Métodos em Nematologia

ESTRUTURAESTRUTURA
1. Preparo de Lâminas
a. Morte dos espécimes
b. Fixação dos espécimes
c. Montagem das lâminas
2. Chaves de identificação
a. Exemplos de chaves
b. Nematoides fitoparasitas
c. Nematoides bacteriófagos
d. Nematoides fungívoros
e. Nematoides onívoros
f. Nematoides carnívoros
3. Técnicas de coloração
a. Coloração de nematoides no interior das raízes
b. Coloração de massas de ovos

PREPARO DE LÂMINASPREPARO DE LÂMINAS

PREPARO DE LÂMINAS
1. MORTE DOS ESPÉCIMES
2. FIXAÇÃO DOS ESPÉCIMES
3. MONTAGEM DAS LÂMINAS

1. MORTE DOS ESPÉCIMES
NUNCA FIXE NEMATOIDES VIVOS COM FIXADOR FRIO!
 Para garantir uma boa qualidade da fixação, os nematoides devem
ser mortos instantaneamente, com o uso de fixador quente ou morte
por calor antes da adição de fixador
 Transfira os nematoides vivos para um pequeno recipiente de vidro
e aguarde para que os nematoides se assentem no fundo;
 Retire o excesso de água até que permaneça apenas cerca de 2mL
de água no tubo;
 Recipiente em banho maria a
70 – 90°C;
 20 – 30 segundos e
verificando sob microscópio
estereoscópico se os
nematoides estão imóveis e
alongados.

SOLUÇÃO FORMALINA-GLICERINA
 Solução fixadora FG (8% de formalina, 2% de glicerina em água
destilada);
 Mate os espécimes e verifique em microscópio estereoscópico;
 Adicione um volume equivalente de solução fixadora FG a 65 – 70°C;
 Deixe o tubo descansando por 24 – 48 horas para permitir que o
fixador penetre e aja em todos os tecidos;
 Em um pote com tampa, adicione etanol até uma cada de 5 – 10mm
no fundo;
 Coloque uma pequena plataforma no fundo do pote de forma que a
superfície da plataforma fique acima do etanol;
 Retire o máximo possível de fixador FG do tubo e insira o tubo sobre
a plataforma no interior do pote e feche o pote;

SOLUÇÃO FORMALINA-GLICERINA
 Deixe o pote por uma noite em incubador a 35 – 40°C  a água da
suspensão com nematoides seja substituída por etanol;
 Retire o tubo do pote e complete com uma solução EG (5% de
glicerina e 95% de etanol) até cerca de 5mm da parte superior do
tubo;
 Deixe o tubo aberto em incubador a 35 – 40°C por 2 – 3 horas, para
evaporar cerca de metade do etanol (se necessário, cobrir
parcialmente o tubo para evitar evaporação completa);
 Preencha novamente o tubo com a solução EG e deixe por mais 2-3
horas em incubador a 35 – 40°C;
 Preencha mais uma vez o tubo com a solução EG e deixe no
incubador a 35- 40ºC por uma noite;

SOLUÇÃO TAF
 Solução fixadora TAF (8% formalina e 2% trietanolamina em água
destilada);
 Mate os espécimes e verifique em microscópio estereoscópico;
 Adicione um volume equivalente de solução fixadora TAF a 65 –
70°C;
 Complete o tubo (até 5mm de completar totalmente) com uma
solução de 5% de glicerina em água destilada;
 Coloque o tubo em um incubador a 35 – 40°C quase totalmente
coberto e deixe no incubador até que uma quantidade considerável de
água tenha evaporado;
 Complete o tubo com a solução de glicerina 5% e deixe por pelo
menos 2 dias no incubador, até que toda a água tenha evaporado.

3. MONTAGEM DAS LÂMINAS
 Coloque uma pequena gota do fixador no centro de uma lâmina limpa;
 Retire o(s) espécime(s) e coloque-o(s) na gota com fixador;
 Posicione o espécime corretamente e retire o excesso de fixador,
caso necessário;
 Cubra a amostra com lamínula e retire o excesso de fixador;
 Feche utilizando base para unhas ou parafina.

CHAVES DE IDENTIFICAÇÃOCHAVES DE IDENTIFICAÇÃO

Nematoda
Enoplea Chromadorea
Enoplia Dorylaimia Chromadoria
Enoplida Dorylaimida Rhabditida
Triplonchida Mermithida Plectida
Mononchida Araeolaimida
Dioctophymatida Monhysterida
Trichinellida Desmodorida
Isolaimida Desmoscolecida
Muspiceida Chromadorida
Marimerthida
CLASSIFICAÇÃO ATUAL DOS NEMATOIDES
classe (ea)
subclasse (ia)
ordem (ida)
subordem (ina)
superfamilia (oidea)
familia (idae)
subfamilia (inae)
Fonte: De Ley & Blaxter, 2002; NEMAPLEX
Enoplida
Ambientes marinhos/ água doce ou
terrestres alagados
Carnívoros, bacteriófagos e algívoros.Triplonchida
Água doce e ambientes terrestres,
alguns marinhos.
Carnívoros, bacteriófagos, fungívoros
algívoros e fitoparasitas.
Dorylaimida
Água doce e ambientes terrestres,
alguns marinhos.
Carnívoros, fungívoros, algívoros e
fitoparasitas.
Mononchida
Ambientes terrestres a sedimentos de
água doce.
Carnívoros
Isolaimida
Ambientes terrestres.
Bacteriófagos.
Rhabditida
Parasitas de plantas e animais,
bacteriófagos e fungívoros.
Solo e água doce.
Plectida
Solo, marihos e água doce.
Bacteriófagos e predadores de
organismos unicelulares.
Araeolaimida
Marinhos e de mangues.
Muitos são bacteriófagos e alguns
algívoros.
Monhysterida
Marinhos, de mangues, água doce e
solo.
Bacteriófagos, algívoros e outros
organismos unicelulares.
.
Desmodorida
Maioria marinhos, poucos em
mangues e água doce.
Bacteriófagos ou se alimentam de
diatomáceas e eucariotos
unicelulares.
Desmoscolecida
Tipicamente marinhos, poucos de
água doce ou solos.
unicelulares.
Chromadorida
Maioria marinhos e de água doce,
alguns de solos.
unicelulares.
.

Nematoda
Enoplea Chromadorea
Marimerthida
CLASSIFICAÇÃO ATUAL DOS NEMATOIDES
 Enoplea: Esôfafo cilíndrico ou “bottle-shaped”
 Chromadorea: Esôfago dividido em bulbos

Configuração do esôfago
Enoplea Chromadorea
cardia
istmo
intestino
odontoestilete cavidade
buccal
setas
dente
estilete
procorpo
região basal
procorpo
bulbo
mediano
Região
basal

Enoplea
Enoplia Dorylaimia
Enoplida Triplonchida Dorylaimida Mononchida
Belbolla sp.
Mermithida
Trichinellida
Mermis sp.
Trichuris sp.

Chromadorea
Chromadoria
Chromadorida
Desmodorida
Monhysterida
Rhabditida

Dentes – móveis e imóveis
Enoplea
Chromadorea
cone
base
nódulos
estilete

NEMATOIDES FITOPARASITASNEMATOIDES FITOPARASITAS

Nematoda
Enoplea Chromadorea
Marimerthida
PRINCIPAIS FAMÍLIAS DE NEMATOIDES FITOPARASITAS
classe (ea)
subclasse (ia)
ordem (ida)
subordem (ina)
familia (idae)
subfamilia (inae)
Triplonchida
Trichodoridae
Dorylaimida
Longidoridae
Rhabditida
1. Aphelenchoididae,
Aphelenchidae
2. Criconematidae
3. Anguinidae, Dolichodoridae,
Heteroderidae, Hoplolaimidae,
Pratylenchidae, Tylenchidae

Estiletes diferentes
Que hábitos de alimentação
sugerem?

Estiletes estomatostílicos
(Rhabditida)
-Aphelenchoidea
-Tylenchoidea
-Criconematoidea
Estiletes odontostílicos
-Dorylaimida (desenho)
-Triplonchida

Ecdise de nematoide e estilete estomatostílico (Tylenchida)

Estilete Odontostílico curvado em Trichodoridae (Triplonchida)

Estilete odontostílico (Dorylaimida)

NEMATOIDES BACTERIÓFAGOSNEMATOIDES BACTERIÓFAGOS

Nematoda
Enoplea Chromadorea
Marimerthida
PRINCIPAIS FAMÍLIAS DE NEMATOIDES BACTERIÓFAGOS
classe (ea)
subclasse (ia)
ordem (ida)
subordem (ina)
familia (idae)
subfamilia (inae)
Rhabditida
Bunonematidae, Panagrolaimidae,
Rhabditidae, Cephalobidae.
Plectida
Plectidae, Teratocephalidae
Monhysterida
Monhysteridae
Chromadorida
Chomadoridae

Rhabditidae – Bacteriófagos - cp1 –Oportunista de enriquecimento
Rhabditida
Rhabditiidae

Panagrolaimus – Bacteriófago
cp1 – Oportunista de enriquecimento
Rhabditida
Panagrolaimidae Rhabditida
Cephalobidae
Acrobeloides – Bacteriófago
cp2 – oportunista geral

Metateratocephalus crassidens
Photo: Hanny van Megen
Monhystera sp.
Plectida
Teratocephalidae
Monhysterida
Monhysteridae
Rhabditida
Cephalobidae
Acrobeles sp.

Cephalobidae
Rhabditidae
Bacteriófagos: exemplos dos estomas e ornamentações na cabeça

Exemplos dos esôfagos
Bacteriófagos

NEMATOIDES FUNGÍVOROSNEMATOIDES FUNGÍVOROS

Nematoda
Enoplea Chromadorea
Marimerthida
PRINCIPAIS FAMÍLIAS DE NEMATOIDES FUNGÍVOROS
classe (ea)
subclasse (ia)
ordem (ida)
subordem (ina)
familia (idae)
subfamilia (inae)
Dorylaimida
Leptonchidae
Rhabditida
Aphelenchidae, Aphelenchoididae,
Neotylenchidae
Triplonchida
Diphtherophoridae

Fungivoros: exemplos de estiletes e esôfagos
Aphelenchoides
Aphelenchus
Tylencholaimellus
Anomyctus

NEMATOIDES ONÍVOROSNEMATOIDES ONÍVOROS

Nematoda
Enoplea Chromadorea
Marimerthida
PRINCIPAIS FAMÍLIAS DE NEMATOIDES ONÍVOROS
classe (ea)
subclasse (ia)
ordem (ida)
subordem (ina)
familia (idae)
subfamilia (inae)
Dorylaimida
Dorylaimidae, Nordiidae,
Thornenematidae

NEMATOIDES CARNÍVOROSNEMATOIDES CARNÍVOROS

Nematoda
Enoplea Chromadorea
Marimerthida
PRINCIPAIS FAMÍLIAS DE NEMATOIDES CARNÍVOROS
classe (ea)
subclasse (ia)
ordem (ida)
subordem (ina)
familia (idae)
subfamilia (inae)
Dorylaimida
Aporcelaimidae, Discolaimidae,
Nygolaimidae.
Mononchida
Mononchidae
Rhabditida
Tylenchidae

Mononchida
Dorylaimida
Diplogasteridae

Dorylaimus
Discolaimus

Odontopharynx
Seinura
Discolaimus
Labronema
Mononchida
Diplogasteridae
Dorylaimida
Tylenchida

Anatonchus
Photo: Roy Neilsen
Prionchulus
Mylonchulus
Mononchus

Choanolaimus psammophilus
ingested
prey nematode➙
Tripylina ixayocense
Photo: Ignacio Cid del Pradu
Mononchoides striatus
Rhabditida
Diplogasteridae
Enoplida
Tripylidae
Chromadorida
Choanolaimidae

Dorylaimida
Tylenchida
Mononchida
Diplogasterida

Mononchida
Algumas formas de estomas

CHAVES DE IDENTIFICAÇÃO
 Nematoda:
http://plpnemweb.ucdavis.edu/nemaplex/Taxadata/Nemata.htm
 Ordens:
http://plpnemweb.ucdavis.edu/nemaplex/Taxadata/orderkeynew.htm
 Ordem Dorylaimida - Jairajpuri e Ahmad (1992)
http://plpnemweb.ucdavis.edu/nemaplex/Taxadata/DorylaimidaKey.htm
 Ordem Dorylaimida - Andrássy (2009):
http://plpnemweb.ucdavis.edu/nemaplex/Taxadata/Dorylaimida%20Andrassy%202009.html
 Famílias e subfamílias de fitoparasitas – Ferris e Bongers (2011):
http://plpnemweb.ucdavis.edu/nemaplex/Taxadata/Famkey.htm
 Família Tylenchidae - Geraert (2008):
http://plpnemweb.ucdavis.edu/nemaplex/Taxadata/Tylenchidaekey2008.htm
 Família Criconematidae - Andrássy (2007):
http://plpnemweb.ucdavis.edu/nemaplex/Plntpara/Criconematoidea%20and
%20Criconematidae.html
 Gêneros de fitoparasitas:
http://plpnemweb.ucdavis.edu/nemaplex/Plntpara/KeyGenPltFdrsn.htm
Fonte: NEMAPLEX

CHAVES DE IDENTIFICAÇÃO
 Gêneros de fitoparasitas importantes Mekete et al. (2012):
http://plpnemweb.ucdavis.edu/nemaplex/Plntpara/KeyGenPltFdrsn.htm
 Gêneros de fitoparasitas no Brasil – Ferraz (2012):
nematologia.com.br/wp-content/uploads/2013/07/nemkeymex.pdf
 Espécies de Pratylenchus – Gonzaga, Santos e Soares (2012):
nematologia.com.br/wp-content/uploads/2012/08/chavigo.pdf

TÉCNICAS DE COLORAÇÃOTÉCNICAS DE COLORAÇÃO

COLORAÇÃO DE NEMATOIDES
COLORAÇÃO DE NEMATOIDES COM FUCSINA ÁCIDA - Byrd et
al., 1983
 Lave e corte as raízes em seções menores;
 Coloque as raízes em um solução de hipoclorito de sódio por 4 a 6
minutos em solução de hipoclorito de sódio (em 50mL de água) para
clarear as raízes;
 10mL de NaOCl a 5,25% para raízes jovens;
 20mL de NaOCl a 5,25% para raízes de idade moderada;
 30 mL de NaOCl a 5,25% para raízes velhar ou lignificadas.
 Deixe por 3 – 5 minutos, mexendo a amostra;
 Lave e deixe em repouso em água por 15 minutos;
 Transfira as raízes para 30 – 50mL de água;
 Coloque 1mL da solução de ficsina ácida (3.5 g fucsina ácida, 250
mL de ácido acético e 750 mL de água) e deixe ferver por 30
segundos – 1 minuto.

COLORAÇÃO DE NEMATOIDES COM FUCSINA ÁCIDA - Byrd et
al., 1983
 Esfrie em temperatura ambiente;
 Seque as raízes;
 Cubra as raízes com glicerina e HCl 5N;
 Corte as raízes e monte as lâminas;

COLORAÇÃO COM FUCSINA ÁCIDA - Byrd et al., 1983

COLORAÇÃO DE MASSAS DE OVOS COM FLOXINA B - Taylor &
Sasser, 1978
 Lave as raízes cuidadosamente em água parada em um recipiente;
 Coloque as raízes em solução de floxina B a 0,0015% por 15-20
minutos;
 Seque as raízes.

COLORAÇÃO DE MASSAS DE OVOS COM FLOXINA B - Taylor &
Sasser, 1978

PARA SABER MAIS:
DISPONÍVEIS PARA DOWNLOAD GRÁTIS NO SITE DA SBN
www.nematologia.com.br

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