento total/ diferente do que em culturas planctônicas,
  • 35. BIOFILMES BUCAIS Mais de 65 novas proteínas interligadas entre si; Resistentes a resposta imuno-inflamatória; PMNs não podem c/ agregados superiores a 5 bactérias; Concentração de antibióticos superior 1500X; Anticorpos são efetivos dentro de um campo elétrico.
  • 36. Biofilme Supragengival Biofilme Subgengival associado ao dente associado ao epitélio associado ao conjuntivo microbiota móvel intra-sucular
  • 37. FORMAÇÃO DO BIOFILME DENTÁRIO SUPRAGENGIVAL
  • 38. PELÍCULA ADQUIRIDA espessura 0,01µm - 1µm grupamentos sulfatos e carboxila orientados para saliva COMPOSIÇÃO QUÍMICA proteínas (albumina), lisozima, lactoferrina, amilase, IgA, IgG, fosfolipídios, glicoproteínas
  • 39. PELÍCULA ADQUIRIDA FUNÇÕES BIOLÓGICAS proteção da superfície do esmalte confere permeabilidade seletiva ao esmalte interfere na aderência dos microrganismos à superfície dentária nutre e serve de substrato p/ os microrganismos
  • 40. BIOFILME DENTÁRIO FASE DE COLONIZAÇÃO INICIAL (DE 0 A 8 HORAS) MECANISMOS DE ADESÃO E ESTRUTURAÇÃO
  • 41. superfície dentária Streptococcus mutans S. sanguis Lactobacillus A. viscosus dorso da língua S. salivarius A. naeslundii
  • 42. FORMAÇÃO DO BIOFILME fase reversível adsorção de bactérias livres S.sanguis; A.viscosus; S. mitis ; adesão bacteriana à superfície dentária
  • 43. fase irreversível interações hidrofóbicas (LTA) ( S. sanguis, A. viscosus, A. naeslundii, S. mutans ) lecitina (fibrila) X carboidrato (receptor) ( S. sanguis, S. oralis ) especificidade à galactose e ao ácido siálico interações eletrostáticas – Ca ++ salivar ( S. mutans ) interação envolvendo IgAs ( S. sanguis )
  • 44. interação c/ proteínas salivares ricas em prolina ( A. viscosus, S. mutans ) interações com amilase ( S. gordonii ) interação c/ proteína salivar submandibular e sublingual ( S. mutans ) interações com glicosiltransferase e glucanos ( S. mutans, S. sobrinus ) (Rölla et al ., 1984)
  • 45. FASE DE CRESCIMENTO RÁPIDO (DE 4 A 48 HORAS) predominam mecanismos de aderência interbacteriana
  • 46. MATRIZ INTERMICROBIANA 25% do volume do Biofilme
  • 47. por meio de polissacarídeos ( S. mutans, sanguis, mitis, salivarius e Lactobacillus ) por meio de constituintes da saliva e do fluido gengival ( S. sanguis, S. oralis, A. naeslundii )
  • 48. PEC S. mutans enzima invertase s a c a r o s e glicosiltransferase / frutosiltransferase polímero de glicose (glucan binding proteins – GBP) glucanos (mutano e dextrano) levano (frutano)
  • 49.  
  • 51. Veillonella e Neisseria fermentadoras de ácido láctico modifica o pH final do biofilme
  • 52. por meio de constituintes de superfície de bactérias de diferentes espécies ( A. viscosus ou A. naeslundii e Estreptococos orais) ( S. sanguis e S. oralis e F. nucleatum ) ( S. sanguis e P. gingivalis ) ( Capnocytophaga gingivalis e A. israelli ) ( C. ochracea e A. naeslundii ) ( Prevotella loeschei e S. oralis )
  • 53. FASE DE REMODELAÇÃO produtos extracelulares reações de co-agregação ecologia da placa mudanças na dieta (ingestação de sacarose) oxigênio no ambiente interações nutricionais produção de bacteriocinas
  • 54. O 2 Carboidratos Saliva Streptococcus / Actinomyces Lactato Acetato Formiato
  • 55.
  • 56. Lactato Veilonella Acetato Formiato H 2 Menadiona Campylobacter Pi / Pg
  • 57. tiamina, putrescina, isobutirato Formato Fusobacterium / Eubacterium Bacteroides / Micromonas Co 2 Aa, Capnocytophaga , Ec
  • 58. SAÚDE PERIODONTAL Células bacterianas aderentes, predomínio de cocos Gram-positivos; Baixo número de Gram-negativos; Ausência de Espiroquetas; Ausência de bactérias com flagelos. Listgarten, 1976
  • 59. FORMAÇÃO DO BIOFILME DENTÁRIO SUBGENGIVAL
  • 60. Cemento Radicular Capnocytophaga sp. Células Epiteliais Eikenella corrodens
  • 61. BIOFILME DENTÁRIO SUBGENGIVAL associado ao dente formação do cálculo cáries radiculares
  • 62. BIOFILME DENTÁRIO SUBGENGIVAL associado ao epitélio bastonetes e cocos G- bactérias flageladas espiroquetas
  • 63. BIOFILME DENTÁRIO SUBGENGIVAL associado ao conjuntivo GN / PJL
  • 64. Espiroquetas - GUNA (Listgarten, 1965) Espiroquetas e bastonetes fusiformes - epitélio gengival vital (Listgarten, 1965; Heylings, 1967) Bastonetes; filamentosos; cocos – espaços intercelulares e epiteliais da bolsa periodontal (Frank & Voegel, 1978; Frank, 1980) Invasão Bacteriana
  • 65. Cocos; bastonetes; filamentosos; espiroquetas – epitélio das bolsas periodontais profundas. Aa.; C. sputigena ; Mycoplasma; Espiroquetas - PJL (Saglie, 1982) Invasão X translocação - gengivite induzida em ratos (Sanavi et al . - 1985) Invasão bacteriana gengival - sítios recorrentes (Pertuiset et al . - 1987) Invasão Bacteriana
  • 66. Infecções periodontais: crescimento de bactérias comensais ou transmissão de bactérias ? Transmissão de Aa e Pg: membros da família (Petit et al. , 1993; Alaluusua et al ., 1993; Di Rienzo et al ., 1990). Transmissão de Aa e Pg: casais (Saarela et al ., 1993; Van Stenhbergen et al ., 1993). Ausência de evidências de transmissão de Aa: famílias com - PJL (Tinoco et al ., 1998). Ausência de evidência de transmissão de Pg: população (Indonésia) (Van Winkelhoff et al ., 1996).
  • 67. Principais Bactérias Bucais G+ Staphylococcus – cocos, anaeróbios facultativos, S. aureus e S. epidermidis - saliva e biofilme supra e subgengival; Streptococcus – cocos, anaeróbios facultativos, metabolismo predominante/ fermentativo, gênero predominante na cavidade bucal. S. oralis – bactéria pioneira na formação do biofilme, IgA1-protease, produz PEC a partir de sacarose;
  • 68. Principais Bactérias Bucais G+ S. mutans – alta/ acidogênico e acidúrico, sua colonização e sua cariogenicidade são principal/ determinadas pela produção de PEC, que esta diretamente relacionada à ingestão de sacarose, isolado de casos de endocardite; S. salivarius : colonizador inicial da cavidade bucal, alta afinidade de ligação às células epiteliais bucais, língua e saliva; S. vestibularis : coloniza mucosa, não produz PEC.
  • 69. Principais Bactérias Bucais G+ S. sanguis – espécie predominante no biofilme, parece ser adaptado à colonização de superfícies lisas, produz H 2 O 2 , , papel protetor nas doenças periodontais, produz IgA1- protease e PEC, tem sido isolado de casos de endocardite;
  • 70. Principais Bactérias Bucais G+ Lactobacillus - bacilos regulares, anaeróbios facultativos, metabolismo oxidativo e fermentativo, acidúricos, crescimento ótimo em anaerobiose, mas se desenvolvem bem em 5-10% CO 2 ; encontrados na saliva, cavidades de cárie e biofilme dentário cariogênico;
  • 71. Principais Bactérias Bucais G+ Actinomyces – bacilos irregulares curtos ou longos, anaeróbios facultativos, biofilme dentário supra e subgengival; A. israelli – é o principal causador de actinomicose, e é a espécie de Actinomyces dominante no biofilme dentário maduro; A. viscosus - associado a gengivite e presente em alta prevalência no biofilme dentário; A. odontolyticus – habitat principal é o cálculo dentário, placa dentária e cavidades profundas de cárie.
  • 72. Principais Bactérias Bucais G- Veillonella – cocos pequenos, anaeróbios estritos, não fermentam carboidratos, utilizam principal/ piruvato e lactato, produzindo acetato, propionato, CO 2 , H 2 , assim, reduz o potencial cariogênico do biofilme dentário, não são consideradas patogênicas;
  • 73. Principais Bactérias Bucais G- Actinobacillus actinomycetemcomitans é anaeróbio facultativo, imóvel, bacilo pequenos, retos ou encurvados, possuem vesículas de membrana, com vários sorotipos; sorotipos mais comuns: periodontite do adulto - a PJL – b (Aa 97% EUA, 50% São Paulo – Genco et al. , 1986)
  • 74. Porphyromonas gingivalis anaeróbio estrito, Gram -, imóvel, cocobacilo, assacarolítico
  • 75. Prevotella espécies Prevotella intermedia - bacilos curtos, sacarolíticos, pigmentados em negro ou não anaeróbios estritos Bacteroides espécies B. forsythus (T. forsythensis)– sacarolíticos, não pigmentados, bacilos com extremidades afiladas
  • 76. Espiroquetas são microrganismos móveis, helicoidais, anaeróbios estritos e Gram – são categorizadas baseado no diâmetro celular (pequeno,médio e grande); todas as espiroquetas cultivadas da cavidade bucal são do gênero Treponema 30% nas lesões de GN com evidências de invasão tecidual
  • 77. PRINCIPAIS FATORES DE VIRULÊNCIA DOS ORGANISMOS PERIODONTOPATOGÊNICOS
  • 78. Propriedades que permitem uma espécie bacteriana colonizar um órgão alvo, defendido pelo hospedeiro, causando dano tecidual. Socransky e Haffajee (1991) Fatores de Virulência
  • 79. ENZIMAS DE AGRESSÃO DIRETA PROTEASES colagenases (Pg, Pi, Aa, Td) ação semelhante à tripsina (P, Bf,Td) aminopeptidases (C, Pg) gelatinases (Pg, Pi)
  • 80. FOSFOLIPASE A precursores da prostaglandina (Pg, Pi) FOSFATASE ALCALINA E ÁCIDA (Pg, Pi, C, Aa) PRODUTOS TÓXICOS EPITELIOTOXINA (Pg, Pi, Aa, C)
  • 81. Fator inibidor da proliferação de fibroblastos suprime síntese de DNA e RNA dos fibroblastos (Pg, Pi, C, Aa, Td) Toxina de distensão citoletal efeito tóxico sobre os fibroblastos e células epiteliais (algumas cepas - Aa) Endotoxinas - LPS
  • 82. Toxina indutora de reabsorção óssea (microvesículas de Aa) Butirato e Propionato – substâncias tóxicas Catabólitos de Proteólise substâncias fétidas – indol, NH 3 e compostos sulfurosos voláteis – aumentam a permeabilidade das mucosas e reduzem a síntese protéica (Pg, Pi)
  • 83. Fatores de evasão das defesas do hospedeiro Fibrinolisina – invasão (Pg, Pi, Td) Inibição da atividade de LPMNs substâncias que competem com as quimiotáticas / bloqueio dos receptores de LPMNs (Pg, Pi, C, Aa, Td) Leucotoxina (Aa)
  • 84. Componentes antifagocitários de superfície ligação de LPMNs (Pg, Aa) Resistência a digestão intracelular superoxidodismutase (Pg, Pi) catalase (Aa) Proteases para IgA e IgG (Pg, Pi, Bf, Aa, TD) Resistência às ações opsonizante e lítica do sistema C proteases para C3b e C5b (Pg)
  • 85. Fatores de virulência das Porphyromonas gingivalis hematoglutinina Células endoteliais e musculares lisas da artéria coronária humana Progulske-Fox et al. (1999)
  • 86. Postulados de Koch p/ especificidade bacteriana (clássico): o agente (bactéria) deve ser isolado em todos os casos da doença; culturas puras da bactéria causadora da doença podem ser obtidas; quando inoculada em animais experimentais, a bactéria causa a doença; a bactéria deve ser isolada dos tecidos doentes do animal experimental.
  • 87. Socransky (1977) presença de patógenos putativos nas lesões periodontais e em concentrações elevadas comparados também c/ a ausência da bactérias ou a presença em concentrações muito menores em indivíduos saudáveis; pacientes infectados c/ esses patógenos periodontais, freqüente/ desenvolvem altos níveis de anticorpos no soro, saliva e fluido gengival e podem também desenvolver uma resposta imune.
  • 88. Socransky (1977) essas bactérias podem muitas vezes demonstrar in vivo , produção de fatores de virulência que podem ser correlacionados c/ a histopatologia clínica; a implantação experimental da bactéria em um modelo animal deve conduzir pelo menos a algumas características que ocorrem naturalmente com o aparecimento da doença periodontal; tratamento clínico que elimina essas bactérias das lesões periodontais devem resultar em melhora nos sinais clínicos da doença.
  • 89. Complexidade da microbiota Dificuldades na coleta: 1. Atividade de doença no sítio selecionado 2. Representatividade do material coletado 3. Diâmetro do sulco gengival Dificuldades no cultivo e caracterização bacteriana.
  • 90. Diluições VMGAIII 0,5ml 10 -1 0,5ml 10 -2 0,5ml 10 -3 0,5ml 10 -4
  • 91. Semeadura em Meio Seletivo 10 -2 pura 100  L 100  L
  • 93. Biofilmes O’ TOOLE, G. et alli. Biofilms formation as microbial development. Annu. Ver. Microbiol., 54:49-79 2000 KOLENBRANDER, P. Oral Microbial Communities: Biofims, interactions, and Genetic Systems Annu. Rev. Microbiol., 54:413-37 2000 STOODLEY, P. et alli. Biofilms as complex differentiaied communities Ann. Rev. Microbiol., 56:1877-209 2002