Apresentação para o MAPA sobre o Qurentenário IAC

1. •
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Coleta
Intercâmbio
Quarentena
Identificação
Caracterização
Conservação
Educação
Valoração
Documentação
Uso

2. ATIVIDADES INERENTES À QUARENTENA
Quarentena
Manejo cultural
Introdução
em quarentena
Conservação
Remessa
Fiel depositário
Cultivo
Inspeção
Fitossanitária
in vitro
Inspeção
Detecção por
PCR
Plantas
daninhas

3. INFRA DO COMPLEXO IAC
QUARENTENÁRIO
Cultura
in vitro
Desinfecção
do solo
Casa de
vegetação
Expurgo
sementes
Câmara fria
sêca
Secretaria
intercâmbio
Secretaria
quarentena
Coordenação Intercâmbio e
quarentena
Sala de
abertura
ATIVIDADES DA COMISSÃO DE QUARENTENA DO IAC
Patologia de
sementes
Ácaros
Insetos
Fungos
In vitro
Sementes
daninhas
PCR
Vírus
Tese Elisa
Microscopia
Eletrônica
Plantas
Indicadoras
LABORATÓRIOS
Nematóides
Bactérias
SERVIÇOS

4. Viçosa
Bayer
ESTAÇÕES QUARENTENÁRIAS NO BRASIL

5. PARTE I
EQUIPE E ATIVIDADES

6. COMITÊ DE QUARENTENA DO IAC
•COORDENAÇÃO GERAL: Renato
Ferraz de Arruda Veiga e Christina
Dudienas

7. EQUIPE DO QUARENTENÁRIO IAC
•
• COORD.TÉC./SECRETARIA:
Miriam
Aparecida
Bonatto e Murilo do Canto Batista Alves
• CONTATO DFA / AMOSTRAGEM: Murilo do Canto
Batista Alves, Moacir Moises, Lucas Storer.

8. INSPEÇÃO QUARENTENÁRIA
• BACTÉRIAS: sintomatologia em plântulas, germinação em
papel toalha, meios seletivos e isolamento direto
(SCHAAD,1982);
• FUNGOS: exame direto, plaqueamento em meio de cultura e
papel filtro. Tratamentos consecutivos para limpeza
(NEEGARD, 1973 e 1978; TUITE, 1969);
• INSETOS: exame de presença de ovos, vestígios de ataque e
do próprio inseto vivo, em sala a prova de insetos;
• NEMATÓIDES: trituração, peneiramento em funil de
Baermann, bem como flutuação para extração de cistos
(JENKINS, 1964; BYRD et al.,1966).
• PLANTAS DANINHAS: exame visual de presença de
sementes e plantio para identificação taxonômica;
• VÍRUS: sintomatologia de plântulas, serologia, uso de plantas
indicadoras, microscópio eletrônico, cultura de meristema,
caracterização genética (KITAJIMA, 1965; OUTCHERLONY,
1968; HAMPTON et al., 1978).

9. 15-12-1988
• PORTARIA DG-15 – CRIA O SISTEMA
DE INTRODUÇÃO E QUARENTENA DE
PLANTAS E A COMISSÃO DE
QUARENTENA DE PLANTAS DO IAC

10. INSETOS
ESPECIALISTAS: André Luiz
Lourenção e Edson Possidônio
Teixeira
Em plantas vivas (enraizadas e material propagativo): o exame em
Em plantas vivas (enraizadas e material propagativo): o exame em
estereomicroscópio de folhas ou outras partes com sintomas, para exame em
estereomicroscópio de folhas ou outras partes com sintomas, para exame em
laboratório. Isolamento de material suspeito em gaiolas, placas de Petri ou outro
laboratório. Isolamento de material suspeito em gaiolas, placas de Petri ou outro
recipiente adequado até eclosão de larvas ou emergência de adultos.
recipiente adequado até eclosão de larvas ou emergência de adultos.
- Em sementes e grãos: exame sob microscópio estereoscópio e manutenção de
- Em sementes e grãos: exame sob microscópio estereoscópio e manutenção de
amostras em recipientes adequados para observação de possível emergência de
amostras em recipientes adequados para observação de possível emergência de
insetos, ácaros ou outros artrópodos.
insetos, ácaros ou outros artrópodos.
- Em substratos utilizados para plantio: exame direto sob microscópio
- Em substratos utilizados para plantio: exame direto sob microscópio
estereoscópio e manutenção de amostras em recipientes adequados para
estereoscópio e manutenção de amostras em recipientes adequados para
observação de possível emergência de insetos, ácaros ou outros artrópodos.
observação de possível emergência de insetos, ácaros ou outros artrópodos.
- A identificação taxonômica: o organismo detectado é preparado/conservado de
- A identificação taxonômica: o organismo detectado é preparado/conservado de
acordo com as técnicas preconizadas ao grupo ou ao estágio de desenvolvimento
acordo com as técnicas preconizadas ao grupo ou ao estágio de desenvolvimento
(larva, pupa, adulto etc) (Vanzolini & Papavero 1967; Pastrana 1985, Borror et al.
(larva, pupa, adulto etc) (Vanzolini & Papavero 1967; Pastrana 1985, Borror et al.
1992, Almeida et al. 1998) e a identificação, onde o organismo será enviado a
1992, Almeida et al. 1998) e a identificação, onde o organismo será enviado a
especialista do grupo para correta identificação.
especialista do grupo para correta identificação.

11. PLANTAS DANINHAS
Especialistas: Waldemir Peressin e Maria
do Carmo de Santos Soares Novo
• Exame através de estereomicroscópio, em amostras
tomadas de todos os recipientes (sacos, pacotes, caixas,
etc.) e colocadas em placas de vidro.
• Em caso de dúvidas quanto à presença de propágulos nas
amostras examinadas, o material é colocado para
germinar, em substratos adequados.
• Caso seja detectada a praga procede-se a sua
identificação taxonômica, através da forma, tamanho,
coloração, textura e a superfície do tegumento ou
pericarpo, assim como a presença ou ausência de aristas
das sementes.

12. MICOLOGIA
Especialistas: Christina Dudienas e João
José Dias Parisi
•
•
•
Identificação direta: planta hospedeira com sintomas (lesões) com esporos do
fungo quarentenário, realiza a identificação no estereomicroscópio ótico. Já se
for sem esporos do fungo quarentenário, colocar em câmara úmida,
constituída de caixa gerbox contendo papel de filtro umedecido com água
esterilizada, incubado por 24-48 h
O isolamento em meio de cultura: isolar o fungo da planta hospedeira,
obtendo-se assim uma cultura do mesmo para identificação (apenas
patógenos não obrigados), efetua-se o corte do tecido infectado (zona de
transição sadio/doente) da planta hospedeira. Desinfecção do tecido com
álcool seguido de imersão em solução de hipoclorito de sódio a 1%, por 1,5
minutos. Plaqueamento destes pedaços de tecido em placas de Petri contendo
meio de cultura BDA (Batata Dextrose Ágar) e incubação em câmara com
controle de temperatura, por 4-7 dias.
No caso de sementes com fungos sem esporulação, estes serão cultivados em
meios de cultura mais específicos e incubados em presença de luz branca,
para indução de esporulação e posterior identificação. Isolamento de fungos
quarentenários de solo ou substratos diversos (turfa, vermiculita, etc.).
Pesagem de amostra de 1g do material a ser analisado. Colocação do material
em tubo de ensaio contendo 9ml de água destilada esterilizada e agitação por
1 minuto. Diluição em série, até 10-5 e plaqueamento em meio de cultura (meio
de Martim e BDA). São plaqueados 0,1ml da suspensão por placa (3 placas por
diluição), com incubação em câmara com controle de temperatura, por 4-7
dias. Posterior avaliação (contagem do no de colônias).

13. PATOLOGIA DE SEMENTES
Especialistas: Margarida Fumiko Ito e João José
Dias Parisi
1) Papel de filtro (“blotter test”): sementes são distribuídas, em número variável
1) Papel de filtro (“blotter test”): sementes são distribuídas, em número variável
(dependendo do tamanho da amostra), eqüidistantes entre si, sobre três folhas
(dependendo do tamanho da amostra), eqüidistantes entre si, sobre três folhas
de papel de filtro, previamente umedecidas em água destilada e esterilizada e
de papel de filtro, previamente umedecidas em água destilada e esterilizada e
contidas em recipientes como placas de Petri. As sementes são incubadas
contidas em recipientes como placas de Petri. As sementes são incubadas
por 7 ou 8 dias à 20 °C a 22 °C, sob fotoperíodo de 12 horas, utilizando-se luz
por 7 ou 8 dias à 20 °C a 22 °C, sob fotoperíodo de 12 horas, utilizando-se luz
fluorescente de 40 watts. Identificação dos fungos: em sementes realizada
fluorescente de 40 watts. Identificação dos fungos: em sementes realizada
após a incubação, examinando-se, individualmente, todas as sementes em
após a incubação, examinando-se, individualmente, todas as sementes em
estéreomicroscópio, com aumento de cinqüenta vezes e identificação de
estéreomicroscópio, com aumento de cinqüenta vezes e identificação de
lâminas em microscópio composto.
lâminas em microscópio composto.
2) Plaqueamento em Agar: sementes em placas de Petri contendo meio de BDA
2) Plaqueamento em Agar: sementes em placas de Petri contendo meio de BDA
(batata 20g, dextrose 20g, agar 15g a 17g, água destilada 1.000 mL),
(batata 20g, dextrose 20g, agar 15g a 17g, água destilada 1.000 mL),
eqüidistantes entre si e mantendo distância suficiente para não haver
eqüidistantes entre si e mantendo distância suficiente para não haver
contaminação. Para este procedimento utiliza-se a câmara de fluxo laminar e o
contaminação. Para este procedimento utiliza-se a câmara de fluxo laminar e o
número de sementes por placa é variável, em função do tamanho da semente.
número de sementes por placa é variável, em função do tamanho da semente.
Antes do plaqueamento, as sementes são submetidas a um pré-tratamento
Antes do plaqueamento, as sementes são submetidas a um pré-tratamento
com solução de hipoclorito de sódio a 1%, que tem por finalidade a assepsia
com solução de hipoclorito de sódio a 1%, que tem por finalidade a assepsia
superficial, para evitar o crescimento de saprófitas
superficial, para evitar o crescimento de saprófitas contaminantes. A
contaminantes. A
incubação, idem ao método do papel de filtro. Identificação dos fungos:
incubação, idem ao método do papel de filtro. Identificação dos fungos:
observação das colônias sobre as sementes ou meio de cultura, pela forma,
observação das colônias sobre as sementes ou meio de cultura, pela forma,
tamanho e coloração. A identificação dos patógenos é complementada pelo
tamanho e coloração. A identificação dos patógenos é complementada pelo
exame das estruturas fúngicas em lâminas, ao microscópio.
exame das estruturas fúngicas em lâminas, ao microscópio.

14. VÍRUS
Especialistas: Valdir Atsushi Yuki e José Alberto Caram de Souza
Dias
• (a) Teste de sintomatologia: baseada nas reações das plantas sob
inspeção, das plântulas delas originadas, das plantas indicadoras de
vírus e nas comparações com as descritas na literatura especializada,
incluindo o círculo de hospedeiras;
• (b) Teste de transmissibilidade: efetuada por inoculação mecânica. A
aplicabilidade
desses
métodos
depende
exclusivamente
das
características vegetativas de cada espécie vegetal, das propriedades
intrínsecas dos vírus quanto a transmissibilidade e da maior ou menor
capacidade de as plantas exibirem sintomas à infecção por vírus;
• (c) Teste Eliza: é aplicado quando existe a sorologia para os fungos que
se deseja detectar.

15. NEMATÓIDES
Especialistas: Carlos Eduardo Rossi e Wallace
Gonçalves
Na extração de formas livres no solo:
a) O método de centrifugação de Jenkisn, que combina o peneiramento e flotação
centrífuga. Tem a vantagem de permitir a extração de estágios ativos e não móveis.
b) O método de funil de Baermann é amplamente utilizado com o inconveniente de
extrair apenas nematóides com boa mobilidade. Para nematóides grandes do tipo
dos gêneros Longidorus e Xiphinema, o método de peneiramento e catação
individual é o mais indicado.
Na extração de cistos (Heterodera e Globodera), a amostra deve ser parcial ou
totalmente seca ao ar. Isso pode ser feito espalhando-se a terra em bandejas ou, se
os sacos forem porosos, as amostras podem ser deixadas em local onde haja
ventilação constante. As seguir as amostras, com 100 cm3, devem ser
destorroadas e peneiradas (peneira de 24 e 60 mesh) e o material retido na peneira
60 é examinado em microscópio estereoscópico, sobre discos de papel de filtro
branco.
A extração de nematóide, em estacas enraizadas, pode ser uma extração direta onde
pequenas
porções
de
tecidos
são
examinadas
utilizando-se
um
estereomicroscópio. Na extração de formas ativas e móveis as técnicas mais
utilizadas são as de extração de Baermann e incubação de Young, embora os
métodos de maceração-peneiramento ou centrifugação, trituração em liquidificador
e peneiramento sejam os mais eficientes, pois removem os nematóides
independentemente da sua atividade. Em extração de formas sedentárias utiliza-se
a lavagem direta em peneiras largas (32 mesh) e estreitas (325 mesh)
concomitantemente e, quando necessário, outros métodos tais como maceração e
peneiramento, maceração e flotação centrífuga, são utilizados. Para extração de
ovos de Meloidogyne utiliza-se do método de Hussey & Barker, 1973.

16. BACTÉRIAS
Especialistas:
Luís Otávio Saggion Beriam e
Christina Dudienas
• Coleta do material suspeito: o material é macerado e
semeado em meios de cultura específicos para ocorrer o
crescimento e desenvolvimento da bactéria.
• Taxonomia: Da bactéria isolada e purificada faz-se a sua
identificação, através da realização de vários testes
bioquímicos, fisiológicos e sorológicos. Realizados os testes
conhecidos e rotineiros, determina-se o patógeno quanto ao
gênero e espécie.

17. ANÁLISES POR PCR
•Haiko Enok Sawazaki
•Carlos Augusto Colombo
RETIRA DE SEIVA DOS INTERNÓDIOS
Faze os testes a partir de DNA extraído de folhas.
Colocar um internódio de cana dentro de um tubo Falcon 50 mL;
Centrifugar os tubos a 4.000 g por 2 min.;
Retirar o internódio do tubo e coletar, com o auxílio de uma pipeta Pasteur, a seiva do
fundo do tubo;
Transferi a seiva (~300 µL/internódio) para um tubo eppendorf e armazenar em banho
de gelo até o processamento ou congelar a -20ºC por tempo indeterminado.

18. QUARENTENA IN VITRO
Antonio Fernando Caetano Tombolato
e Luiz Carlos da Silva Ramos
1. manipulação das plântulas: Se necessário acordamos com a empresa
1. manipulação das plântulas: Se necessário acordamos
importadora para que esta disponibilize um técnico com prática no
importadora para
esta disponibilize um técnico com prática no
manejo de plantas in vitro com a cultura, durante o período do in vitro
manejo de plantas in vitro com
in
e da aclimatação em quarentena.
e da aclimatação em quarentena.
2. Análises de diagnóstico fitossanitário: Ao chegar, o material in vitro
2. Análises de
fitossanitário: Ao chegar, o material in vitro
será inspecionado para a detecção de insetos, vírus, fungos e
será inspecionado para a detecção de insetos, vírus, fungos e
bactérias. Para material in vitro inspeções de plantas daninhas e
bactérias. Para material in
inspeções de plantas daninhas e
nematóides normalmente não se aplicam.
nematóides normalmente não
3. As plântulas são inspecionadas e amostras avaliadas nos laboratórios
3. As plântulas são inspecionadas e amostras avaliadas nos laboratórios
de fitopatologia e virologia.
de fitopatologia virologia.
4. Estão previstas análises moleculares específicas, e de alta
4. Estão previstas análises moleculares específicas, e de alta
sensibilidade, para detecção de vírus e bactérias das patologias mais
sensibilidade, para detecção
bactérias das
mais
importantes, para determinadas espécies como exemplo a cana-deimportantes,
exemplo
açúcar.
açúcar.

19. PARTE II
• FLUXOGRAMA DO QUARENTENÁRIO

20. FLUXOGRAMA Centro de Ecofisiologia
(Centro de Fitossanidade + Centro Experimental Central +
e Biofísica + Centro de Cana + Centro de Café + Instituto Biológico)
3 meses = anuais
6 meses = perenes a partir da
recepção
FIM
INSPEÇÃO PÓSPLANTIO
1 mês a partir da
recepção

21. a) Solicitação do aceite do IAC,
enviado pela empresa;
b) Emissão do aceite pelo IAC;
c) Efetivação do Pedido de
Importação, pela empresa
interessada.

22. a) Deferimento do pedido de
importação;
b) Termo de Fiscalização;
c) A Prescrição de Quarentena;
d) Dado número de controle;
e) Aviso ao importador.

23. a) Abertura em sala à prova de insetos;
b) Se in vitro – segue para o laboratório.
c) Check list.

24. a) Dar numeração IAC (I);
o
b) Dar n . ano de chegada no
quarentenário;
c) Cadastro Intranet no
programa IAC.

25. a) Chamados os especialistas em:
Nematologia, Entomologia, Patologia de
Sementes, Plantas daninhas, que emitem
seu boletim de análise;
c) Germoplasma é guardado na Câmara
Fria, como Fiel depositário;
d) Definido o Expurgo do material, se
recomendado pelos especilistas.

26. a) Se possuir + de 100
acessos, são feitas amostras
compostas (bulk) a cada 10
acessos.

27. a) Preparo do solo;
b) Identificação dos vasos;
c) Amostragem;
d) Plantio
e) manejo e irrigação.

28. INSPEÇÃO PÓSPLANTIO
a) Inspeção em Folhas expandidas;
b) Boletim de Análises: contendo a
metodologia
empregada
e
resultado
obtido,
observações,
e recomendações, pelos especialistas em
Fitopatologista,
Virologista,
Entomologista
e
Bacteriologista.

29. a) Plantas: podem ser incineradas ou
autoclavadas;
b) Substratos: Tratados com Fosfina;
c) Vasos: Tratados com Hipoclorito
de Sódio a 2,4%;
d) Salas: Pulverizadas com Piretrinas
e/ou Piretroides.

30. a) Laudo de Inspeção (Li)
Após liberação dada pelo
especialistas.
b) Laudo de Eliminação (Le):
Emitido, em conjunto com

31. 3 meses = anuais
6 meses = perenes
2 meses = in vitro

32. OBRIGADO!