Apresentação realizada como parte da programação do Curso de Atualização a Docentes - Região Sul, promovido pela Sociedade Brasileira de Nematologia (SBN).
Conteúdo:
- Preparo de lâminas permanentes de nematoides;
- Chaves de identificação de nematoides;
- Técnicas de coloração de nematoides no interior da raiz e de ovos e massas de ovos.
Universidade Empreendedora como uma Plataforma para o Bem comum
Métodos em Nematologia
1.
2. ESTRUTURAESTRUTURA
1. Preparo de Lâminas
a. Morte dos espécimes
b. Fixação dos espécimes
c. Montagem das lâminas
2. Chaves de identificação
a. Exemplos de chaves
b. Nematoides fitoparasitas
c. Nematoides bacteriófagos
d. Nematoides fungívoros
e. Nematoides onívoros
f. Nematoides carnívoros
3. Técnicas de coloração
a. Coloração de nematoides no interior das raízes
b. Coloração de massas de ovos
4. PREPARO DE LÂMINAS
1. MORTE DOS ESPÉCIMES
2. FIXAÇÃO DOS ESPÉCIMES
3. MONTAGEM DAS LÂMINAS
5. 1. MORTE DOS ESPÉCIMES
NUNCA FIXE NEMATOIDES VIVOS COM FIXADOR FRIO!
Para garantir uma boa qualidade da fixação, os nematoides devem
ser mortos instantaneamente, com o uso de fixador quente ou morte
por calor antes da adição de fixador
Transfira os nematoides vivos para um pequeno recipiente de vidro
e aguarde para que os nematoides se assentem no fundo;
Retire o excesso de água até que permaneça apenas cerca de 2mL
de água no tubo;
Recipiente em banho maria a
70 – 90°C;
20 – 30 segundos e
verificando sob microscópio
estereoscópico se os
nematoides estão imóveis e
alongados.
6. 2. FIXAÇÃO DOS ESPÉCIMES
SOLUÇÃO FORMALINA-GLICERINA
Solução fixadora FG (8% de formalina, 2% de glicerina em água
destilada);
Mate os espécimes e verifique em microscópio estereoscópico;
Adicione um volume equivalente de solução fixadora FG a 65 – 70°C;
Deixe o tubo descansando por 24 – 48 horas para permitir que o
fixador penetre e aja em todos os tecidos;
Em um pote com tampa, adicione etanol até uma cada de 5 – 10mm
no fundo;
Coloque uma pequena plataforma no fundo do pote de forma que a
superfície da plataforma fique acima do etanol;
Retire o máximo possível de fixador FG do tubo e insira o tubo sobre
a plataforma no interior do pote e feche o pote;
7. 2. FIXAÇÃO DOS ESPÉCIMES
SOLUÇÃO FORMALINA-GLICERINA
Deixe o pote por uma noite em incubador a 35 – 40°C a água da
suspensão com nematoides seja substituída por etanol;
Retire o tubo do pote e complete com uma solução EG (5% de
glicerina e 95% de etanol) até cerca de 5mm da parte superior do
tubo;
Deixe o tubo aberto em incubador a 35 – 40°C por 2 – 3 horas, para
evaporar cerca de metade do etanol (se necessário, cobrir
parcialmente o tubo para evitar evaporação completa);
Preencha novamente o tubo com a solução EG e deixe por mais 2-3
horas em incubador a 35 – 40°C;
Preencha mais uma vez o tubo com a solução EG e deixe no
incubador a 35- 40ºC por uma noite;
8. 2. FIXAÇÃO DOS ESPÉCIMES
SOLUÇÃO TAF
Solução fixadora TAF (8% formalina e 2% trietanolamina em água
destilada);
Mate os espécimes e verifique em microscópio estereoscópico;
Adicione um volume equivalente de solução fixadora TAF a 65 –
70°C;
Complete o tubo (até 5mm de completar totalmente) com uma
solução de 5% de glicerina em água destilada;
Coloque o tubo em um incubador a 35 – 40°C quase totalmente
coberto e deixe no incubador até que uma quantidade considerável de
água tenha evaporado;
Complete o tubo com a solução de glicerina 5% e deixe por pelo
menos 2 dias no incubador, até que toda a água tenha evaporado.
9. 3. MONTAGEM DAS LÂMINAS
Coloque uma pequena gota do fixador no centro de uma lâmina limpa;
Retire o(s) espécime(s) e coloque-o(s) na gota com fixador;
Posicione o espécime corretamente e retire o excesso de fixador,
caso necessário;
Cubra a amostra com lamínula e retire o excesso de fixador;
Feche utilizando base para unhas ou parafina.
11. Nematoda
Enoplea Chromadorea
Enoplia Dorylaimia Chromadoria
Enoplida Dorylaimida Rhabditida
Triplonchida Mermithida Plectida
Mononchida Araeolaimida
Dioctophymatida Monhysterida
Trichinellida Desmodorida
Isolaimida Desmoscolecida
Muspiceida Chromadorida
Marimerthida
CLASSIFICAÇÃO ATUAL DOS NEMATOIDES
classe (ea)
subclasse (ia)
ordem (ida)
subordem (ina)
superfamilia (oidea)
familia (idae)
subfamilia (inae)
Fonte: De Ley & Blaxter, 2002; NEMAPLEX
Enoplida
Ambientes marinhos/ água doce ou
terrestres alagados
Carnívoros, bacteriófagos e algívoros.Triplonchida
Água doce e ambientes terrestres,
alguns marinhos.
Carnívoros, bacteriófagos, fungívoros
algívoros e fitoparasitas.
Dorylaimida
Água doce e ambientes terrestres,
alguns marinhos.
Carnívoros, fungívoros, algívoros e
fitoparasitas.
Mononchida
Ambientes terrestres a sedimentos de
água doce.
Carnívoros
Isolaimida
Ambientes terrestres.
Bacteriófagos.
Rhabditida
Parasitas de plantas e animais,
bacteriófagos e fungívoros.
Solo e água doce.
Plectida
Solo, marihos e água doce.
Bacteriófagos e predadores de
organismos unicelulares.
Araeolaimida
Marinhos e de mangues.
Muitos são bacteriófagos e alguns
algívoros.
Monhysterida
Marinhos, de mangues, água doce e
solo.
Bacteriófagos, algívoros e outros
organismos unicelulares.
.
Desmodorida
Maioria marinhos, poucos em
mangues e água doce.
Bacteriófagos ou se alimentam de
diatomáceas e eucariotos
unicelulares.
Desmoscolecida
Tipicamente marinhos, poucos de
água doce ou solos.
Bacteriófagos ou se alimentam de
diatomáceas e eucariotos
unicelulares.
Chromadorida
Maioria marinhos e de água doce,
alguns de solos.
Bacteriófagos ou se alimentam de
diatomáceas e eucariotos
unicelulares.
.
12. Nematoda
Enoplea Chromadorea
Enoplia Dorylaimia Chromadoria
Enoplida Dorylaimida Rhabditida
Triplonchida Mermithida Plectida
Mononchida Araeolaimida
Dioctophymatida Monhysterida
Trichinellida Desmodorida
Isolaimida Desmoscolecida
Muspiceida Chromadorida
Marimerthida
CLASSIFICAÇÃO ATUAL DOS NEMATOIDES
Fonte: De Ley & Blaxter, 2002; NEMAPLEX
Enoplea: Esôfafo cilíndrico ou “bottle-shaped”
Chromadorea: Esôfago dividido em bulbos
13. Configuração do esôfago
Enoplea Chromadorea
cardia
istmo
intestino
odontoestilete cavidade
buccal
setas
dente
estilete
procorpo
região basal
procorpo
bulbo
mediano
Região
basal
46. CHAVES DE IDENTIFICAÇÃO
Nematoda:
http://plpnemweb.ucdavis.edu/nemaplex/Taxadata/Nemata.htm
Ordens:
http://plpnemweb.ucdavis.edu/nemaplex/Taxadata/orderkeynew.htm
Ordem Dorylaimida - Jairajpuri e Ahmad (1992)
http://plpnemweb.ucdavis.edu/nemaplex/Taxadata/DorylaimidaKey.htm
Ordem Dorylaimida - Andrássy (2009):
http://plpnemweb.ucdavis.edu/nemaplex/Taxadata/Dorylaimida%20Andrassy%202009.html
Famílias e subfamílias de fitoparasitas – Ferris e Bongers (2011):
http://plpnemweb.ucdavis.edu/nemaplex/Taxadata/Famkey.htm
Família Tylenchidae - Geraert (2008):
http://plpnemweb.ucdavis.edu/nemaplex/Taxadata/Tylenchidaekey2008.htm
Família Criconematidae - Andrássy (2007):
http://plpnemweb.ucdavis.edu/nemaplex/Plntpara/Criconematoidea%20and
%20Criconematidae.html
Gêneros de fitoparasitas:
http://plpnemweb.ucdavis.edu/nemaplex/Plntpara/KeyGenPltFdrsn.htm
Fonte: NEMAPLEX
47. CHAVES DE IDENTIFICAÇÃO
Gêneros de fitoparasitas importantes Mekete et al. (2012):
http://plpnemweb.ucdavis.edu/nemaplex/Plntpara/KeyGenPltFdrsn.htm
Gêneros de fitoparasitas no Brasil – Ferraz (2012):
nematologia.com.br/wp-content/uploads/2013/07/nemkeymex.pdf
Espécies de Pratylenchus – Gonzaga, Santos e Soares (2012):
nematologia.com.br/wp-content/uploads/2012/08/chavigo.pdf
49. COLORAÇÃO DE NEMATOIDES
COLORAÇÃO DE NEMATOIDES COM FUCSINA ÁCIDA - Byrd et
al., 1983
Lave e corte as raízes em seções menores;
Coloque as raízes em um solução de hipoclorito de sódio por 4 a 6
minutos em solução de hipoclorito de sódio (em 50mL de água) para
clarear as raízes;
10mL de NaOCl a 5,25% para raízes jovens;
20mL de NaOCl a 5,25% para raízes de idade moderada;
30 mL de NaOCl a 5,25% para raízes velhar ou lignificadas.
Deixe por 3 – 5 minutos, mexendo a amostra;
Lave e deixe em repouso em água por 15 minutos;
Transfira as raízes para 30 – 50mL de água;
Coloque 1mL da solução de ficsina ácida (3.5 g fucsina ácida, 250
mL de ácido acético e 750 mL de água) e deixe ferver por 30
segundos – 1 minuto.
50. COLORAÇÃO DE NEMATOIDES
COLORAÇÃO DE NEMATOIDES COM FUCSINA ÁCIDA - Byrd et
al., 1983
Esfrie em temperatura ambiente;
Seque as raízes;
Cubra as raízes com glicerina e HCl 5N;
Corte as raízes e monte as lâminas;
53. COLORAÇÃO DE NEMATOIDES
COLORAÇÃO DE MASSAS DE OVOS COM FLOXINA B - Taylor &
Sasser, 1978
Lave as raízes cuidadosamente em água parada em um recipiente;
Coloque as raízes em solução de floxina B a 0,0015% por 15-20
minutos;
Seque as raízes.