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     UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GOIÁS



         CURSO DE BIOMEDICINA
           MICROBIOLOGIA I




   Profa. CLÁUDIA MARIA DUQUE DE SOUZA
   Profa. EDLAINE RODRIGUES MONTALVÃO



Profa. Cláudia Maria Duque de Souza
Universidade Católica de Goiás



Universidade Católica de Goiás
Curso: Biomedicina
Disciplina: Microbiologia I
Professora: Cláudia Maria Duque de Souza




PROGRAMA:


1- Objetivo geral:

      A disciplina Microbiologia I visa, fundamentalmente, demonstrar as
técnicas bacteriológicas, princípios dessas técnicas, identificação dos
gêneros e espécies e suas patologias, bem como capacitar o estudante
para a pesquisa e reconhecimento desses microrganismos.




2- Objetivos específicos:

      Habilitar o aluno de bacteriologia para a pesquisa, reconhecimento e
diferenciação dos microrganismos normais e patogênicos nas diferentes
partes do organismo humano, tais como: orofaringe, pele e anexos,
aparelhos auditivo, visual, gastrointestinal e genito-urinário.




Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo.
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              MICROBIOLOGIA I - CBB 3641 - 4 CRÉDITOS




CONTEÚDO:

01 - Normas de coleta, transporte e armazenamento das amostras das
diferentes áreas anatômicas.
02 - Microbiota
03 - Urinocultura.
04 - Coprocultura.
05 - Antibiogramas (TSAQ)
06 - Cultura de escarro.
07 - Cultura de exsudato de orofaringe.
08 - DST (Gonorréia, Sífilis).
09 - DST (Cancro mole, LGV e Donovanose).
10 - Cultura de exsudato do aparelho da visão.
11 - Cultura de lesões cutâneas e anexas.
12 - Diagnósticos laboratoriais da Hanseníase
13 - Hemocultura e Líquidos corporais.




Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo.
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BIBLIOGRAFIA

01. Jawetz, Ernerst. Microbiologia Médica. Guanabara Koogan.
02. Bier, Otto. Microbiologia e Imunologia. Melhoramentos.
03. Pelczar, Reid e Chain. Microbiologia Vol I e II. McGraw-Hill do Brasil.
04. Moura. Microbiologia Clínica. Mc Will Editores.
05. Korting e Gunnter. Dermatologia. Editora Manole.
06. Cecil. Tratado de Medicina Interna. Guanabara Koogan.
07. Dowell, Allen e Koneman. Diagnóstico Microbiológico. Panamericana.

08. Neto, Amato e V. et al. Antibióticos na prática médica. Gnemed.
09. Parage, R. Microbiologia Clínica. Panamericana.
10. Miname. Micologia, Diagnóstico Laboratorial das Micoses.
11. Reese, Richard E, Sentochnik, Deborah E., Douglas Jr, R. Gordon e
Betts, Robert F. Manual de Antibióticos.
12. Roitman, Isaac, Travassos, Luiz R. e Azevedo, João Lúcio. Tratado de
Microbiologia.
13. Mac Faddin. Pruebas bioquimicas para la identificacion de bactérias de
importância clínica. Panamericana.
14. Lennete, Balows, Hausler e Shadony. Manual de Microbiologia Clínica.

15. Hentges, David J. Medical Microbiology.
16. Fundemberg, Hugh. Microbiology and Imunology, a positive statement
manual. Guanabara Koogan.
17. Delost, Danessa Maria. Introduction to diagnóstic Microbiology, Mosby,
1997.
18. Rowland, S. Sharon. Pathogenic and Clinical Microbiology. Little,
Brown and Company, 1994.
19. Crissey, Thorne John, Manual of Medical Micology. 1995. Blackwell
science.
20. Tagliavini, Ruggero. Novo Atlas prático de Dermatologia e
Venereologia. 1995, Santos.
21. Konneman, Elmer. 5ª edição. Color Atlas - Diagnostic Microbiology,
1997, Lippincott.
22. Dwight R. Johnson. Laboratory of diagnostic of Group A Streptococcal
infections. WHO (Organização Mundial de Saúde).
23. Chung, Kwon J. K. Medical mycology. 1992. Lea & Fabiger.
24. Zaitz, Clarisse. Atlas de Micologia. 1995. Medsi.

Artigos da Internet
Periódicos: Revista Laes Haes, Mc Will Editores,                     News   Lab,
ARSCVRAND, JAMA, Arquivos de Dermatogia (JAMA).

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AULA 01


 COLETA, TRANSPORTE E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS.

       É a parte mais importante no isolamento do microorganismo que é
responsável pelo processo infeccioso. Uma coleta mal feita resulta no insucesso
da pesquisa do real agente etiológico da doença. Quando há contaminação na
coleta, por exemplo, com microorganismos da flora normal, pode gerar uma
terapia incorreta tratando-se o germe contaminante e não o causador da
doença. Por exemplo, num caso de pneumonia causada por Klebsiella
pneumoniae, se a coleta for feita erroneamente (só na saliva e não no escarro),
a terapia antibiótica estará inadequada.

       A amostra clínica deve ser material do verdadeiro local da infecção e
colhida com o mínimo de contaminação. Deve-se ter cuidado com a
contaminação do escarro pela saliva, com a coleta de exsudatos de feridas para
não tocar na pele adjacente, com a contaminação da amostra de endométrio
com secreção vaginal e um cuidado especial com a limpeza do tecido
parauretral e períneo antes da coleta de urina. Outro problema é a
impossibilidade de atingir abcessos profundos sem agulhas e cânulas. Deve-se
estabelecer períodos ótimos para coletar as amostras para proporcionar um
maior acerto no isolamento dos agentes causadores, mas, para isso é
necessário conhecer a fisiopatologia dos processos infecciosos.




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* Hemocultura - segunda semana;



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* Urocultura - segunda ou terceira semana de infecção;




* Coprocultura - Salmonella tiphy = diarréia aguda;




 * Soro - os anticorpos aumentam na segunda semana, mas com pico na quinta
semana.

      A urina das pessoas normais pode ser inibitória ou bactericida para
alguns microorganismos quando o seu pH é igual ou menor do que 5,5 e
quando há aumento da osmolalidade ou da concentração (densidade).

      As novas técnicas para urina e escarro possibilitam os usos de pequenos
volumes do material proporcionam um resultado fidedigno (tratando-se de
micobactérias), com pouca interferência de contaminantes e dispensando as
longas coletas de 24 horas.

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       A quantidade de material deve ser suficiente para a boa execução da
técnica usada; observar que nas formas agudas há abundância de exsudatos,
porém, nas crônicas, há escassez.
Cuidado som os swabs secos, isto é, com pouco material; pode ser desperdício
de material do laboratório e do paciente. O melhor procedimento é retirar outra
amostra e fazer uma declaração sobre as condições da amostra que foi
enviada.
No caso de escarro, 0,5 mL é pouco para toda a rotina (pesquisa de BAAR e
cultura), além de poder não conter secreções pulmonares dos locais certos.

       Dispositivos de coleta, recipientes e meios de cultura devem ser
rigorosamente esterilizados para que se chegue a um ótimo isolamento.
Os frascos para urina e escarro devem ter a boca larga, para não haver
contaminação do frasco, e tampa firme para não haver vazamento do material
no transporte.
Recomendam-se os swabs com pontas de alginato de cálcio, dracon ou
poliéster porque o algodão pode ter ácidos graxos que impedem certas
bactérias sensíveis.
Deve-se respeitar o tempo de contato entre o swab e amostra; os swabs de
orofaringe devem ser colocados em meios de transporte para que não
ressequem e provoquem a morte bacteriana.


          RECIPIENTES PARA TRANSPORTE DAS AMOSTRAS




       Existem no mercado várias opções, uma delas é o Culturette (ampola de
vidro com meio de Stuart para transporte), que assegura a umidade e conserva
a amostra por 24 horas.
Outro meio de transporte é o de Amies que é semi-sólido
       Para a coleta de anaeróbios não se usa swabs, mas sim agulhas e
seringas para aspiração. As amostras devem ser protegidas do oxigênio e da
dissecação.
Alguns materiais para anaerobiose disponíveis no mercado são o Anaerocult da
Merck®, Anaerobac da Probac® e os Tubos de Scott ( dois tubos de onde foi
retirado o oxigênio e colocado o CO2, um dos tubos tem um swab adaptado à
tampa e o outro é lacrado). Para a coleta de anaeróbios obrigatórios,
microaerófilos e anaeróbios facultativos têm-se os tubos mais flaconetes (Port-a-
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cult da BBL® e o Coletor de amostras anaeróbicas da BD [tubo fechado e
saturado com gás].).

       Sempre que possível coletar as amostras antes da administração de
antibióticos, a qual irá reduzir a segurança do resultado da cultura
(possibilidade de falso negativo), porém, existem microorganismos que têm o
seu crescimento normal mesmo em presença de antibióticos.
Há casos nos quais vários antibióticos da terapia têm ação bacteriostática e ,
quando colocamos a amostra em meios frescos (líquidos), com CIM
(concentração inibitória mínima) de antibióticos, abaixo da concentração
existente no local da infecção, o isolamento não fica problemático.

      Para um bom desempenho dos exames bacteriológicos existem certas
regras de cadastramento do paciente que devem ser observadas:
O recipiente deve ser rotulado de maneira legível e contendo todas as
informações completas sobre o paciente, tais como:

# Numeração do exame;
# Médico;
# Data e hora;
#Local da coleta do material.




     Deve-se ter um bom contato com o médico, no caso de precisar de
alguma informação antecipada do quadro do paciente.

TEMPO DE ENTREGA DAS AMOSTRAS:

1) Respiratória: 30 min
2) Gastrointestinal: 1h
3) Hemocultura: 30 min
4) Anaeróbio: 30 min
5) Catéter intravascular: 15 min
6) LCR e líquido pleural
7) Urina: até 1h, se refrigerada
8) Swabs: imediatamente
9) Amostras com anestésicos locais: Imediatamente!!


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AULA 02

                                         FLORA NORMAL

        Atualmente, há uma grande motivação para o estudo da ecologia
microbiana, as causas do seu estabelecimento, a sua persistência, bem como o
papel que esta flora representa na movimentação do nosso estado de saúde,
especialmente no que se refere à flora normal do homem. Um estudo mais
profundo da flora autóctone é de difícil execução em virtude de problemas
econômicos e da dificuldade de se chegar a certas regiões do corpo como os
folículos pilosos, glândulas sebáceas, glândulas sudoríparas e vilosidades do
intestino, constituindo um problema técnico o estudo da flora normal destas
regiões.

       Nem todas as espécies bacterianas que fazem parte da flora normal são
cultiváveis, podendo estar presente em determinadas áreas do corpo sem
serem recuperadas nas culturas de amostras colhidas; este também não deixa
de ser um problema técnico de isolamento dessas bactérias autóctones. Assim,
conclui-se que o estudo da flora normal ainda é um campo muito amplo de
observações e discussões.

        Durante o processo de nascimento a pele, nariz, boca e conjuntiva
tornam-se infectados por organismos adquiridos na passagem pelos genitais
maternos. Após poucas horas do nascimento, os microorganismos já estão
proliferando dentro do trato alimentar, nas superfícies externas desse e de
outros tratos (por exemplo, do trato urogenital) e na superfície externa (pele e
mucosas), aonde estabelecem residência.
Os tecidos possuem mecanismos naturais e eficientes de defesa que restringem
os microorganismos às áreas nas quais eles podem ser tolerados; quando
essas defesas são vencidas e as bactérias têm acesso aos tecidos
normalmente infectados, geralmente, ocorre a doença. A disseminação desses
organismos autóctones dá-se por manuseio, perdigotos e pela respiração.

       Os conceitos de patogenicidade e virulência, atualmente, são
considerados sinônimos e refletem a capacidade de espécies bacterianas de
penetrarem nas defesas do hospedeiro. Algumas espécies coexistem com o
hospedeiro de forma pacífica, mas, em determinadas circunstâncias, tornam-se
claramente patogênicas, vencendo rapidamente as defesas do hospedeiro e
produzindo doenças logo que chegam ao local.
A patogenicidade dos microorganismos depende de fatores que variam com o
gênero e as espécies do germe, e mesmo com as suas diferentes estirpes.
Existem espécies altamente patogênicas para uma espécie animal e não
patogênicas para outros animais, ou mesmo para o homem, devido à sua
capacidade invasora ou então à sua toxicidade. A sua capacidade invasora
resulta do poder de escapar da destruição causada pelas células fagocitárias,


Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo.
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ou da capacidade de produção de enzimas bacterianas que facilitam a
penetração das bactérias nos tecidos.

PELE E MUCOSAS:

       Constituem barreiras físicas que são relativamente impermeáveis às
bactérias. O pH ácido (3 a 5) da pele, devido a produtos do metabolismo
bacteriano, inevitavelmente dificulta o crescimento de muitos microrganismos
que chegam a esta superfície. Os ácidos graxos da pele matam muitas bactérias
patogênicas como o S. pyogenes, mas, por outro lado, estimulam o
crescimento de outros difteróides.
       A lágrima e a saliva têm lisozimas que arrebentam a camada
mucopeptídica de várias bactérias.

      A acidez da mucosa vaginal (pH de 4 a 4,5) é devida ao crescimento dos
lactobacilos. O aparelho respiratório também contém uma série de defesas
escalonadas contra microrganismos (reflexo epiglótico, aderência de muco na
árvore respiratória, cílios e epitélio respiratório e tosse).

       A pele é considerada, porém, um ecossistema pouco favorável,
restringindo-se, assim, a um número muito pequeno de espécies.
Tem como componentes aeróbios: S. epidermides, S. pyogenes, outros
Streptococcus, Difteróides lipolíticos (axilas), Difteróides não lipolíticos,
Acinetobacter e Alkaligenes (Gram negativos, presentes em regiões úmidas
como axilas e pés); anaeróbios: Lactobacilos anaeróbios (glândulas sebáceas),
Propioniobacterum acne.

       A maioria das bactérias vive nas camadas superiores da camada córnea
da pele e parte superior dos folículos pilosos, sendo que 20% dessas bactérias
não são alcançadas por desinfecção de pele. Esta barreira constitui um
reservatório que permite rápido reestabelecimento da flora superficial após a
sua remoção por meios artificiais. Há um aumento no número de bactérias de
superfície imediatamente após o banho, seguido de uma diminuição até os
níveis normais nas próximas duas horas. Isto ocorre porque durante o banho há
uma maior exposição da camada córnea da pele. Os locais da pele mais
habitados por bactérias são as axilas e os espaços interdigitais.

       Os fatores climáticos também influenciam na constituição da flora da
pele; no inverno há um predomínio de Micrococcus e no verão de Difteróides.
Se a pele for abafada (vedada) há um provável aumento no pH e conseqüente
aumento dos Difteróides.

      A quantidade de lisozimas na pele é suficiente para afetar a ecologia dos
microorganismos nela presentes, mas a fonte dessas enzimas é, ainda,
desconhecida.


Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo.
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Os cocos residentes da pele são insensíveis à atividade lítica desta enzima, mas
a invasão por bactérias patogênicas talvez seja dificultada.
Os ácidos graxos da pele que inibem, in vitro, os Micrococcus, spp; S. pyogenes
e S. aureus, não inibem Pseudomonas aeruginosas nem a E. coli. O ácido
oléico estimula o crescimento, in vitro, de cepas lipolíticas de Difteróides
cutâneos e Propioniobacterium acne. Sommer Ville sugeriu que as variações da
microflora das crianças, quando comparada com os adultos, podem acontecer
por causa das baixas concentrações de ácidos graxos livres na pele dessas
crianças.

       Os Staphylococcus coagulase negativa e outros Micrococcus podem
dominar a pele em virtude das bacteriocinas (antibióticos bacterianos) e outros
inibidores que eles produzem.


FLORA NORMAL DO OLHO:

       As bactérias do olho são similares àquelas encontradas na pele (há
relação entre o S. aureus na pele e a sua presença no olho) e vias aéreas
superiores, além das bactérias Gram negativas mais comuns do TGI que
também são isoladas nos olhos; mas as bactérias encontradas normalmente no
ar são, raramente, isoladas no olho.
Acredita-se que os cílios tenham um papel importante na manutenção da flora
do olho; acredita-se também que os olhos nunca estão desprovidos de
Staphylococcus porque a fonte de contaminação está sempre presente. Não
existe diferença entre a flora ocular de homens e mulheres e não há
modificação da flora com a idade do indivíduo, exceto um aumento no número
de Difteróides em indivíduos com 50 anos ou mais (Corynebacterium xerosis).

OUVIDO:

       O canal auditivo externo reflete a flora da pele, sendo que Pseudomonas
aeruginosas e S. pneumoniae também têm sido isolados. O ouvido médio e o
interno são estéreis e qualquer bactéria provoca infecção.

TRATO GENITO URINÁRIO:

      A sua flora varia com as diferentes áreas.
      A genitália externa masculina não é muito seletiva e a flora inclui Gram
negativos, com predominância de bacilos fusiformes, espiroquetas e
Micobacterium smegmatis.

      A flora da vagina varia com a idade da paciente. Os fatores fisiológicos,
como os hormônios ou o glicogênio na mucosa vaginal (que é controlada por
estrogênios e progesterona), são responsáveis pela acidez vaginal. Essa
mesma acidez predomina no nascimento devido ao hormônio materno e,
Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo.
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quando o estrogênio torna-se ativo, há uma intensa descamação do epitélio e
um grande depósito de glicogênio. O pH da vagina gira em torno de 4 a 5 e a
flora é rica em Lactobacillus acidophylus.
Na infância e menopausa o pH é básico (em torno de 6 a 7) e a flora
predominante é de cocos.
Na gravidez há um grande depósito de glicogênio. Recentemente, foi
demonstrado que a ação dos lactobacilos sobre o glicogênio da vagina é
específica de algumas estirpes que agem somente sobre o glicogênio humano.
Existe diferença entre a flora da vagina externa, paredes vaginais, fundo de
saco de Douglas e colo de útero.

      São componentes da flora vaginal: Haemophilus vaginalis, Difteroides,
Mycoplasma, spp; Lactobacillus, spp; Coliformes, Streptococcus, spp aeróbios,
S. faecalis anaeróbios e S. aureus. Neisseria gonorrheae pode estar presente
em portadora.

TRATO GASTRO INTESTINAL:

       É estéril ao nascimento.
       No adulto existe entre 10 elevado a 5 e 10 elevado a 10 de bactérias por
grama de fezes no intestino delgado e 10 elevado a 11 no intestino grosso. O
esôfago e o estômago estão contaminados com bactérias provenientes dos
alimentos ingeridos, mas estas bactérias não sobrevivem nestas partes do trato
gastrointestinal. O estômago não é adequado ao crescimento de
microrganismos devido à grande acidez do suco gástrico e à própria motilidade
do órgão, que o esvazia em intervalos periódicos; nele, há uma reflexão da flora
dos alimentos e saliva, porém, como floras residentes podem considerar
algumas bactérias esporuladas e lactobacilos. O Mycobacterium gastri provoca
bacterioscopia duvidosa com TB quando é analisado no suco gástrico.
O fígado e vesícula são, geralmente, livres de contaminação bacteriana.

       Nos níveis mais inferiores do TGI há um aumento do número de bactérias
de cada espécie, atingindo o máximo no intestino grosso, sendo que nesses
níveis também são encontradas as bactérias anaeróbias.

      Os principais germes da flora fecal são: os bacterióides
(Corynebacterium, sp), Lactobacillus acidophylus, Clostridium, sp (C. perfringes)
e Streptococcus faecalis.

       A flora normal do TGI foi recentemente estudada e verificou-se uma
diferença na composição de acordo com a área geográfica, com a fisiologia e
dieta do paciente.

     O intestino delgado superior, geralmente, é estéril ou contém poucos
germes; quando há uma gastroenterite aguda (crianças ou adultos) há um
aumento na sua flora normal, principalmente de E. coli (que provoca diarréia
Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo.
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pela ação da exotoxina), o que irá provocar um desequilíbrio eletrolítico. Para o
controle da E. coli as colicinas podem ser consideradas importantes, porém,
fatores que controlam a espécie dominante, Bacterioides fragilis, ainda não
foram definidos.

CAVIDADE ORAL:

       A boca pode ser considerada um ambiente uniforme. Porém, nela há
diferentes nichos ecológicos que se alteram com o tempo durante a vida. É o
local de maior variação de microrganismos (ex. dorso da língua, sulcos
gengivais, placas dentárias). A contagem de microrganismos totais da saliva é
igual a 4 - 5,5 bilhões/ml, com uma média de 750 bilhões.

        O feto é, normalmente, estéril “in útero”. Durante o nascimento a criança
é contaminada pela flora do trato genital materno (Lactobacillus,
Corynebacterium,        Micrococcus,         Enterobactérias,      Streptococcus,
Peptostreptococcus, leveduras, protozoários e vírus). Apesar disso ainda é
estéril ao nascimento e, de 6 a 10 horas após o nascimento, torna-se bem
variada por algum tempo.

      Na idade de 0 a 1 ano as bactérias que predominam são: Streptococcus,
Staphylococcus, Lactobacillus, Neisseria catharralis, Veilonella, Nocardia,
Actinomicetos, Escherichia, Fusobacterium, Bacterioides, Leptotrichia e
leveduras.

      A presença de dentes não é necessária para a instalação de bactérias
filamentosas (Fusobacterium, Actinomyces, Leptotrichia).

      O Streptococcus sanguis se estabelece após erupção dentária. As cáries
também fornecem novos substratos e um pH ácido, além de dificultar a
exposição de microrganismos aos agentes antimicrobianos da saliva. A placa
dentária contém Streptococcus, Neisseria, Veilonella, Actinomyces e Gram
negativos.

      O pH da saliva ( 5,7 - 7,0) parece ter importância na manutenção da flora
normal.
Outros fatores para a manutenção desta flora são as vitaminas do complexo B e
a mucina juntamente com carboidratos.

      Os Lactobacillus,spp são em pequeno número e só aumentam na
presença de cáries ou má higiene bucal (correlação positiva entre cáries e
lactobacilos).

BOCA:

         Actinomyces, spp
Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo.
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         Bacterioides, spp
         Moraxella catharralis
         Candida albicans e outras leveduras
         Campylobacter, spp
         Entamoeba gengivalis
         Fusobacterium, spp
         Haemophilus, spp
         Lactobacillus, spp
         Leptotrichia, spp
         Micrococcus, spp
         Mycoplasma, spp
         N. meningitidis
         Peptostreptococcus, spp
         S. aureus
         S. epidermides
         S. pneumoniae
         S. faecalis
         S. mitis e S. salivarius ( alfa hemolítico)

NASOFARINGE:

         Acinetobacter, sp
         Moraxella catharralis
         Haemophilus, spp
         Moraxela, spp
         N. meningitidis
         S. aureus
         S. epidermides

AMIGDALAS:

         Actynomices, spp
         Bacterioides, spp
         Fusobacterium, spp
         Micrococcus, spp
         S. aureus
         S. epidermides
         S. pneumoniae
         S. faecalis
         Veillonella, spp


NARIZ:

         Corynebacterium, spp
         Moraxela, spp
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         N. meningitidis
         S. aureus
         S. epidermides
         S. pneumoniae
         S. faecalis
         S. pyogenes (portadores sãos)


OROFARINGE:

         Bacterioides, spp
         Candida albicans
         Enterobacterias
         Haemophilus, spp
         S. pneumoniae
         Streptococcus hemolíticos

DENTE:

         Leptotrichia buccalis

SALIVA:

         Lactobacillus, spp.




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AULA 3




                                         URINOCULTURA
COLETA:

       Normalmente, é feita pelo próprio paciente. Para um isolamento ideal dos
microrganismos causadores da infecção das VGU é necessária uma coleta com
o mínimo de probabilidade de contaminação pelos tecidos adjacentes à uretra; o
ideal seria a coleta com supervisão de um técnico ou enfermeiro bem treinado.

NORMAS:

      Cabe a nós instruir o paciente da maneira mais simples para que o
mesmo não erre na coleta e, conseqüentemente, nos livre dos erros de
isolamento.

1. Lavar a área com água e sabão (períneo mais área genital);
2. No caso de mulheres devem-se afastar os lábios vaginais;
3. O frasco deve ser estéril e ter a boca larga para evitar extravasamento dos
jatos para mãos e adjacências;
4. Desprezar o primeiro jato (que traz excesso de bactérias da uretra e não das
VGU em si) e colher o segundo;
5. As instruções devem ser escritas em um cartão a ser entregue ao paciente,
ao invés de serem ditas apenas verbalmente, com o objetivo de evitar uma
interpretação errônea pelo paciente. Se o paciente tiver pouca instrução, faz-se
necessária a leitura e explicação dessas instruções por parte do atendente do
laboratório.




Observar que:
Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo.
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- a contagem de colônias pode variar de 0 a 100.000 col/mL (ou mais);
- pacientes isentos de infecção das vias urinárias não devem ter bactérias ou ter
no máximo algumas colônias;

- significância - de 0 a 9.000 col. /mL, não tem significado clínico
                  de 10.000 a 90.000 col./mL, suspeita de infecção
                  acima de 100.000, início de infecção.
- o isolamento de três ou mais espécies de bactérias indica, na maioria dos
casos, falhas na coleta ou atraso no transporte.
- Punção supra-púbica:
        1) Qualquer isolamento de BGN deve ser considerado.
        2) Quantidade > 103 UFC/ml de CGP deverá ser considerada.


COLETA PARA MICRORGANISMOS ANAERÓBIOS DA URINA:




      Usada principalmente para crianças e em material de adultos que
apresentam sintomatologia, porém com ausência de crescimento nos meios
habituais.


1. Desinfetar a pele da região suprapúbica, localizada sobre a bexiga
(preparação cirúrgica);
2. No local, injetar Lidocaína a 10% por via subcutânea;
3. Fazer um pequeno corte na epiderme e, através deste, injetar uma agulha
espinhal calibre 18 com bizel curto e aspirar 10 mL da urina;
4. Não coletar amostras em bolsa com catéter, exceto em crianças, porque as
pontas do catéter podem conter muitos microrganismos uretrais.

      O prazo máximo para que o material, no caso da urina, seja utilizado em
exames é de duas horas, pois, se esse tempo for ultrapassado, há um
crescimento excessivo das bactérias da urina dando um número alterado (para
mais ou para menos).

      Quando o paciente mora muito longe (mais de duas horas de distância) o
material deve ser colhido no laboratório ou então deve ser trazido numa caixa
com gelo.
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       Os coletores de farmácia e os sacos plásticos devem ser aceitos no caso
de crianças e internos de hospital porque são esterilizados por raios.


MICRORGANISMOS QUE CAUSAM INFECÇÃO NO APARELHO
URINÁRIO:

      Enterobactérias (E. coli, Proteus, spp; Klebsiella, spp), Streptococcus do
grupo D (S. faecalis), Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, S.
epidermides, S. saprophyticus.




SINAIS E SINTOMAS:

1. Infecções na bexiga: piúria, disúria, hematúria, dor e tumefação supra-púbica
e de abdomem inferior.
2. Infecção renal: dor lombar e tumefação do ângulo costo-vertebral (ACV).

ENTEROBACTÉRIAS:




      São bactérias Gram negativas em forma de bastão com bordas retas.
Suas colônias são grandes, cinza escuras, úmidas e mucóides; as colônias que
crescem como ondas (fenômeno erosivo) sugerem a presença de Proteus, spp.

        As enterobactérias fermentam a glicose e produzem ácido no meio,
tornando o TAF amarelo. Uma reação no TAF de ápice e base alcalinos
(vermelho) exclui as espécies bacterianas da família das enterobactérias. São
citocromo-oxidase negativas, reduzem nitratos a nitritos, com exceção do
Enterobacter aglomerans e Erwinia, spp, em 18 a 24 horas nos meios básicos
mais KNO3.
        Os meios seletivos para enterobactérias, normalmente, contém sais
biliares em concentrações adequadas com o objetivo de evitar o crescimento
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dos Gram positivos. Se o material que chegar ao laboratório albergar bactérias
mistas (Gram positivas e Gram negativas) pode-se fazer um isolamento destas
bactérias semeando o material em meios não seletivos como o Ágar sangue e
em meios seletivos como o ágar MacConckey, Hektoen, ENDO.

      As enterobactérias podem provocar doenças infecciosas nas VGU,
aparelho respiratório (Klebsiella pneumoniae) e em feridas (E. coli).
As bactérias lactose positivas são consideradas patogênicas (E. coli,
Klebsiella,spp; Enterobacter,spp), e são fermentadores lentos Citrobacter,spp;
Providencia,spp; Serratia,spp; Hafnia,spp. No meio seletivo EMB pode-se
observar as colônias fermentadoras de lactose (E. coli produz colônia verde
escura com brilho metálico). Para as amostras gastrointestinais usam-se os
meios ágar SS, Hektoen, XLD (ou ágar SIM).
Os caldos de enriquecimento para enterobactérias são o caldo selenito, caldo
GN e caldo tetrationato.


PRINCIPAIS BACTÉRIAS QUE CAUSAM INFECÇÕES NO TRATO
                      URINÁRIO

1- Escherichia coli

       Existem 171 sorotipos antigênicos somáticos O e ainda são divididas em
sorogrupos baseados nos antígenos K (capsular) e H (flagelar); certos sorotipos
O de E. coli são conhecidos como invasores da mucosa intestinal e outros são
conhecidos como produtores de enterotoxinas termolábeis e termoestáveis. A
transferência de produção das enterotoxinas é dada por plasmídio (Ent.) e,
como exemplo de sorotipos produtores tem-se: O 6; O 8; O 25; O 27; O 148; O
159.
Nas fezes é necessário classificá-las em enteropatogênicas ou
enterotoxinogênicas e invasivas, mas isto só é necessário em infecções
gastrointestinais (coprocultura).

       A E. coli é predominante no intestino grosso. É um coliforme produtor de
colicinas. Os testes de ELISA (imunoabsorção ligada a enzima) para as toxinas
termolábeis são positivos.

        A patogenia da infecção do trato urinário propaga-se por via
hematogênica e linfática. A E. coli(UPEC) é lactose positiva, CO2 positivo,
lisina positiva (76 a 89 %), indol positivo, motilidade positiva, VP negativo, citrato
negativo e urease negativa. As espécies da taxonomia das enterobactérias
adotada e proposta atualmente são: E. coli; E. hermannii e E. vulneris, E.coli
inactiva(antiga Alkalescences-dispar).

2- Proteus, spp

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      A família Proteae tem como espécies de interesse: P. mirabillis, P.
vulgaris (P vulgaris biogrupo 2), P. rettigeri (passou para P.vulgaris
biogrupo 1), P. penerii e P. inconstans.

       As Providencia stuarti e Providencia alcalifaciens estão incluídas como
Proteus inconstans. O Proteus morganii foi transferido para o novo gênero
Morganella morganii(subespécie morganii).
Recentemente o nome Proteus penerii foi proposto para o organismo P. vulgaris
indol negativo. O P. mirabillis, P. penerii e P. vulgaris são H2S positivos e podem
ser confundidos com Salmonella, spp.

       Os Proteus, no geral, são ureia positivos, fenil-alanina positivos, VM
positivos, H2S positivos e CO2 positivos. Em TAF apresentam-se em colônias
não pigmentadas; em meios seletivos podem ser confundidas com colônias não
fermentadoras de lactose. Forma em ágar sangue um crescimento em véu ou
onda como se fosse uma película. São pleomórficos, não capsulados e móveis.

       O P. mirabillis é o mais encontrado em infecções humanas no trato
urinário. Comumente são encontrados em pacientes em antibioticoterapia longa.
O P. vulgaris é, geralmente, resistente à penicilina e à cefalosorina; o P.
mirabillis é sensível à ampicilina e à cefalosporina. Encontram-se na água e solo
em fezes contaminadas.

       Os Proteus têm 49 antígenos O e 19 antígenos H. Algumas estirpes têm
o antígeno K (capsular). A reação de Weil Felix utiliza antígenos dos tipos O 1 e
O 2 de P. vulgaris e O 3 de P. mirabillis pode apresentar resultados positivos
para as três espécies, mas especialmente para o P. mirabillis. O P. mirabillis é
mais frequente do que o P. vulgaris, mas ambos estão frequentemente
associados ao Diabetes e anomalias do trato urinário. Em hospitais o P.
mirabillis acomete pacientes cateterizados, pós-cirúrgicos e aqueles que
sofreram instrumuntações urológicas.

      Encontram-se na água e fezes contaminadas, sendo que 25 % da
população são portadora de Proteus no intestino. Pode ser encontrado, ainda,
na garganta, olhos, feridas e trato respiratório.

        A Morganella morgani também causa infecção urinária e tem sorogrupos
classificados pelos antígenos O e H.



3- Citrobacter, spp

       São lactose positiva, motilidade positivos, VM positivos e citrato positivos
(76 a 89 %) como o C. amalonaticus. Citrobacter freudii, C. amalonaticus e C.
diversus são as espécies de interesse, sendo que o C. freudii é a espécie tipo
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que se assemelha à Salmonella e Arizona e é um organismo oportunista no
homem.

4- Klebsiella, spp

       São capsuladas, imóveis e isoladas aos pares ou em cadeias curtas. As
colônias são elevadas, viscosas e brilhantes. Nas provas bioquímicas mostram-
se VP positivas (produzem butilenoglicol a partir da glicose), mas existem VP
negativas e VM positivas e também VM positivas. Várias espécies têm
bacteriocinas e causam bacteremia e infecções no trato urinário humano. São
muito encontradas em infecções hospitalares, sendo que todas as espécies são
resistentes à ampicilina.

       As espécies que representam o gênero são: K. pneumoniae
(K.pneumoniae subspécie pneumoniae), K. oxytoca (mais no intestino), K.
ozaenae (necrose da mucosa nasal), K. rhinoescleromatis(K.pneumoniae
subspécie rhinoescleromatis)granuloma destrutivo de nariz e faringe), K.
terrigena e K. platicola. São H2S negativas, uréia negativa, femil-alanina
negativas, lisinas positivas e ornitina negativas.
       A K. pneumoniae tem 82 antígenos K e 5 antígenos O, mas os antígenos
causadores da pneumonia são os capsulares 1, 2 e 3.

5- Enterobacter, spp

       Algumas espécies são capsuladas, são móveis, citrato positivo, CO2
positivo, glicose positiva, VP positiva, VM negativa e H2S positivo.

       Antigamente a espécie tipo era denominada Aerobacter aerogenes; o
Enterobacter hafnia é agora Hafnia alvei e as espécies de interesse são: E.
cloacae, E. aerogenes, E. aglomerans, E. sakazakii e E. gergoviae
( E.aerogenes atypical) = uréia positiva).

      O E. cloacae (E.cloacae-like unemed sps 1,2,3) é mais isolado na urina,
escarro, pus, sangue e líquor; faz reação cruzada com E. coli.

      O E. sakazakii, que antes era E. cloacae, é encontrado em alimentos, no
meio ambiente e causa meningite em recém-nascidos.

      O E. aglomerans (E. agglomerans complex: Erwinia herbícola, E.
melletiae e ainda: Pantoea agglomerans (E. agglomerans HGXIII); Pantoea
ananás (E. agglomerans HGVI) Pantoea dispersa (E. agglomerans HGIII),
após atos cirúrgicos e cateterização positiva hemoculturas).

     O E. aerogenes é encontrado em fezes humanas, esgotos, leite, água,
VGU, pus e sangue.

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6- Pseudomonas, spp

       Não são enterobactérias, mas são encontradas em infecções no TGU.
São bastonetes aeróbios estritos, móveis, catalase positiva e citocromo-oxidase
positivo. Nas espécies flageladas o número de flagelos serve para separá-las,
mas isso não ocorre na rotina do laboratório clínico. Possuem fímbrias que
possibilitam a fagocitose. Produzem pigmentos solúveis, a pioverdina (P.
fluorescens) e a piocinina ( P. aeruginosa - azul) e odor adocicado semelhante
ao da uva.

       São encontradas nos olhos, urina, ferida, sangue, lavados brônquicos e
trato genital feminino.

       As espécies de interesse são: P. aeruginosa (mais patogênica, que
cresce a 42ºC), P. fluorescens, P. putida, P. cepacia (Burholderia cepatia,
encontrada na putrefação da cebola, em lesões úlcero-necroticas em humanos,
em pacientes com fibrose cística em paciente com estenose de uretra, após o
uso de sondas), P. stutzeri (água e solo, raro em infecções) e P. maltophilia
(Stenotophomonas maltophila, encontrada no aparelho respiratório, sangue,
feridas   e    urina    e     pacientes    com    infecções     oportunistas),
P.pseudomallei(Burkholderia pseudomallei)

7- Staphylococcus, spp

      As espécies que causam infecções urinárias são: S. aureus, S.
saprophyticcus, S. xylosus e S. epidermides (quando a contagem de colônias
está muito alta ele também pode causar infecções urinárias).

Outros patógenos que podem causar infecções urinárias e outras
infecções (Bacilos Gram negativos ,não fermentadores de açúcares:

1) Flavobacterium meningosepticum = Chryseobacterium meningosepticum
(patogênicos para prematuros)
2) Oligella urethralis (infecções no ouvido e urinárias)
3) Neisseria elongata (subsp. nitroredutans) endocardite
4) Sphingobacterium spiritivorum (sg, urina, antigo Flavobacterium
spiritivorum)
5) Shingomonas paucimobilis (Pseudomonas paucimobilis) encontrada em
várias amostras clínicas.
6) Weeksella virosa (Flavobacterium genitale) = colônia mucóide, infecções
urinárias e genitais.
7) Alcalígenes faecalis (antigo odorans) = nebulizadores, lavado brônquico, sg,
escarro, urina.
8) Acinetobacter baumannii (penicilina resistente).


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AULA 4




                                        COPROCULTURA

       Este exame é destinado a isolar os microrganismos causadores das
diarréias, disenterias purulentas, sanguinolentas e mucosas e dores abdominais.
       As fezes podem se apresentar sólidas, líquidas ou pastosas;
normalmente, as fezes líquidas e pastosas são características de agentes
gastrointestinais patogênicos. Quando as fezes do paciente estão sólidas e ele
está apresentando dores abdominais, o médico pode administrar um laxante
para facilitar o trabalho da coprocultura; se as fezes estiverem líquidas ou
pastosas há necessidade de se fazer uma suspensão em salina estéril.

      A semeadura é feita num caldo de enriquecimento, podendo ser utilizado
o caldo selenito, caldo tetrationato ou caldo GN, ou em meios seletivos (SS,
Hektoen, XLD [xilose lisina desoxicolato], ágar sulfito-bismuto, ágar
MacConckey, EMB ou ENDO).

       As espécies que podem ser encontradas causando gastroenterites são:
Campylobacter pylori, Camppylobacter jejuni, Salmonella, spp; Shiguella, spp;
E. coli (enterotoxinogênica e enteropatogênica), Vibrio cholerae, Vibrio, spp;
Yersinia enterocolitica, Clostridium difficile e Staphylococcus aureus.

COLETA DE AMOSTRAS




     Coletar em recipientes estéreis, de boca larga e que possam ser
hermeticamente fechados.

      Para isolar Shiguella, spp e Neisseria gonorrhoeae, utilizar Swab retal,
sendo que para a N. gonorrhoeae tocar o Swab apenas no esfíncter anal tendo
o cuidado de não entrar em contato com as fezes.
      Para o isolamento de bactérias patogênicas é bom colocar as fezes em
um conservante como o tampão fosfato de sódio ou potássio a 0,033 M mais
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glicerol. Se a suspeita for de Salmonella, spp ou Shiguella, spp, colocar em
caldo selenito ou caldo GN.

São Bactérias Causadoras de Gastroenterites:

1- Campylobacter jejuni subsp. jejuni:

Quadro clínico - dor abdominal, diarréia, vômito, febre, dor de cabeça, mialgia
e artralgia.
Acomete mais indivíduos adultos na faixa etária de 20 a 29 anos.

Transmissão - água e alimentos contaminados.

Coleta - as fezes diarreicas podem ser transportadas à temperatura ambienta
se for para cultivo imediato, caso contrário às fezes devem ser refrigeradas.

Cultura - não cresce a 25 ºC cresce pouco a 37 ºC, mas cresce bem a 42-43
ºC. Requer atmosfera gasosa adequada (2-5 % de CO2); não se deve usar a
jarra de anaerobiose devido à concentração de O2 que é de 12 - 17 % e o
microrganismo em questão necessitam de 3 - 6 % de O2.
O meio mais usado é o Campy-Bap a 42 ºC é microaerófilo (↓O2) e
Capnophilico (↑CO2).
O crescimento da cultura deve ser avaliado em 24, 48 e 72 horas através de
lâminas coradas pelo Gram (bastonetes curvos Gram negativos); pode ser feita
a montagem a fresco para avaliar a presença de motilidade em flecha.

        Se o material vier de ágar não inibidor a 37 ºC fazer uma lâmina corada
pelo Gram e uma montagem a fresco para observar os mesmos aspectos do
microrganismo em estudo, em seguida semear no ágar sangue a 25 ºC,
podendo ou não haver crescimento (no ágar sangue o C. jejuni não cresce a 37
ºC). O C. jejuni hidrolisa o hipurato e é sensível ao ácido nalidixico (30 mg) e à
cefalotina.
Pode-se fazer teste de aglutinação em látex ou Gen Probe (sonda genética), a
partir das colônias.


2- Helicobacter pylori

       É um novo microrganismo associado à gastrite e úlcera gastroduodenal.
Apresenta-se em espiral, porém, é mais semelhante ao gênero Spirillum que ao
Campylobacter, além de apresentar ácidos graxos em sua parede celular que o
difere das outras espécies de Campylobacter.
Tem sensibilidade aos sais de bismuto, produz urease com atividade forte (fator
de patogenicidade), não é muito ativo bioquimicamente, não fermenta
carboidratos, não reduz nitratos e não hidrolisa o hipurato de sódio.

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      A sua morfologia em espiral é vista no tecido gástrico corado pelo Gram,
HE e acridina-orange, mas os melhores resultados foram obtidos com a
coloração da prata de Warthin-Starry.

       Para a cultura é utilizado o ágar chocolate ou o meio ágar Campylobacter
de Skirrow (7% de sangue de cavalo, vancomicina, ácido nalidixico e
trimetroprim). É redutor de nitrato-nitrito variável, cresce na presença de 0,5%
de glicina e cresce à 30ºC, 42ºC.

Outras sps de Helicobacter, spp:
H. cinaedi (swabs retais em homossexuais),
H. fennelliae (swabs retais em homo e bissexuais),
Flexipira rappini (semelhante ao H. pylory), pacientes com ou sem AIDS,
Gastropirillum hominis (gastrite em humanos semelhantes a H. pylori).


3- Shigella, spp

       O gênero Shigella, spp é constituido de quatro sorotipos ou subgrupos:
A) S. dysenteriae, B) S. flexineri, C) S. boydii e D) S. sonnei.
A sorotipagem com antisoros polivalentes ou grupo específicos é o método mais
adequado para identificar um microorganismo isolado que tenha características
bioquímicas e morfológicas parecidas com as da Shigella,spp.

       Os biotipos imóveis e não produtores de gás de E. coli, pertencentes ao
grupo de Alkaligenes dispar, podem se assemelhar às Shiguella, portanto, não
se dispensa a sorotipagem (A - D).
Possuem antígeno ‘’O’’ específico, certas estirpes têm antígenos K (termolábil) e
não têm antígenos H.

       As Shigella, spp permanecem restritas ao TGI (a septicemia é rara), são
lactose negativa, imóveis e não produzem gás a partir da glicose;
As exceções são a S. flexineri sorotipos Newcastle e Manchester, que diferem
dos biogrupos de 1 - 5 por serem indol negativo, arginina negativa e CO2
positivo. Sua identificação bioquímica fica confusa com outros gêneros como
Hafnia alvei, Enterobacter, Providencia e E. coli invasiva. As Shiguella, spp
exigem um maior número de provas bioquímicas devido à quase total
negatividade nestes testes.
Todas as espécies são produtoras de enterotoxinas, mas uma delas , a S.
dysenteriae, produz uma exotoxina conhecida como neurotoxina de Shiga, que
é potente e responsável pela patogenia desta espécie.

      As Shigella, spp causam no homem uma doença debilitante denominada
disenteria bacilar, mas são menos invasivas que as Salmonellas, spp.
As shigeloses podem apresentar-se desde a forma de infecção inaparente,
pequenas infecções com desconforto abdominal e pouca diarréia até a
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disenteria bacilar. O início é súbito com tenesmo, diarréia e febre após um
período de incubação de 1 a 4 dias.

       Todas as Shigella, spp são patogênicas para o homem causando lesões
no TGI (íleo e cólon), lesões no epitélio e mucosa e inflamação aguda com
presença de restos celulares (S. flexineri).
As lesões superficiais do TGI (mucosas) ocorrem devido à ineficiência dos
anticorpos IgG, os quais têm efeito de proteção.

      Há um aspecto a ressaltar sobre a formação de uma pseudomembrana,
nas áreas ulceradas do TGI, composta por restos celulares, bactérias e mucosa
necrosada.

       As fezes devem ser colhidas na fase aguda antes do início do tratamento.
O paciente está sujeito à reinfecção.
O tratamento é feito com cloranfenicol, tetraciclinas (bacteriostáticas) ou
ampicilina. Pode-se fazer a administração de Lactobacillus acydophillus que
acidulam o meio tornando-o impróprio para o crescimento das Shiguella, spp.
A vacinoterapia não tem valor algum.
       As Shiguella, spp são anaeróbios facultativos, crescem bem em
aerobiose. Existem variações coloniais dos tipos lisa (S) e rugosa (R), não
invasiva.


4- Salmonella, spp

       É o gênero mais complexo com 2.200 sorotipos diferentes descritos por
Kauffman-White. Neste esquema elas são agrupadas, em A, B, etc. com base
nos antígenos O (somáticos), e em sorotipos 1, 2, etc. segundo os antígenos
flagelares H. Todos os subgrupos de Salmonella, spp e Arizona, spp são
considerados pertencentes à mesma espécie.

       A contaminação se dá, normalmente, por ingestão de leite, água e
alimentos contaminados por fezes de humanos e animais.
Podem-se obter três tipos clínicos:
1. Gastroenterites - diarréia de leve a fulminante, febre baixa, náuseas e
vômitos;
2. Bacteremia ou septicemia - febre alta com hemoculturas positivas (S.cholerae
suis é a espécie invasiva);
3. Febres entéricas - febra amena e diarréia. Pode ser causada por qualquer
espécie de Salmonella, exceto a S. typhi que causa constipação.

      Nos primeiros 7 a 10 dias as hemoculturas são positivas e o indivíduo
apresenta diarréia sanguinolenta, posteriormente se positivam as culturas de
fezes e urina. O indivíduo continua eliminando o microorganismo após 1 ano de
desaparecimento da clínica.

Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo.
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        As Salmonella, spp são móveis (exceto as aviárias), lactose negativa,
H2S positivo, citrato positivo e uréia negativa.
As espécies de interesse são: S. typhi, S cholerae-suis e S. enteritidis, sendo
que os mais de 2.200 sorotipos pertencem à espécie S. enteritidis.
A Arizona hinshawii mudou de gênero e passou a ser subespécie da S.
enteritidis e é causadora de gastroenterites nos humanos e animais. Existem
outras espécies como S. pullorum (causa diarréia em pintos), S. galinanum, S.
schottmülleri (S. paratyphi A, B, C), porém a taxonomia aceita somente as três
primeiras espécies citadas anteriormente.

Doenças:
1- Febre tifo - S. typhi; (sorogrupo 1).
2- Febre paratifóide no homem - S. paratyphi B; (sorogrupo 1).
3- Gastroenterite aguda no homem e animais - S. typhimurium; (S.enteritidis
sotipo typhimurium)
4- Paratifo em leitões - S. cholerae-suis.

      A identificação sorológica é feita colocando-se uma gota da suspensão
de Salmonella, spp com uma gota de antisoro diluído.

      A S. typhi multiplica-se no tecido linfóide, submucosa intestinal ( placas
de Peyer) e linfonodos regionais, propaga-se para o baço, fígado e medula
óssea e volta ao sangue com liberação de endotoxinas.
A hemocultura positiva na primeira semana, mas na convalescência a
coprocultura fica positiva e o indivíduo fica portador.

      O diagnóstico laboratorial é feito através de hemocultura e reação de
Widal (soroaglutinação com anticorpos anti O e anti H).
A coprocultura tem valia no caso de infecções alimentares; a semeadura é feita
em caldo selenito e depois em ágar SS ou ágar sulfito-bismuto (inibe a E. coli).
A imunidade é duradoura (celular e humoral).

5- E. coli enteropatogênica (EPEC)

       As estatísticas mostram que a faixa etária mais acometida por este
sorotipo vai de 0 a 2 anos.
No intestino delgado forma abcessos localizados, o indivíduo apresenta
tenesmo (calafrios e abdômen endurecidos), as fezes são líquidas e
mucopiosanguinolentas.
Os adultos só são afetados quando debilitados.
A semeadura deve ser feita em ágar simples ou ágar sangue porque os meios
seletivos podem inibir o crescimento de algumas dessas cepas.

6- E. coli enterotoxinogênica (ETEC)

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       Raramente invade a mucosa do intestino delgado ou grosso, mas pode
produzir exotoxina que atua na mucosa intestinal provocando grande liberação
de água.
Essas diarréias são copiosas, não contém sinais de piócitos ou hemácias e têm
como conseqüência desidratação sem febre.
Algumas estirpes de E. coli são produtoras de exotoxinas e contém fímbrias
(fatores de colonização, adesão à mucosa).
As técnicas de ELISA são positivas para antígenos TL e TE.
Em crianças é chamada de ¨cólera infantil¨ e adultos ¨diarréia dos viajantes¨.

7- EIEC (enteroinvasiva)

Invade células epiteliais (febre + colite + diarréia e PMN nas fezes + tenesmos).

8- EHEC (enterohemorrágica)

Elaboração de citoxinas = diarréia com sg e sem febre acompanhada de dor
abdominal.

9- EaggEC (enteroagregativa)

Pode durar até 14 dias o processo diarréico é aquoso e promove desidratação
grave. Este patógeno adere às células epiteliais.


10- Vibrio, spp

        A espécie tipo é o Vibrio cholerae, que foi causa de diarréias
potencialmente graves durante séculos.
A doença leva à diarréia, muitas vezes severas, desidratação e infecções extra
intestinal que podem resultar em septicemia fatal; as fezes ficam líquidas e
acinzentadas podendo ter coágulos.

       As espécies de destaque são: V. parahaemoliticus (frutos do mar
contaminados e mal cozidos), V. mimicus (mariscos) e V. alginolyticus (biotipo 2
do parahaemoliticus feridas e ouvido).
       A cólera clássica, quando aparece, tem como microrganismo responsável
o V. cholerae biotipo El-Tor.

       Os microorganismos podem ser isolados dos vômitos na fase aguda e
para este isolamento é usado o meio TBCS (tiosulfato-citrato-bile-sacrose).
Os Vibrio, spp são flagelados.
O Vibrio cholerare tem 3 sorogrupos: Inaba (EUA, Peru, CHILE, Brasil, Equador
= variedades EL TOR) Ogawa (sudeste da Ásia) e Hikojima.
Pode ser tratado com Tetraciclina.

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       As provas pós-cultura que são confirmatórias para V. cholerae são:
Gelatinase + , aglutinação de eritrócitos de galinha +.


11- Yersinia enterocolitica

Características gerais: bacilo Gram negativo pertencente às enterobactérias.
Espécies: Y. intermedia, Y. fredericksenii, Y. kristensenii (Y. enterocolitica
atípica).

      A manifestação clínica depende do sorotipo, dos fatores genéticos e das
condições do indivíduo. As manifestações primárias são enterites, linfadenite
mesentérica, ileíte terminal, pericardite, pneumonia, etc.; as secundárias incluem
eritema nodoso, púrpuras, artralgias, mono e poliarterites, glomerulonefrites,
doenças da tireóide e tromboses.
Em crianças e adolescentes predominam os sintomas de gastroenterite
mesentérica; as diarréias agudas e artrite acometem mais as pessoas de 20 a
60 anos.

Quadro laboratorial: a semeadura em meios seletivos deve ser feita quando
houver flora mista, podemdo usar o ágar tripticase soja (TSA).
É um dos patógenos entéricos que tem a habilidade de crescer a 4 ºC
(enriquecimento a frio em tampão fosfato).
Os sorotipos O3, O8 e O9 crescem em ágar sulfito-bismuto, MacConckey, SS,
XLD e Hektoen.
Há relatos de contaminação por tranfusão sanguínea e preparados caseiros
com tripas e em alimentos dessa natureza que foram armazenados em
supermercados.

Bioquímica: fermenta a sacarose, uréia, ornitina, lisina e arginina e tem
motilidade a 37 ºC. Podemos utilizar a sorotipagem para confirmar.

Outras sps de Yersinia, spp: Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis
(linfadenite mesentérica em crianças, simulando apendicite.).


12-Clostricium difficile

       É uma espécie toxinogênica que causa enterocolite e diarréia associada a
antibióticos (outra causa rara é o S. aureus).

      É encontrado na água, no intestino de animais, vagina e uretra de
humanos, fezes de crianças e apenas 3 % das fezes de adultos sadios. É muito
encontrado em adultos hospitalizados.



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         Os antimicrobianos aplicados na doença gastrointestinal associada ao C.
difficile incluem penicilina, clindamicina, lincomicina, metronidazol e anfotericina
B.

        Este microrganismo é encontrado associado à colite pseudomembranosa,
doenças intestinais inflamatórias inespecíficas, obstrução e estrangulamento do
intestino. Ele elimina a flora normal por competição e produz a enterotoxina A e
citotoxina B.


13- Staphylococcus, spp

       Provoca intoxicação alimentar, pela enterotoxina que fica incubada de 1 a
8 horas, com náuseas, vômitos e diarréia; a convalescência é rápida e não há
febre.




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Novos gêneros e espécies de enterobactérias que causam infeccões em
humanos:
a) Cedecea davisae: Escarro(VAI)
b) Cedecea lapagei: VAI
c) Cedecea neteri: Hemocultura de paciente com valvulopatia
d) Ewigella americana: sg, escarro
e) Kluyvera ascorbata: sg, urina, fezes (pigmento púrpura escuro)
f) Leclercia adecarboxylata: várias espécimes clínicas,água e comidas
g) Leminorella grimontii: fezes e urina
h)Tatumella ptyseos: escarro
i) Trabusiella guamensis: Fezes (microbiota), não causa diarréia


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j) Yokenella regensburgei (similar a Hafnia alvei): VAS (orofaringe), escarro,
fezes, ferida




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AULA 5




                                         ANTIBIOGRAMA

       O antibiograma continua sendo na atualidade, o método mais utilizado na
determinação da sensibilidade bacteriana devido à sua facilidade de execução,
e mais do que isso, devido à sua boa correlação com resultados obtidos na
prática clínica. Naturalmente, esta boa correlação está em função dos
constantes estudos feitos por um grande número de pesquisadores de profundo
conhecimento sobre a matéria.
Os antibiogramas de antigamente utilizavam três concentrações de um mesmo
disco de sensibilidade, mas hoje, depois de estudos, usa-se uma concentração
só para cada disco.

 INDICAÇÕES, SELEÇÃO DOS DISCOS, INTERPRETAÇÕES E LIMITAÇÕES
                          DO TESTE.

       Os testes de sensibilidade são indicados para qualquer organismo que
contribui para a formação de um processo infeccioso de forma a garantir uma
antibioticoterapia correta. Isto, naturalmente, se não pudermos predizer de
antemão, conhecendo o organismo e a sua normal sensibilidade.

      Os organismos causadores de infecções devem ser identificados quase
que simultaneamente com a realização da prova de sensibilidade. O teste é bem
recomendado para Staphylococcus, spp e Enterobactérias, uma vez que tais
organismos exibem regular resistência aos antibacterianos comumente usados.

       Como já foi dito, alguns organismos possuem sensibilidade conhecida
frente a determinados agentes antibacterianos. Assim, por exemplo, é
conhecida universalmente a aparente sensibilidade, nos EUA, do Streptococcus
pyogenes e Neisseria meningitides à Penicilina.
No entanto, o S. pyogenes originário de um paciente alérgico à Penicilina deve
ser testado frente à Eritromicina e Tetraciclina para que se possa conhecer a
sua sensibilidade.
Cepas de Streptococcus pneumoniae que sejam resistentes à Penicilina são
raramente encontradas, assim sendo, não requerem TSAQ, todavia o método
de discos está estabelecido para estes organismos.


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Os testes de sensibilidade são também indicados nos estudos de resistência
epidemiológica e nos estudos de um novo antibacteriano a ser introduzido, ou
que tenha sido recentemente introduzido, no mercado.

       Recomenda-se que o teste de sensibilidade seja feito de colônias
isoladas e supostamente patogênicas, partindo-se do isolamento primário.
A mistura de diferentes organismos não deve ser submetida ao TSAQ.
A prática de conduzir o teste de sensibilidade diretamente do material clínico
também deve ser evitada, exceto em emergências clínicas nas quais o Gram
direto sugere um único patógeno. Mesmo assim o teste deve ser repetido
segundo determina a metodologia padrão. Quando a natureza da infecção não
for clara e o material biológico contiver mistura de organismos ou flora normal,
sendo que os organismos em questão guardem pouca relação com o processo
infeccioso que está sendo tratado, os testes de sensibilidade são
desnecessários e errôneos.

SELEÇÃO DOS ANTIBACTERIANOS A SEREM USADOS ROTINEIRAMENTE

      Para se fazer um teste rotineiro razoável deve ser limitado o número de
antibacterianos a serem testados. No geral, deve-se testar apenas um
antibacteriano representativo de cada grupo com espectro de ação similar.
Para evitar confusão é recomendado o uso do nome genérico do antibacteriano.
De um modo geral, a seguite recomendação é feita na seleção dos
antibacterianos:

1- Grupo das Penicilinas:




Normalmente é conveniente testar o Staphylococcus, spp frente à Penicilinase
resistente (PCR), tal como a oxacilina.
O Staphylococcus, spp deve ser testado frente à Ampicilina ou Penicilina, mas
não frente às duas.
As enterobactérias devem ser testadas frente à Ampicilina e Carbenicilina.
Proteus, spp e Pseudomonas aeruginosa devem ser testados frente à
Carbenicilina.

      A Penicilina tem na sua estrutura um anel de tiazolidina mais ácido 6-
amino-penicilânico que pode ser clivado por enzimas beta-lactamases,
passando a ácido penicilinóico (inativo).


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O mecanismo de ação das Penicilinas é a inibição da síntese da parede celular
das bactérias através do bloqueio das ligações cruzadas terminais dos
glicopeptídeos lineares nos complexos glicopeptídicos (atua no quarto estágio).
As formas L atuam mais em Gram positivos do que em Gram negativos (exceto
Ampicilina e Carbenicilina).
São produtores de beta-lactamases os: Staphylococcus, spp; Pseudomonas,
spp; Haemophylus, spp e Coliformes.

       A administração é por via oral ou intramuscular, a absorção é rápida e a
excreção se dá pelos rins.
Uso clínico da PG: Streptococcus, spp; Neisserias, spp; Espiroquetas,
Clostridium, spp; Staphylococcus, spp não produtores de beta-lactamases e
bastonetes Gram positivos por via intramuscular; para infecções menores a
administração deve ser por via oral.

         Ampicilina - infecções do TGU por coliformes; 2 a 3g por dia.
         Amoxilina - níveis mais elevados que a Ampicilina.

       As Penicilinas podem causar hipersensibilidade com irritações no SNC
(encefalopatia, delírio e convulsões); o nível de toxicidade é de mais de 30g por
dia. Por via oral causa diarréia.

2- Grupo das Cefalosporinas:




Estão normalmente classificadas em três diferentes grupos: de primeira,
segunda e terceira gerações; como elas têm espectro de ação diferente, deve-
se usar apenas uma daquelas que não se correlaciona com as demais.

       Os Staphylococcus, spp são previsíveis quanto à sua sensibilidade às
Cefalosporinas, exceto as cepas de S. aureus que são Meticilina resistentes
(antibiótico que não tem no Brasil).
Os enterococos são considerados resistentes às Cefalosporinas, porém, eles
podem apresentar-se sensíveis sob certas condições do teste e a cura com
algum antimicrobiano deste grupo poderá ocorrer, contudo, as Cefalosporinas
não devem ser usadas rotineiramente frente a estes microrganismos.

       As Cefalosporinas são isômeros da Penicilina e atuam para Gram
positivas e Gram negativas.
São compostas pelo ácido        7-aminocefalosporânico (em lugar do 6-
aminopenicilânico).
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       Não devem ser usadas em meningites, mas podem ser administradas
para infecções do trato urinário e respiratório.

       Proteus, spp e Klebsiella, spp são Cefalosporinas sensíveis.
       Enterobacter, spp, Serratia, spp e Pseudomonas, spp são Cefalosporinas
resistentes.
       A Cefalordina é nefrotóxica e está sendo retirada do mercado.


3- Grupo das Tetraciclinas:




      As Tetraciclinas apresentam boa correlação na rotina laboratorial,
contudo, algumas bactérias podem apresentar-se mais sensíveis à Doxiclina e
Minociclina (novas), sendo que a Clortetraciclina é a mais instável. São
absorvidas pelo trato intestinal, têm pouca ação no LCR e as mais novas têm
uma excreção mais lenta.

       O seu modo de ação é a inibição da síntese protéica pela inibição da
ligação do amino-ARN-t com as unidades 30s dos mini-ribossomos bacterianos.
São bacteriostáticos e são drogas de primeira escolha para os casos de
Clamidia e Mycoplasma, mas estimulam o aumento das leveduras.
Existem, ainda, Staphylococcus, Proteus e Pseudomonas resistentes às
Tetraciclinas. Têm médio espectro de ação.

      Apresentam como sintomas de toxicidade distúrbios gastrointestinais e
erupções cutâneas; em gestantes causa danos hepáticos e crianças podem
apresentar alterações na cor dos dentes.

4- Cloranfenicol:




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       Distribui-se facilmente no SNC e LCR e ainda penetra nas células, mas é
inativado no fígado quando está associado ao ácido glicurônico.

      Tem como modo de ação a inibição da síntese protéica dos
microrganismos, sendo, portanto, bacteriostático.
Atua bem em Neisseria (pacientes sensíveis à Penicilina), Salmonella,
Haemophylus e bactérias anaeróbias.

       A resistência se dá através da enzima cloranfenicol-transferase.
       Os efeitos colaterais: distúrbios no TGI, aumento do ferro sérico e anemia
aplástica; em recém-nascidos e prematuros provoca a síndrome da medula
cinzenta. No TSAQ usa-se somente um disco.


5- Macrolídeos:




         Na prática atual só a Eritromicina necessita ser testada.

         Têm como modo de ação a ligação às subunidades 50s dos ribossomos.

      A Eritromicina é utilizada nas VAS e em infecções por Corinebacterium,
spp (C. minutissimum causadora de eritrasma);
A Espiramicina é usada nas VAS, a Oleandomicina nas VD, a Trioleandomicina
nas VAS e a Leucomicinas nas VAS e VD.




6- Aminoglicosídeos:




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      É neste grupo de antibióticos que estão incluídos a Amicacina,
Gentamicina, Canamicina, Netilmicina, Tobramicina, Sizomicina, Ribostamicina,
Dipecacina e Espectinomicina.

       O espectro de ação deles não é idêntico o suficiente para assegurar a
resistência cruzada.
Contém atividades bacterianas tóxicas.
O seu modo de ação é a inibição da síntese protéica das bactérias. São ativos
em pH alcalino, ototóxicas e nefrotóxicas, são carregados positivamente, e em
hemoculturas são inibidos pelo sulfonato polietanetol de sódio e outros
detergentes.

       As bactérias Gram negativas (enterobactérias) e as anaeróbias são
resistentes aos aminoglicosídeos, mas eles são usados em septicemias e em
Gram negativas.

Particularidades:
# Canamicina - é menos tóxica do que a Amicacina, bactericida para Gram
negativas (exceto Pseudomonas, spp e Serratia, spp) e é nefro e ototóxica.
# Amicacina - derivado sintético da Canamicina, no SNC atua sobre bactérias
Gram negativas entéricas ou não (Pseudomonas), é nefro e ototóxica (oitavo par
craniano).
# Neomicina - tópica e das VD, é nefro e ototóxica.
# Gentamicina - é bactericida para Gram positivas e Gram negativas (Proteus,
spp; Pseudomonas, spp e Serratia, spp), os Staphylococcus, spp e bacterióides
são resistentes, é altamente nefrotóxica. Tem uso tópico em queimaduras e
lesões cutâneas.
# Tobramicina - é ativa contra Pseudomonas, spp e é nefro e ototóxica. Não
deve ser usada com diuréticos porque potencializa a ação desta droga.
# Estreptomicina - é um bactericida (inibe a síntese proteica) bom para
Mycobacterium tuberculosis (BK), Gram negativas e Gram positivas. É muito
ototóxica. Pode ser associada à Isoniazida.
# Espectinomicina - usada em infecções gonocócicas (gonorréia) = Tobricin.




7- Lincomicina e outras drogas:




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      O ideal é testar somente a Clindamicina (derivado clorado da
Lincomicina) para Gram positivas e infecções ósseas provocadas por
Bacterioides fragilis Staphylococcus, spp.

# Clindamicina - para anaeróbios e Bacterioides fragilis.
# Vancomicina - bactericida para enterococos e Staphylococcus, spp em
infecções sistêmicas. Pode cauasr surdez e dano renal.
# Novobiocina - bacteriostática que inibe a síntese de ADN e ácido teitóico
(membrana celular). É ideal para cocos Gram positivos, inclusive os produtores
de beta-lactamases, e bacilos Gram negativos (Proteus, spp).
# Rifamicina - inibe a síntese de ARN (bactérias e Clamydia, spp); na
tuberculose é utilizada associada ao Etambutol.

      Antibióticos de uso tópico: Neomicina, Bacitracina, Furacin, Gentamicina
(quimioterápico que atua em membrana e mucosa) e Nebacetin (bactericida
para Gram positivas).

# Polimixina-B e Colistina - polipeptídicos bactericidas para bacilos Gram
negativos (Pseudomonas, spp). Seu modo de ação é envolver a membrans
celular da bactéria e destruir sua função osmótica (detergentes catiônicos).

8- Quimioterápicos:

# Nitrofurantoína - para Gram positivas e Gram negativas;
# Furadantina - atua nas VGU;
# Furacin - uso tópico;
# Furoxona - uso nas VD;
# Ácido nalidixico - VD e VGU;
# Ácido oxolínico - VGU;
# Ácido piperanídico - VGU;
# Metronidazol - VGU e VAS;
# Terizidona - VGU;
# Sulfonamidas - uso sistêmico;
# Sulfametaxazol-trimetoprim (Bactrim) - serve para fazer associações e para
uso sistêmico.


LIMTAÇÕES DO MÉTODO

       O teste com os discos foi padronizado para organismos de crescimento
rápido tais como Enterobactérias, Staphylococcus, Pseudomonas, Acinetobacter
e algunas Streptococcus, sendo que foi modificado para testar Haemophylus,
Neisseria e S. pneumoniae.

       Os estudos nesta área não permitiram, ainda, uma padronização definitva
para outros organismos que requerem condições anaeróbias para crescimento
lento em ágar Müller-Hinton, ou ainda, para aquelas bactérias que apresentam
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taxa de crescimento diferente de cepa em cepa; estes microrganismos não
devem ser testados pelo método de discos.

OBSERVAÇÒES SOBRE O MEIO DE CULTIVO

      A adição de fosforilase, ou mesmo sangue lisado de cavalo, pode
melhorar a difusão e auxiliar assim a confiança nos testes com Sulfonamidas e
Trimetoprim com a maioria dos patógenos, exceto entrococos.

      A variação de íons Ca e Mg podem afetar resultados com Tetraciclina,
Polimixina e Aminoglicosídeos frente a Pseudomonas aeruginosa.

     Cepas que não crescem em ágar Müller - Hinton deve-se acrescer
sangue de carneiro a 5 % desfibrinado.

       Ágar chocolate (com sangue de carneiro) não serve para fazer TSAQ de
Haemophylus, mas serve se acrescer 1 % de hemoglobina e um suplemento
tipo Isovitaex (fator X e V) ou suplememnto sintético equivalente com pH ideal
de 7,2.




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AULA 6




                                  CULTURA DE ESCARRO
       Em laboratório clínico a pesquisa do escarro se destina à pesquisa de
vários microrganismos que podem causar infecções na árvore brônquica e
provocar secreções sanguinolentas ou não.
       As principais bactérias pesquisadas no escarro são: Mycobacterium
tuberculosis (BAAR), Streptococcus pneumoniae, Haemophylus influenzae,
Leigionella pneumophilla, Staphylococcus aureus e Fusobacterium nucleatum.
A coleta pode ser feita através de aspirado brônquico ou punção transtraqueal.

1- Mycobacterium tuberculosis

     Quando o escarro chega ao laboratório, vários exames relacionados com
BAAR podem ser solicitados: cultura, inoculação ou simplesmente o TSAQ.

1.1 - Coleta: escarro espectorado, colhido por nebulização ultrasônica ou por
aspirado brôquico, logo pela manhã após o despertar preferencialmente sem
assepsia bucal.
As culturas podem se positivar ou se negativar com facilidade, por isso, faz-se
necessário à coleta de três a cinco amostras, no mínimo (no princípio da
manhã).
Estas amostras devem ser refrigeradas e, no caso de amostras com flora
bacteriana mista, deve-se fazer a descontaminação (liquefação do muco e
impedimento no crescimento de bactérias contaminantes).

1.2 - Descontaminação: é feita com NaOH ou NALC (N-acetil-L-cisteína). O
NALC é mucolítico sem atividade bacteriana (destrói as ligações dissulfeto); com
a liquefação, as bactérias podem sedimentar com mais facilidade na
centrifugação, que é o próximo passo.
O NaOH a 2% (ou 3% em climas quentes) é o agente descontaminante.
A neutralização do agente descontaminante pode ser feita com HCL ou NaOH
concentrado.
       O NALC é vantajoso porque tem tampão fosfato que lava a amostra e
mantém o pH ideal de diluir as substâncias tóxicas.
A centrifugação deve ser feita a uma alta rotação (3800 rpm), o que possibilita a
melhor pesquisa de bacilos em lâminas e maior positividade das culturas. Os
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lípides da parede celular das micobactérias estão em alta porcentagem, potanto,
abaixam a densidade dos organismos, justificando assim o uso de alta rotação
para a obtenção de melhores resutados.

Técnica:
* 10 ml de escarro em frasco estéril;
* colocar o escarro em tubo de centrifugação com capacidade para 50 ml;
* adiciona-se 10 ml de NALC mais NaOH a 2%;
* agitar e deixar em repouso por 15 minutos (descontaminação);
* homogeneizar com 30 ml de tampão fosfato com pH 6,8 (neutralização);

Precauções:
Não se recomenda o uso de Swabs para a coleta de micobactérias porque os
lípides da parede celular são hidrófobos e inibem a transferência das bactérias
dos Swabs para os meios aquosos. Se os Swabs forem utilizados, devem ser
deixados em contato com o meio por quatro semanas. Como as amostras são
extremamente perigosas, utilizar todas as medidas de segurança.

1.3 - Cultura: o meio mais empregado (considerado seletivo para micobactérias)
é o de Lowestein-Jensen, modificado por Gruft, que contém ovos inteiros
coagulados, sais, glicerol, farinha de batata e RNA-5 mg/100 ml; tem como
agente inibidor descontaminante o Verde de Malaquita (0,025g/100ml),
Penicilina (5ug/ml) e ácido nalidixico (35 mg/ ml).
Existem outros meios, tais como: Lowestein-Jensen com Cicloheximida,
Midlebrook 7H10 (usado para TSAQ) e 7H11 (seletivo de Mitchisen).

1.4 - Coloração: coram-se bem pela fucsina e descoram-se por solução álcool-
ácido. Precisa da presença de 10.000 bacilos/ml para que possam ser
detectados pelo microscópio ótico. Existe uma boa correlação entre esfregaço
positivo e cultura positiva; quando o paciente sofre antibioticoterapia as culturas
negativam primeiro que os esfregaços (impede a replicação, mas não a
combinação com o corante).
O número de bacilos do escarro informa sobre a resposta imune e o tratamento.
As técnicas mais usadas são:
* Ziehl-Neelsen - tem como corante de contraste o azul de metileno; as bactérias
coram pela fucsina e resistem ao descoramento pela solução álcool/ácido.
* Kinyoun - azul de metileno como corante de contraste; fucsina em maior
quantidade para corar as bactérias e a solução álcool/ácido para descorar.
* Flourocrômica - auramina fenólica, álcool/ácido e permanganato de potássio
como contraste.



Método para relatar o número de BAAR observados em esfrgaços corados:

 Número BAAR observados                                      Método de relatar do CDC

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1 a 2 em 300 campos                         Núm observ. ( + / - )
1 a 9 em 100 campos                         Núm médio/10 campos      (1+)
1 a 9 em 10 campos                          Núm médio/10 campos      (2+)
1 a 9 por campo                             Núm medio/campo          (3+)
mais de 9 por campo                         Mais de 9/campo          (4+)

      Quando a pesquisa de BAAR for negativa, o método de liberação relatado
pelo CDC é: negativo para BAAR.




1.5 - Identificação de Mycobacterium tuberculosis:
        * Temperatura ótima e tempo de crescimento - as micobactérias crescem
melhor a uma atmosfera de 3 a 11 % de CO2 sob a temperatura de 37 ºC,
sendo que a 30 ou 42 ºC o seu crescimento é considerado fraco.
No meio a base de ovo crescem em doze dias (seis ou mais semanas para
cepas ocasionais).
Existe um tipo de subcultivo feito em caldo 7H11 mais Tween 80 (polissobato)
com uma diluição de 1:100, semeadura em estrias para colônias isoladas; o M.
tuberculosis tem crescimento lento enquanto que o M. fortuitum tem crescimento
rápido.

      * Produção de pigmentos - depende do fato de haver ou não exposição à
luz ambiente (envolver o tubo com papel alumínio para evitar exposição).
O M. tuberculosis não produz pigmentos, exceto uma cor camurça, mesmo
quando exposto à luz intensa; Runyon separou as micobactérias atípicas de
acordo com a sua fotorreatividade e produção de pigmentos.

     Grupo de Runyon                         Pigmentos     Organismos
I - Fotocromogênicas                 Carotenóide amarelo
                                                (luz M. kansasii
                                     forte)          M. marinum
                                                     M. simiae
                                                     M. szulgai
II - Escotocromogênicas Amarelo brilhante (luz ou M. scrofulaceum
(escuras)               escuro; intensifican a cor M. gordonae
                        quando expostas à luz)       M. flavescens
                                                     M. xenopi (42 ºC)
                                                     M. avium - intracellulare
                                                     (complexo)
III        -       Não Pouco pigmento amarelo M. malmoense
fotocromogênicas        claro que não intensifica a M. terrae
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                                     cor com a luz.            M. gastri
                                                               M. nonchromogenicum
                                                               triviali (complexo)
                                                               M. haemophilum
IV - Crescimento rápido              Pigmento amarelo intenso M. fortuitum
                                     (crescem em 3 a 5 dias e M. chelonae, philey
                                     causam infecções cutâneas M. smegmatis
                                     ou oculares em pacientes
                                     imunossuprimidos)


       * Acúmulo de niacina - o M. tuberculosis não converte a niacina livre em
niacina ribonucleotídea provocando o acúmulo de niacina hidrossolúvel em meio
à base de ovo. No mercado existem algumas tiras de papel de filtro com
reagente, a produção de cor amarela no meio indica positividade.

         * Redução do nitrato a nitritos - a bactéria tem nitroredutase, no meio tem
nitrito; adiciona-se sulfonilamida alfanaftilenodiamina (corantes vermelhos).

      * Catalase - é uma prova diferente das outras provas de catalase; 30 %
de peróxido de hidrogênio mais Tween 80 a 10 % (detergente - ajuda na
dispersão das bactérias). Pingar uma a duas gotas sobre a colônia e dá
formação de bolhas.

       A prova da aril-sulfatase é usada na diferenciação entre os grupos III e IV
de Runyon. A formação de cor rosa no substrato, próximo ao crescimento
bacteriano, após a adição de carbonato de cálcio - fenolftaleína livre - é uma
prova positiva para micobactérias patogênicas para o homem ( M. kansasii, M.
szulgai pulmonar e extra-pulmonar, M. malmoense e M. haemophilum).

1.6 - Prova de sensibilidade – TSAQ: as micobactérias têm resistência
aleatória às drogas, mesmo sem serem expostas a estas drogas; os pacientes
são, então, tratados com duas ou três drogas devido ao aparecimento de
mutantes resistentes.
O TSAQ é recomendado quando o paciente sofre reicidiva durante a
quimioterapia.
É aconselhável manter uma cultura de seis meses a um ano para o caso do
paciente não responder à terapia.


Concentrações das drogas (mg/mL) usadas em meios de cultura.

      DROGA                                                  CONCENTRÇÃO
Tuberculostáticas                             MEIO DE LOW.-JEN.     MEIO 7H11
Isoniazida (INH)                                   0,2 - 1,0         0,2 - 1,0
Ác. para-amino-salicílico (PAS)                       0,5               8,0
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Estreptomicina                                             4,0        2,0
Rifampicina                                               40,0        1,0
Etambutol                                                  2,0        7,0
Etionamida                                                20,0       10,0
Canamicina                                                20,0        6,0
Capreomicina                                              20,0       10,0
Cicloserina                                               30,0       30,0
Pirazinamida                                               NT         NT

     * Prova direta: escarro pre-diluído e não diluído, colhido direto na placa,
com bacterioscopia positiva.

       * Prova indireta: bacterioscopia realizada de uma colônia vinda de uma
cultura pura isolada a partir da amostra clínica.

       O TSAQ direto é mais rápido (de três a quatro semanas) e o indireto mais
demorado (cinco a sete semanas), mas a direta só é bem sucedida quando há
muitos bacilos no material.
As placas de Petri são divididas em quatro quadrantes, sendo que cada
quadrante terá 5,0 ml de ágar: o primeiro não contém antimicrobianos
(contraste), o segundo, terceiro e quarto terão concentrações variáveis da droga
a ser avaliada (PAS, INH, Etambutol ou Rifampicina).
O método de discos é eficaz e simples.


2- Legionella, spp




       Exitem várias espécies relacionadas à pneumonia e, consequentemente,
o material clínico usado é o escarro ou aspirado brônquico.
Podem ser encontrados esfregaços positivos pela coloração de Ziehl Neelsen,
mas também pode-se fazer esfregaços fixados pelo metanol e corados pelo
Gram.
As espécies que causam pneumonia são: L. micdadei, L. dumoffii, L. bozemanii,
L. longbeachae e L. pneumophila.
O método mais sensível para a detecção de Legionella, spp é o teste de
anticorpo fluorescente direto (DFA) que, quando realizado no escarro, pode ser
considerado positivo se forem encontrados de 1 a 5 microrganismos.



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      A cultura é feita em BCYE a 35 ºC em 5 a 10 % de CO2, (exames diários
durante duas semanas), em 2 a 3 dias crescem colônias puntiformes, brilhantes,
convexas, circulares ou pouco irregulares e com borda contínua.
Apesar de serem bastões Gram negativos, não crescem em ágar Mac Conckey.
Após crescimento pode-se fazer a prova de DFA para confirmar isolamento
presuntivo. Tem-se, ainda, a IFI no soro.


3- Haemophillus influenzae

       A doença é geralmente crônica com exacerbação purulenta periódica.
       O paciente apresenta tosse improdutiva persistente, sibilo, dispinéia e
respiração asmática característica.
O material para exame é o escarro, lavado brôquico (bronquite) ou aspirado
transtraqueal.
A pneumonia por H. influenzae tipo B tende a ter distribuição lobar ou segmentar
simulando uma pneumonia pneumocócica.

Provas para H. influenzae:

# esfregaços corados pelo Gram - centrifugar a amostra antes de fazer o
esfregaço a partir do sedimento. Podem aparecer cocobacilos Gram negativos
(podem corar de vermelho-laranja) característicos como filamentos
pleomórficos.
# esfregaços corados pelo Azul de metileno - coram-se em azul escuro a negro.
# prova de Quellung (intumescimento de cápsula) - colocar uma gota de anti-
soro de H. influenzae tipo B, adicionar uma gota da amostra clínica (ou
suspensão colonial) e um pouco de solução de azul de metileno; quando
positiva confirma a identificação.
# detecção de anticorpos específicos capsulares - 5 minutos.
# ELISA
# aglutinação em látex e em lâmina.

        Existem 464 cepas diferentes de H. influenzae, sendo que os biotipos II e
III são os mais isolados em culturas de escarro e material ocular em crianças de
1 a 5 anos.

       Os Haemophilus requerem fatores X, V e NAD para seu crescimento.
Estes fatores são vendidos comercialmente em discos de papel que são
aplicados sobre o ágar inoculado que em seguida é incubado na estufa por 24
h. Observar o crescimento ao redor do disco.

       Procedimento - cultura a identificar é colocado e em seguida em ágar de
Haemophilus, spp ( BHI).
Se for feito no Müller-Hinton colocar uma tira de fator X (hemina), outra de fator
V e NAD sobre o ágar (1,0 cm de distância), incubar e fazer leitura:

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1- H. aphrophilus - requer somente fator X
2- H. parainfluenzae - requer somente fator V
3- H. influenzae - requer fatores X e V

4- Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus e Streptococcus
pneumoniae.

         Já foram vistos em aulas anteriores, bem como suas triagens.

OBSERVAÇÃO:               microrganismos          anaeróbios         podem   causar   pneumoniae
necrotizante.




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AULA 7




                                 EXSUDATO DE OROFARINGE

        As infecções na cavidade oral podem acontecer também na cavidade oral
anterior (tendo como exemplos as gengivites marginais, gengivo-estomatites
cremosas ou gengivites úlcero-necrotizantes).
As patologias da cavidade oral posterior estão intimamente relacionadas com
faringites, amigdalites, epiglotites, coqueluches, difteria, infecções nas paredes
laterais ulceradas, glossites e infecções herpéticas.


GENGIVITES

1- Gengivites marginais - acontecem às margens da gengiva, próximas aos
dentes; é mais comum pela perda do suporte ósseo do dente criando bolsas
dentárias (fendas gengivais e ósseas ao redor dos dentes). Isto promove maior
acúmulo de bactérias e resíduos e a formação de cálculos levando à perda do
dente.
       Os exsudatos são purulentos, acompanhados de edema e de dor.
       Os agentes são, normalmente, os Streptococcus mitis ou S. salivarius. O
diagnóstico laboratorial é feito através da triagem para Streptococcus, spp.

2- Gengivite aguda - frequentemente se refere a esta afecção como gengivite
ulcerativa necrozante aguda (GUNA) ou angina de Vincent (gengivite + infecção
de garganta associada à Fusobacterium, spp + Treponema, spp ou Borrelia,
spp).
Não obedece a qualquer poder etiológico e não existe nenhuma evidência de
que seja contagiosa, mas está frequentemente associada a organismos
fusiformes (Fusobactérias, Borrelia, spp ou Treponema de Vincent).

       Quadro cliínico: infecção aguda associada à dor, odor fétido com
ulcerações na boca e gengivas; pode haver sangamento sem febre e com
linfadenopatia. Assemelha-se a gengivites causadas por discrasias sangüíneas
ou infecções virais.



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       Quadro laboratorial: faz-se exame direto do esfregaço com carbofucsina
diluída (corante de Ziehl-Neelsen diluído com 10 a 15 volumes de água
destilada) por quinze segundos.
O diagnóstico é feito pelo encontro de muitos espiroquetas e bacilos fusiformes
em meio a numerosos piócitos.
A cultura não é necessária para o diagnóstico desta infecção. As bactérias
desse tipo de infecção são anaeróbias.

       O tratamento é feito com Penicilina (1.000 a 1.500 mg/dia) ou Eritromicina
como droga de segunda escolha.
Observando sempre uma boa higiene não haverá reicidiva.
Ë uma infecção que atinge mais adultos do que crianças sendo os fatores
predisponentes a má higiene bucal e doença sistêmica.
Quando a infecção chega à faringe esta é recoberta por uma pseudomembrana
fina, amarelo-acinzentada.
A coleta é feita com um Swab seco e o procedimento laboratorial é o mesmo da
GUNA.


3- Gengivo-estomatite cremosa - há formação de porções esbranquiçadas
sobre a gengiva suspeitando-se, quase sempre, de uma infecção por Candida,
spp.
Pelo Gram podem-se encontrar células leveduriformes e algumas pseudohifas
Gram positivas no exudato.
A cultura feita no Sabouraud ou ágar batata que é exame confirmativo.
O tratamento é feito com Nistatina (Micostatin oral).


FARINGITES E AMIGDALITES (TONSILITES)
      Os principais agentes etiológicos destas infecções na faringe e amígdalas
são de origem bacteriana, sendo o S. pyogenes, flora normal faringeana de
pessoas sadias, citado como o mais importante dos agentes.
Este fato dificulta a diferenciação entre a doença e a colonização por este
agente.

       No que se refere à lesão diftérica e estomatites, estas podem atingir a
faringe, portanto, o estudo laboratorial para a detecção desses agentes
etiológicos   deve    ser   feito   quando     houver    evidências  clínicas.
       Microrganismos, tais como H. influenzae tipo B e S. pneumoniae são
frequentemente identificados no laboratório como agentes de faringites, muito
embora possam fazer parte da flora normal.

       Quando os pacientes estão hospitalizados, podem ser encontrados
bacilos Gram negativos, como Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella


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pneumoniae, porém, não são patógenos orofaringeanos e não devem ser
relatados.

       Existam várias bactérias que podem causar infecções na orofaringe: S.
aureus, Micobacterium gengivalis e M. hominis (BAAR), Corynebacterium
diphteriae, N. gonorrhoeae e Actinomyces, sp (anaeróbio).
A N. meningitides não é considerada como agente etiológico das faringites. Hoje
em dia a faringite gonocócica é mais rara devido aos hábitos sexuais; por outro
lado, é fundamental que o médico informe especificamente ao laboratório de
que há suspeita de infecção gonocócica. Apenas nesses casos o material da
garganta deverá ser semeado em meios de cultura especiais para N.
gonorrhoeae (ágar chocolate em anaerobiose).

       O procedimento laboratorial depende do quadro da bacterioscopia direta,
que vai indicar a predominância do agente etiológico.
É necessário observar bem a morfologia das bactérias para uma triagem correta
e isolamento fidedigno.
A presença de cocos Gram negativos riniformes na orofaringe de crianças de 0
a 6 anos não sugere infecção gonocócica, pois, na flora normal dessas crianças
há N. catarrhalis, que simula um quadro gonocócico.

       Existem bactérias filamentosas, Gram positivas, que podem ser
encontradas na cavidade oral e que causam algumas infecções faringeanas
(Actinomyces, spp que são anaeróbias).
O ideal é que quando estejamos frente a algumas infecções de orofaringe,
façamos lâminas para corar pelo Gram, Ziehl-Neelsen e Fontana-Tribondou.

        A difteria é uma infecção aguda causada por cepas toxigênicas, que são
bacilos Gram positivos pleomórficos e claviformes (Corynebacterium diphteriae).
Estes bacilos apresentam coloração uniforme e, quando em cultura velha,
descoram-se facilmente. Possuem grânulos de reserva de polimetanofosfato, os
quais são metacromáticos e conhecidos como corpúsculos de Volutina ou de
Babes-Ernst.
As cepas toxigênicas são lisogenizadas pelo fago beta e produzem uma toxina
(sintetizada no local da infecção) que é absorvida e transportada por via
hematogênica, causando efeitos tóxicos no coração e nervos periféricos.
Os bacilos multiplicam-se na superfície das mucosas onde produzem a toxina
que necrosa os tecidos adjacentes, provocando uma resposta inflamatória com
formação da chamada pseudomembrana diftérica, composta de bactérias,
epitélio necrosado, fagócitos e fibrina. O seu aparecimento ocorre, inicialmente,
nas tonsilas ou faringe posterior, podendo atingir o palato e região nasofaríngea,
laringe e traquéia.
A difteria laringeana é, particularmente, perigosa devido à possibilidade de
asfixia.
A difteria cutânea é comum em regiões tropicais, mas tem-se observado o seu
crescimento em outras regiões. Acredita-se que pesquisas rotineiras de C.
diphteriae de lesões de pele poderão revelar alta incidência desta bactéria,
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determinando a pele como importante reservatório deste microorganismo. A
difteria assemelha-se muito à angina de Vincent, sendo diferentes apenas no
laboratório.

Diagnóstico laboratorial:

# Coleta do material - colhe-se com Swab que devem ser inoculados em meio
de Loeffler ou Tinsdale para posterior encaminhamento.

# Bacterioscopia - colorações em Gram, Albert Layborn e Azul de metileno de
Loeffler. No Gram visualizam-se bacilos diftéricos pleomórficos Gram positivos.
Em Albert Layborn, bacilos esverdeados com granulações de Volutina.
Pelo corante de Loeffler, bacilos róseos.

# Isolamento e identificação - os meios utilizados são: Tinsdale (com telurito
de potássio), Loeffler e ágar sangue (para outros microorganismos como o S.
pyogenes), incubados a 37 ºC por 6 a 18 horas. Após a semeadura no meio de
Loeffler, devem ser feitos esfregaços do crescimento bacteriano, os quais são
corados pelas técnicas já citadas.
Para o isolamento das colônias suspeitas, as mesmas devem ser repicadas em
meio Tinsdale. Neste meio as colônias de C. diphteriae são lisas, de cor cinza
escuro, brilhantes e convexas com coloração marrom, não se prestando, porém,
para colorações, testes imunoquímicos ou toxigenicidade, necessários para a
identificação definitiva. Para tanto, as colônias típicas isoladas no Tinsdale,
devem ser novamente repicadas em meio de Loeffler para posterior
caracterização.
As características do bacilo diftérico são: catalase positiva reduzem nitratos, não
hidrolizam uréia, glicose e maltose positivas, CO2 positivo, sacarose e trealose
negativas.

      Outro meio que pode ser usado é o CT (cistina e telurito) que é melhor e
mais duradouro do que o Tinsdale.

# Pesquisa de toxina diftérica - In Vitro, a prova de Elek e In Vivo a prova de
letalidade em cobaias. As provas devem ser padronizadas e o técnico bem
treinado.

      Espécies de interesse: C. diphteriae, C. ulcerans, C. haemoliticus, C.
aquaticum, C. pseudodiphteriticum (hoffmanii), C. xefrosis, C. pyogenes renale,
C. pseudotuberculosis (ovis) e C. bovis.

     Observações: O C. ulcerans pode causar faringite pseudomembranosa,
porém, não produz toxina.




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AULA 8




            DOENÇAS SEXUALMENTE TRANSMITIDAS – DST.

INTRODUÇÃO

       As DST exigem uma transmissão por contato direto íntimo representado
pelo coito.
É difícil determinar quando a promiscuidade sexual, prostituição por excelência,
passou a ser estigmatizante, mas, seguramente, a estigma passou a
acompanhar as doenças a elas ligadas.
A partir do último quarto do século passado, os diferentes quadros e seus
diferentes agentes passaram a ser identificados. A multiplicidade de variações
sexuais tem proporcionado não só um novo mecanismo de transmissão para
doenças classicamente não relacionadas, mas também a disseminação das
venéreas. Dessas considerações de longa data a União Brasileira contra
doenças venéreas tem visto a denominação de DST não como uma expressão
apenas estigmatizante, mas uma visão epidemiológica nova para um problema
antigo. Vemos nas DST um grupo de doenças endêmicas de múltiplas causas
que incluem as doenças venéreas em um número crescente de entidades
clínicas e síndromes que tem como traço comum a transmissão durante a
atividade sexual.




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GONORRÉIA




     Tem como agente a Neisseria gonorrhoeae.
     A contaminação pode ser sexual e acidental; está em 1° lugar entre as
DST, tendo como faixa etária mais acometida entre 15 e 30 anos e
predominando no sexo masculino.

Causas de manutenção da endemia:
1) Fatores relacionados com sexo (promiscuidade sexual, homossexualismo,
prostituição etc);
2) Atitude pública (indiferença ao contágio e auto medicação);
3) Fracasso das autoridades sanitárias;

Período de Incubação:
O período de incubação é de 2 a 10 dias; existem relatos de 24hs e casos que
ultrapassam 15 dias.

Agente Etiológico:




São cocos gram negativos riniformes agrupados 2 a 2 com faces côncavas,
aeróbios, imóveis, sensíveis a antissépticos e morrem fora do habitat. São intra
e extra celular e suas características morfotintoriais podem estar alteradas nos
processos crônicos ou após antibioticoterapia.
A característica extra celular é da fase aguda. Foi determinado recentemente o
fator R (plasmïdio de resistência às drogas) e os achados mais recentes são as
cepas capsuladas.
É uma doenças exclusiva de seres humanos.

Meio de Cultura:
1) Ágar Sangue (não hemólise);
2) Ágar Ascite;
3) Ágar Chocolate;
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  • 1. Universidade Católica de Goiás UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GOIÁS CURSO DE BIOMEDICINA MICROBIOLOGIA I Profa. CLÁUDIA MARIA DUQUE DE SOUZA Profa. EDLAINE RODRIGUES MONTALVÃO Profa. Cláudia Maria Duque de Souza
  • 2. Universidade Católica de Goiás Universidade Católica de Goiás Curso: Biomedicina Disciplina: Microbiologia I Professora: Cláudia Maria Duque de Souza PROGRAMA: 1- Objetivo geral: A disciplina Microbiologia I visa, fundamentalmente, demonstrar as técnicas bacteriológicas, princípios dessas técnicas, identificação dos gêneros e espécies e suas patologias, bem como capacitar o estudante para a pesquisa e reconhecimento desses microrganismos. 2- Objetivos específicos: Habilitar o aluno de bacteriologia para a pesquisa, reconhecimento e diferenciação dos microrganismos normais e patogênicos nas diferentes partes do organismo humano, tais como: orofaringe, pele e anexos, aparelhos auditivo, visual, gastrointestinal e genito-urinário. Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 2 de 87
  • 3. Universidade Católica de Goiás MICROBIOLOGIA I - CBB 3641 - 4 CRÉDITOS CONTEÚDO: 01 - Normas de coleta, transporte e armazenamento das amostras das diferentes áreas anatômicas. 02 - Microbiota 03 - Urinocultura. 04 - Coprocultura. 05 - Antibiogramas (TSAQ) 06 - Cultura de escarro. 07 - Cultura de exsudato de orofaringe. 08 - DST (Gonorréia, Sífilis). 09 - DST (Cancro mole, LGV e Donovanose). 10 - Cultura de exsudato do aparelho da visão. 11 - Cultura de lesões cutâneas e anexas. 12 - Diagnósticos laboratoriais da Hanseníase 13 - Hemocultura e Líquidos corporais. Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 3 de 87
  • 4. Universidade Católica de Goiás BIBLIOGRAFIA 01. Jawetz, Ernerst. Microbiologia Médica. Guanabara Koogan. 02. Bier, Otto. Microbiologia e Imunologia. Melhoramentos. 03. Pelczar, Reid e Chain. Microbiologia Vol I e II. McGraw-Hill do Brasil. 04. Moura. Microbiologia Clínica. Mc Will Editores. 05. Korting e Gunnter. Dermatologia. Editora Manole. 06. Cecil. Tratado de Medicina Interna. Guanabara Koogan. 07. Dowell, Allen e Koneman. Diagnóstico Microbiológico. Panamericana. 08. Neto, Amato e V. et al. Antibióticos na prática médica. Gnemed. 09. Parage, R. Microbiologia Clínica. Panamericana. 10. Miname. Micologia, Diagnóstico Laboratorial das Micoses. 11. Reese, Richard E, Sentochnik, Deborah E., Douglas Jr, R. Gordon e Betts, Robert F. Manual de Antibióticos. 12. Roitman, Isaac, Travassos, Luiz R. e Azevedo, João Lúcio. Tratado de Microbiologia. 13. Mac Faddin. Pruebas bioquimicas para la identificacion de bactérias de importância clínica. Panamericana. 14. Lennete, Balows, Hausler e Shadony. Manual de Microbiologia Clínica. 15. Hentges, David J. Medical Microbiology. 16. Fundemberg, Hugh. Microbiology and Imunology, a positive statement manual. Guanabara Koogan. 17. Delost, Danessa Maria. Introduction to diagnóstic Microbiology, Mosby, 1997. 18. Rowland, S. Sharon. Pathogenic and Clinical Microbiology. Little, Brown and Company, 1994. 19. Crissey, Thorne John, Manual of Medical Micology. 1995. Blackwell science. 20. Tagliavini, Ruggero. Novo Atlas prático de Dermatologia e Venereologia. 1995, Santos. 21. Konneman, Elmer. 5ª edição. Color Atlas - Diagnostic Microbiology, 1997, Lippincott. 22. Dwight R. Johnson. Laboratory of diagnostic of Group A Streptococcal infections. WHO (Organização Mundial de Saúde). 23. Chung, Kwon J. K. Medical mycology. 1992. Lea & Fabiger. 24. Zaitz, Clarisse. Atlas de Micologia. 1995. Medsi. Artigos da Internet Periódicos: Revista Laes Haes, Mc Will Editores, News Lab, ARSCVRAND, JAMA, Arquivos de Dermatogia (JAMA). Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 4 de 87
  • 5. Universidade Católica de Goiás AULA 01 COLETA, TRANSPORTE E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS. É a parte mais importante no isolamento do microorganismo que é responsável pelo processo infeccioso. Uma coleta mal feita resulta no insucesso da pesquisa do real agente etiológico da doença. Quando há contaminação na coleta, por exemplo, com microorganismos da flora normal, pode gerar uma terapia incorreta tratando-se o germe contaminante e não o causador da doença. Por exemplo, num caso de pneumonia causada por Klebsiella pneumoniae, se a coleta for feita erroneamente (só na saliva e não no escarro), a terapia antibiótica estará inadequada. A amostra clínica deve ser material do verdadeiro local da infecção e colhida com o mínimo de contaminação. Deve-se ter cuidado com a contaminação do escarro pela saliva, com a coleta de exsudatos de feridas para não tocar na pele adjacente, com a contaminação da amostra de endométrio com secreção vaginal e um cuidado especial com a limpeza do tecido parauretral e períneo antes da coleta de urina. Outro problema é a impossibilidade de atingir abcessos profundos sem agulhas e cânulas. Deve-se estabelecer períodos ótimos para coletar as amostras para proporcionar um maior acerto no isolamento dos agentes causadores, mas, para isso é necessário conhecer a fisiopatologia dos processos infecciosos. Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 5 de 87
  • 6. Universidade Católica de Goiás * Hemocultura - segunda semana; Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 6 de 87
  • 7. Universidade Católica de Goiás * Urocultura - segunda ou terceira semana de infecção; * Coprocultura - Salmonella tiphy = diarréia aguda; * Soro - os anticorpos aumentam na segunda semana, mas com pico na quinta semana. A urina das pessoas normais pode ser inibitória ou bactericida para alguns microorganismos quando o seu pH é igual ou menor do que 5,5 e quando há aumento da osmolalidade ou da concentração (densidade). As novas técnicas para urina e escarro possibilitam os usos de pequenos volumes do material proporcionam um resultado fidedigno (tratando-se de micobactérias), com pouca interferência de contaminantes e dispensando as longas coletas de 24 horas. Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 7 de 87
  • 8. Universidade Católica de Goiás A quantidade de material deve ser suficiente para a boa execução da técnica usada; observar que nas formas agudas há abundância de exsudatos, porém, nas crônicas, há escassez. Cuidado som os swabs secos, isto é, com pouco material; pode ser desperdício de material do laboratório e do paciente. O melhor procedimento é retirar outra amostra e fazer uma declaração sobre as condições da amostra que foi enviada. No caso de escarro, 0,5 mL é pouco para toda a rotina (pesquisa de BAAR e cultura), além de poder não conter secreções pulmonares dos locais certos. Dispositivos de coleta, recipientes e meios de cultura devem ser rigorosamente esterilizados para que se chegue a um ótimo isolamento. Os frascos para urina e escarro devem ter a boca larga, para não haver contaminação do frasco, e tampa firme para não haver vazamento do material no transporte. Recomendam-se os swabs com pontas de alginato de cálcio, dracon ou poliéster porque o algodão pode ter ácidos graxos que impedem certas bactérias sensíveis. Deve-se respeitar o tempo de contato entre o swab e amostra; os swabs de orofaringe devem ser colocados em meios de transporte para que não ressequem e provoquem a morte bacteriana. RECIPIENTES PARA TRANSPORTE DAS AMOSTRAS Existem no mercado várias opções, uma delas é o Culturette (ampola de vidro com meio de Stuart para transporte), que assegura a umidade e conserva a amostra por 24 horas. Outro meio de transporte é o de Amies que é semi-sólido Para a coleta de anaeróbios não se usa swabs, mas sim agulhas e seringas para aspiração. As amostras devem ser protegidas do oxigênio e da dissecação. Alguns materiais para anaerobiose disponíveis no mercado são o Anaerocult da Merck®, Anaerobac da Probac® e os Tubos de Scott ( dois tubos de onde foi retirado o oxigênio e colocado o CO2, um dos tubos tem um swab adaptado à tampa e o outro é lacrado). Para a coleta de anaeróbios obrigatórios, microaerófilos e anaeróbios facultativos têm-se os tubos mais flaconetes (Port-a- Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 8 de 87
  • 9. Universidade Católica de Goiás cult da BBL® e o Coletor de amostras anaeróbicas da BD [tubo fechado e saturado com gás].). Sempre que possível coletar as amostras antes da administração de antibióticos, a qual irá reduzir a segurança do resultado da cultura (possibilidade de falso negativo), porém, existem microorganismos que têm o seu crescimento normal mesmo em presença de antibióticos. Há casos nos quais vários antibióticos da terapia têm ação bacteriostática e , quando colocamos a amostra em meios frescos (líquidos), com CIM (concentração inibitória mínima) de antibióticos, abaixo da concentração existente no local da infecção, o isolamento não fica problemático. Para um bom desempenho dos exames bacteriológicos existem certas regras de cadastramento do paciente que devem ser observadas: O recipiente deve ser rotulado de maneira legível e contendo todas as informações completas sobre o paciente, tais como: # Numeração do exame; # Médico; # Data e hora; #Local da coleta do material. Deve-se ter um bom contato com o médico, no caso de precisar de alguma informação antecipada do quadro do paciente. TEMPO DE ENTREGA DAS AMOSTRAS: 1) Respiratória: 30 min 2) Gastrointestinal: 1h 3) Hemocultura: 30 min 4) Anaeróbio: 30 min 5) Catéter intravascular: 15 min 6) LCR e líquido pleural 7) Urina: até 1h, se refrigerada 8) Swabs: imediatamente 9) Amostras com anestésicos locais: Imediatamente!! Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 9 de 87
  • 10. Universidade Católica de Goiás AULA 02 FLORA NORMAL Atualmente, há uma grande motivação para o estudo da ecologia microbiana, as causas do seu estabelecimento, a sua persistência, bem como o papel que esta flora representa na movimentação do nosso estado de saúde, especialmente no que se refere à flora normal do homem. Um estudo mais profundo da flora autóctone é de difícil execução em virtude de problemas econômicos e da dificuldade de se chegar a certas regiões do corpo como os folículos pilosos, glândulas sebáceas, glândulas sudoríparas e vilosidades do intestino, constituindo um problema técnico o estudo da flora normal destas regiões. Nem todas as espécies bacterianas que fazem parte da flora normal são cultiváveis, podendo estar presente em determinadas áreas do corpo sem serem recuperadas nas culturas de amostras colhidas; este também não deixa de ser um problema técnico de isolamento dessas bactérias autóctones. Assim, conclui-se que o estudo da flora normal ainda é um campo muito amplo de observações e discussões. Durante o processo de nascimento a pele, nariz, boca e conjuntiva tornam-se infectados por organismos adquiridos na passagem pelos genitais maternos. Após poucas horas do nascimento, os microorganismos já estão proliferando dentro do trato alimentar, nas superfícies externas desse e de outros tratos (por exemplo, do trato urogenital) e na superfície externa (pele e mucosas), aonde estabelecem residência. Os tecidos possuem mecanismos naturais e eficientes de defesa que restringem os microorganismos às áreas nas quais eles podem ser tolerados; quando essas defesas são vencidas e as bactérias têm acesso aos tecidos normalmente infectados, geralmente, ocorre a doença. A disseminação desses organismos autóctones dá-se por manuseio, perdigotos e pela respiração. Os conceitos de patogenicidade e virulência, atualmente, são considerados sinônimos e refletem a capacidade de espécies bacterianas de penetrarem nas defesas do hospedeiro. Algumas espécies coexistem com o hospedeiro de forma pacífica, mas, em determinadas circunstâncias, tornam-se claramente patogênicas, vencendo rapidamente as defesas do hospedeiro e produzindo doenças logo que chegam ao local. A patogenicidade dos microorganismos depende de fatores que variam com o gênero e as espécies do germe, e mesmo com as suas diferentes estirpes. Existem espécies altamente patogênicas para uma espécie animal e não patogênicas para outros animais, ou mesmo para o homem, devido à sua capacidade invasora ou então à sua toxicidade. A sua capacidade invasora resulta do poder de escapar da destruição causada pelas células fagocitárias, Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 10 de 87
  • 11. Universidade Católica de Goiás ou da capacidade de produção de enzimas bacterianas que facilitam a penetração das bactérias nos tecidos. PELE E MUCOSAS: Constituem barreiras físicas que são relativamente impermeáveis às bactérias. O pH ácido (3 a 5) da pele, devido a produtos do metabolismo bacteriano, inevitavelmente dificulta o crescimento de muitos microrganismos que chegam a esta superfície. Os ácidos graxos da pele matam muitas bactérias patogênicas como o S. pyogenes, mas, por outro lado, estimulam o crescimento de outros difteróides. A lágrima e a saliva têm lisozimas que arrebentam a camada mucopeptídica de várias bactérias. A acidez da mucosa vaginal (pH de 4 a 4,5) é devida ao crescimento dos lactobacilos. O aparelho respiratório também contém uma série de defesas escalonadas contra microrganismos (reflexo epiglótico, aderência de muco na árvore respiratória, cílios e epitélio respiratório e tosse). A pele é considerada, porém, um ecossistema pouco favorável, restringindo-se, assim, a um número muito pequeno de espécies. Tem como componentes aeróbios: S. epidermides, S. pyogenes, outros Streptococcus, Difteróides lipolíticos (axilas), Difteróides não lipolíticos, Acinetobacter e Alkaligenes (Gram negativos, presentes em regiões úmidas como axilas e pés); anaeróbios: Lactobacilos anaeróbios (glândulas sebáceas), Propioniobacterum acne. A maioria das bactérias vive nas camadas superiores da camada córnea da pele e parte superior dos folículos pilosos, sendo que 20% dessas bactérias não são alcançadas por desinfecção de pele. Esta barreira constitui um reservatório que permite rápido reestabelecimento da flora superficial após a sua remoção por meios artificiais. Há um aumento no número de bactérias de superfície imediatamente após o banho, seguido de uma diminuição até os níveis normais nas próximas duas horas. Isto ocorre porque durante o banho há uma maior exposição da camada córnea da pele. Os locais da pele mais habitados por bactérias são as axilas e os espaços interdigitais. Os fatores climáticos também influenciam na constituição da flora da pele; no inverno há um predomínio de Micrococcus e no verão de Difteróides. Se a pele for abafada (vedada) há um provável aumento no pH e conseqüente aumento dos Difteróides. A quantidade de lisozimas na pele é suficiente para afetar a ecologia dos microorganismos nela presentes, mas a fonte dessas enzimas é, ainda, desconhecida. Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 11 de 87
  • 12. Universidade Católica de Goiás Os cocos residentes da pele são insensíveis à atividade lítica desta enzima, mas a invasão por bactérias patogênicas talvez seja dificultada. Os ácidos graxos da pele que inibem, in vitro, os Micrococcus, spp; S. pyogenes e S. aureus, não inibem Pseudomonas aeruginosas nem a E. coli. O ácido oléico estimula o crescimento, in vitro, de cepas lipolíticas de Difteróides cutâneos e Propioniobacterium acne. Sommer Ville sugeriu que as variações da microflora das crianças, quando comparada com os adultos, podem acontecer por causa das baixas concentrações de ácidos graxos livres na pele dessas crianças. Os Staphylococcus coagulase negativa e outros Micrococcus podem dominar a pele em virtude das bacteriocinas (antibióticos bacterianos) e outros inibidores que eles produzem. FLORA NORMAL DO OLHO: As bactérias do olho são similares àquelas encontradas na pele (há relação entre o S. aureus na pele e a sua presença no olho) e vias aéreas superiores, além das bactérias Gram negativas mais comuns do TGI que também são isoladas nos olhos; mas as bactérias encontradas normalmente no ar são, raramente, isoladas no olho. Acredita-se que os cílios tenham um papel importante na manutenção da flora do olho; acredita-se também que os olhos nunca estão desprovidos de Staphylococcus porque a fonte de contaminação está sempre presente. Não existe diferença entre a flora ocular de homens e mulheres e não há modificação da flora com a idade do indivíduo, exceto um aumento no número de Difteróides em indivíduos com 50 anos ou mais (Corynebacterium xerosis). OUVIDO: O canal auditivo externo reflete a flora da pele, sendo que Pseudomonas aeruginosas e S. pneumoniae também têm sido isolados. O ouvido médio e o interno são estéreis e qualquer bactéria provoca infecção. TRATO GENITO URINÁRIO: A sua flora varia com as diferentes áreas. A genitália externa masculina não é muito seletiva e a flora inclui Gram negativos, com predominância de bacilos fusiformes, espiroquetas e Micobacterium smegmatis. A flora da vagina varia com a idade da paciente. Os fatores fisiológicos, como os hormônios ou o glicogênio na mucosa vaginal (que é controlada por estrogênios e progesterona), são responsáveis pela acidez vaginal. Essa mesma acidez predomina no nascimento devido ao hormônio materno e, Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 12 de 87
  • 13. Universidade Católica de Goiás quando o estrogênio torna-se ativo, há uma intensa descamação do epitélio e um grande depósito de glicogênio. O pH da vagina gira em torno de 4 a 5 e a flora é rica em Lactobacillus acidophylus. Na infância e menopausa o pH é básico (em torno de 6 a 7) e a flora predominante é de cocos. Na gravidez há um grande depósito de glicogênio. Recentemente, foi demonstrado que a ação dos lactobacilos sobre o glicogênio da vagina é específica de algumas estirpes que agem somente sobre o glicogênio humano. Existe diferença entre a flora da vagina externa, paredes vaginais, fundo de saco de Douglas e colo de útero. São componentes da flora vaginal: Haemophilus vaginalis, Difteroides, Mycoplasma, spp; Lactobacillus, spp; Coliformes, Streptococcus, spp aeróbios, S. faecalis anaeróbios e S. aureus. Neisseria gonorrheae pode estar presente em portadora. TRATO GASTRO INTESTINAL: É estéril ao nascimento. No adulto existe entre 10 elevado a 5 e 10 elevado a 10 de bactérias por grama de fezes no intestino delgado e 10 elevado a 11 no intestino grosso. O esôfago e o estômago estão contaminados com bactérias provenientes dos alimentos ingeridos, mas estas bactérias não sobrevivem nestas partes do trato gastrointestinal. O estômago não é adequado ao crescimento de microrganismos devido à grande acidez do suco gástrico e à própria motilidade do órgão, que o esvazia em intervalos periódicos; nele, há uma reflexão da flora dos alimentos e saliva, porém, como floras residentes podem considerar algumas bactérias esporuladas e lactobacilos. O Mycobacterium gastri provoca bacterioscopia duvidosa com TB quando é analisado no suco gástrico. O fígado e vesícula são, geralmente, livres de contaminação bacteriana. Nos níveis mais inferiores do TGI há um aumento do número de bactérias de cada espécie, atingindo o máximo no intestino grosso, sendo que nesses níveis também são encontradas as bactérias anaeróbias. Os principais germes da flora fecal são: os bacterióides (Corynebacterium, sp), Lactobacillus acidophylus, Clostridium, sp (C. perfringes) e Streptococcus faecalis. A flora normal do TGI foi recentemente estudada e verificou-se uma diferença na composição de acordo com a área geográfica, com a fisiologia e dieta do paciente. O intestino delgado superior, geralmente, é estéril ou contém poucos germes; quando há uma gastroenterite aguda (crianças ou adultos) há um aumento na sua flora normal, principalmente de E. coli (que provoca diarréia Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 13 de 87
  • 14. Universidade Católica de Goiás pela ação da exotoxina), o que irá provocar um desequilíbrio eletrolítico. Para o controle da E. coli as colicinas podem ser consideradas importantes, porém, fatores que controlam a espécie dominante, Bacterioides fragilis, ainda não foram definidos. CAVIDADE ORAL: A boca pode ser considerada um ambiente uniforme. Porém, nela há diferentes nichos ecológicos que se alteram com o tempo durante a vida. É o local de maior variação de microrganismos (ex. dorso da língua, sulcos gengivais, placas dentárias). A contagem de microrganismos totais da saliva é igual a 4 - 5,5 bilhões/ml, com uma média de 750 bilhões. O feto é, normalmente, estéril “in útero”. Durante o nascimento a criança é contaminada pela flora do trato genital materno (Lactobacillus, Corynebacterium, Micrococcus, Enterobactérias, Streptococcus, Peptostreptococcus, leveduras, protozoários e vírus). Apesar disso ainda é estéril ao nascimento e, de 6 a 10 horas após o nascimento, torna-se bem variada por algum tempo. Na idade de 0 a 1 ano as bactérias que predominam são: Streptococcus, Staphylococcus, Lactobacillus, Neisseria catharralis, Veilonella, Nocardia, Actinomicetos, Escherichia, Fusobacterium, Bacterioides, Leptotrichia e leveduras. A presença de dentes não é necessária para a instalação de bactérias filamentosas (Fusobacterium, Actinomyces, Leptotrichia). O Streptococcus sanguis se estabelece após erupção dentária. As cáries também fornecem novos substratos e um pH ácido, além de dificultar a exposição de microrganismos aos agentes antimicrobianos da saliva. A placa dentária contém Streptococcus, Neisseria, Veilonella, Actinomyces e Gram negativos. O pH da saliva ( 5,7 - 7,0) parece ter importância na manutenção da flora normal. Outros fatores para a manutenção desta flora são as vitaminas do complexo B e a mucina juntamente com carboidratos. Os Lactobacillus,spp são em pequeno número e só aumentam na presença de cáries ou má higiene bucal (correlação positiva entre cáries e lactobacilos). BOCA: Actinomyces, spp Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 14 de 87
  • 15. Universidade Católica de Goiás Bacterioides, spp Moraxella catharralis Candida albicans e outras leveduras Campylobacter, spp Entamoeba gengivalis Fusobacterium, spp Haemophilus, spp Lactobacillus, spp Leptotrichia, spp Micrococcus, spp Mycoplasma, spp N. meningitidis Peptostreptococcus, spp S. aureus S. epidermides S. pneumoniae S. faecalis S. mitis e S. salivarius ( alfa hemolítico) NASOFARINGE: Acinetobacter, sp Moraxella catharralis Haemophilus, spp Moraxela, spp N. meningitidis S. aureus S. epidermides AMIGDALAS: Actynomices, spp Bacterioides, spp Fusobacterium, spp Micrococcus, spp S. aureus S. epidermides S. pneumoniae S. faecalis Veillonella, spp NARIZ: Corynebacterium, spp Moraxela, spp Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 15 de 87
  • 16. Universidade Católica de Goiás N. meningitidis S. aureus S. epidermides S. pneumoniae S. faecalis S. pyogenes (portadores sãos) OROFARINGE: Bacterioides, spp Candida albicans Enterobacterias Haemophilus, spp S. pneumoniae Streptococcus hemolíticos DENTE: Leptotrichia buccalis SALIVA: Lactobacillus, spp. Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 16 de 87
  • 17. Universidade Católica de Goiás AULA 3 URINOCULTURA COLETA: Normalmente, é feita pelo próprio paciente. Para um isolamento ideal dos microrganismos causadores da infecção das VGU é necessária uma coleta com o mínimo de probabilidade de contaminação pelos tecidos adjacentes à uretra; o ideal seria a coleta com supervisão de um técnico ou enfermeiro bem treinado. NORMAS: Cabe a nós instruir o paciente da maneira mais simples para que o mesmo não erre na coleta e, conseqüentemente, nos livre dos erros de isolamento. 1. Lavar a área com água e sabão (períneo mais área genital); 2. No caso de mulheres devem-se afastar os lábios vaginais; 3. O frasco deve ser estéril e ter a boca larga para evitar extravasamento dos jatos para mãos e adjacências; 4. Desprezar o primeiro jato (que traz excesso de bactérias da uretra e não das VGU em si) e colher o segundo; 5. As instruções devem ser escritas em um cartão a ser entregue ao paciente, ao invés de serem ditas apenas verbalmente, com o objetivo de evitar uma interpretação errônea pelo paciente. Se o paciente tiver pouca instrução, faz-se necessária a leitura e explicação dessas instruções por parte do atendente do laboratório. Observar que: Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 17 de 87
  • 18. Universidade Católica de Goiás - a contagem de colônias pode variar de 0 a 100.000 col/mL (ou mais); - pacientes isentos de infecção das vias urinárias não devem ter bactérias ou ter no máximo algumas colônias; - significância - de 0 a 9.000 col. /mL, não tem significado clínico de 10.000 a 90.000 col./mL, suspeita de infecção acima de 100.000, início de infecção. - o isolamento de três ou mais espécies de bactérias indica, na maioria dos casos, falhas na coleta ou atraso no transporte. - Punção supra-púbica: 1) Qualquer isolamento de BGN deve ser considerado. 2) Quantidade > 103 UFC/ml de CGP deverá ser considerada. COLETA PARA MICRORGANISMOS ANAERÓBIOS DA URINA: Usada principalmente para crianças e em material de adultos que apresentam sintomatologia, porém com ausência de crescimento nos meios habituais. 1. Desinfetar a pele da região suprapúbica, localizada sobre a bexiga (preparação cirúrgica); 2. No local, injetar Lidocaína a 10% por via subcutânea; 3. Fazer um pequeno corte na epiderme e, através deste, injetar uma agulha espinhal calibre 18 com bizel curto e aspirar 10 mL da urina; 4. Não coletar amostras em bolsa com catéter, exceto em crianças, porque as pontas do catéter podem conter muitos microrganismos uretrais. O prazo máximo para que o material, no caso da urina, seja utilizado em exames é de duas horas, pois, se esse tempo for ultrapassado, há um crescimento excessivo das bactérias da urina dando um número alterado (para mais ou para menos). Quando o paciente mora muito longe (mais de duas horas de distância) o material deve ser colhido no laboratório ou então deve ser trazido numa caixa com gelo. Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 18 de 87
  • 19. Universidade Católica de Goiás Os coletores de farmácia e os sacos plásticos devem ser aceitos no caso de crianças e internos de hospital porque são esterilizados por raios. MICRORGANISMOS QUE CAUSAM INFECÇÃO NO APARELHO URINÁRIO: Enterobactérias (E. coli, Proteus, spp; Klebsiella, spp), Streptococcus do grupo D (S. faecalis), Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, S. epidermides, S. saprophyticus. SINAIS E SINTOMAS: 1. Infecções na bexiga: piúria, disúria, hematúria, dor e tumefação supra-púbica e de abdomem inferior. 2. Infecção renal: dor lombar e tumefação do ângulo costo-vertebral (ACV). ENTEROBACTÉRIAS: São bactérias Gram negativas em forma de bastão com bordas retas. Suas colônias são grandes, cinza escuras, úmidas e mucóides; as colônias que crescem como ondas (fenômeno erosivo) sugerem a presença de Proteus, spp. As enterobactérias fermentam a glicose e produzem ácido no meio, tornando o TAF amarelo. Uma reação no TAF de ápice e base alcalinos (vermelho) exclui as espécies bacterianas da família das enterobactérias. São citocromo-oxidase negativas, reduzem nitratos a nitritos, com exceção do Enterobacter aglomerans e Erwinia, spp, em 18 a 24 horas nos meios básicos mais KNO3. Os meios seletivos para enterobactérias, normalmente, contém sais biliares em concentrações adequadas com o objetivo de evitar o crescimento Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 19 de 87
  • 20. Universidade Católica de Goiás dos Gram positivos. Se o material que chegar ao laboratório albergar bactérias mistas (Gram positivas e Gram negativas) pode-se fazer um isolamento destas bactérias semeando o material em meios não seletivos como o Ágar sangue e em meios seletivos como o ágar MacConckey, Hektoen, ENDO. As enterobactérias podem provocar doenças infecciosas nas VGU, aparelho respiratório (Klebsiella pneumoniae) e em feridas (E. coli). As bactérias lactose positivas são consideradas patogênicas (E. coli, Klebsiella,spp; Enterobacter,spp), e são fermentadores lentos Citrobacter,spp; Providencia,spp; Serratia,spp; Hafnia,spp. No meio seletivo EMB pode-se observar as colônias fermentadoras de lactose (E. coli produz colônia verde escura com brilho metálico). Para as amostras gastrointestinais usam-se os meios ágar SS, Hektoen, XLD (ou ágar SIM). Os caldos de enriquecimento para enterobactérias são o caldo selenito, caldo GN e caldo tetrationato. PRINCIPAIS BACTÉRIAS QUE CAUSAM INFECÇÕES NO TRATO URINÁRIO 1- Escherichia coli Existem 171 sorotipos antigênicos somáticos O e ainda são divididas em sorogrupos baseados nos antígenos K (capsular) e H (flagelar); certos sorotipos O de E. coli são conhecidos como invasores da mucosa intestinal e outros são conhecidos como produtores de enterotoxinas termolábeis e termoestáveis. A transferência de produção das enterotoxinas é dada por plasmídio (Ent.) e, como exemplo de sorotipos produtores tem-se: O 6; O 8; O 25; O 27; O 148; O 159. Nas fezes é necessário classificá-las em enteropatogênicas ou enterotoxinogênicas e invasivas, mas isto só é necessário em infecções gastrointestinais (coprocultura). A E. coli é predominante no intestino grosso. É um coliforme produtor de colicinas. Os testes de ELISA (imunoabsorção ligada a enzima) para as toxinas termolábeis são positivos. A patogenia da infecção do trato urinário propaga-se por via hematogênica e linfática. A E. coli(UPEC) é lactose positiva, CO2 positivo, lisina positiva (76 a 89 %), indol positivo, motilidade positiva, VP negativo, citrato negativo e urease negativa. As espécies da taxonomia das enterobactérias adotada e proposta atualmente são: E. coli; E. hermannii e E. vulneris, E.coli inactiva(antiga Alkalescences-dispar). 2- Proteus, spp Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 20 de 87
  • 21. Universidade Católica de Goiás A família Proteae tem como espécies de interesse: P. mirabillis, P. vulgaris (P vulgaris biogrupo 2), P. rettigeri (passou para P.vulgaris biogrupo 1), P. penerii e P. inconstans. As Providencia stuarti e Providencia alcalifaciens estão incluídas como Proteus inconstans. O Proteus morganii foi transferido para o novo gênero Morganella morganii(subespécie morganii). Recentemente o nome Proteus penerii foi proposto para o organismo P. vulgaris indol negativo. O P. mirabillis, P. penerii e P. vulgaris são H2S positivos e podem ser confundidos com Salmonella, spp. Os Proteus, no geral, são ureia positivos, fenil-alanina positivos, VM positivos, H2S positivos e CO2 positivos. Em TAF apresentam-se em colônias não pigmentadas; em meios seletivos podem ser confundidas com colônias não fermentadoras de lactose. Forma em ágar sangue um crescimento em véu ou onda como se fosse uma película. São pleomórficos, não capsulados e móveis. O P. mirabillis é o mais encontrado em infecções humanas no trato urinário. Comumente são encontrados em pacientes em antibioticoterapia longa. O P. vulgaris é, geralmente, resistente à penicilina e à cefalosorina; o P. mirabillis é sensível à ampicilina e à cefalosporina. Encontram-se na água e solo em fezes contaminadas. Os Proteus têm 49 antígenos O e 19 antígenos H. Algumas estirpes têm o antígeno K (capsular). A reação de Weil Felix utiliza antígenos dos tipos O 1 e O 2 de P. vulgaris e O 3 de P. mirabillis pode apresentar resultados positivos para as três espécies, mas especialmente para o P. mirabillis. O P. mirabillis é mais frequente do que o P. vulgaris, mas ambos estão frequentemente associados ao Diabetes e anomalias do trato urinário. Em hospitais o P. mirabillis acomete pacientes cateterizados, pós-cirúrgicos e aqueles que sofreram instrumuntações urológicas. Encontram-se na água e fezes contaminadas, sendo que 25 % da população são portadora de Proteus no intestino. Pode ser encontrado, ainda, na garganta, olhos, feridas e trato respiratório. A Morganella morgani também causa infecção urinária e tem sorogrupos classificados pelos antígenos O e H. 3- Citrobacter, spp São lactose positiva, motilidade positivos, VM positivos e citrato positivos (76 a 89 %) como o C. amalonaticus. Citrobacter freudii, C. amalonaticus e C. diversus são as espécies de interesse, sendo que o C. freudii é a espécie tipo Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 21 de 87
  • 22. Universidade Católica de Goiás que se assemelha à Salmonella e Arizona e é um organismo oportunista no homem. 4- Klebsiella, spp São capsuladas, imóveis e isoladas aos pares ou em cadeias curtas. As colônias são elevadas, viscosas e brilhantes. Nas provas bioquímicas mostram- se VP positivas (produzem butilenoglicol a partir da glicose), mas existem VP negativas e VM positivas e também VM positivas. Várias espécies têm bacteriocinas e causam bacteremia e infecções no trato urinário humano. São muito encontradas em infecções hospitalares, sendo que todas as espécies são resistentes à ampicilina. As espécies que representam o gênero são: K. pneumoniae (K.pneumoniae subspécie pneumoniae), K. oxytoca (mais no intestino), K. ozaenae (necrose da mucosa nasal), K. rhinoescleromatis(K.pneumoniae subspécie rhinoescleromatis)granuloma destrutivo de nariz e faringe), K. terrigena e K. platicola. São H2S negativas, uréia negativa, femil-alanina negativas, lisinas positivas e ornitina negativas. A K. pneumoniae tem 82 antígenos K e 5 antígenos O, mas os antígenos causadores da pneumonia são os capsulares 1, 2 e 3. 5- Enterobacter, spp Algumas espécies são capsuladas, são móveis, citrato positivo, CO2 positivo, glicose positiva, VP positiva, VM negativa e H2S positivo. Antigamente a espécie tipo era denominada Aerobacter aerogenes; o Enterobacter hafnia é agora Hafnia alvei e as espécies de interesse são: E. cloacae, E. aerogenes, E. aglomerans, E. sakazakii e E. gergoviae ( E.aerogenes atypical) = uréia positiva). O E. cloacae (E.cloacae-like unemed sps 1,2,3) é mais isolado na urina, escarro, pus, sangue e líquor; faz reação cruzada com E. coli. O E. sakazakii, que antes era E. cloacae, é encontrado em alimentos, no meio ambiente e causa meningite em recém-nascidos. O E. aglomerans (E. agglomerans complex: Erwinia herbícola, E. melletiae e ainda: Pantoea agglomerans (E. agglomerans HGXIII); Pantoea ananás (E. agglomerans HGVI) Pantoea dispersa (E. agglomerans HGIII), após atos cirúrgicos e cateterização positiva hemoculturas). O E. aerogenes é encontrado em fezes humanas, esgotos, leite, água, VGU, pus e sangue. Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 22 de 87
  • 23. Universidade Católica de Goiás 6- Pseudomonas, spp Não são enterobactérias, mas são encontradas em infecções no TGU. São bastonetes aeróbios estritos, móveis, catalase positiva e citocromo-oxidase positivo. Nas espécies flageladas o número de flagelos serve para separá-las, mas isso não ocorre na rotina do laboratório clínico. Possuem fímbrias que possibilitam a fagocitose. Produzem pigmentos solúveis, a pioverdina (P. fluorescens) e a piocinina ( P. aeruginosa - azul) e odor adocicado semelhante ao da uva. São encontradas nos olhos, urina, ferida, sangue, lavados brônquicos e trato genital feminino. As espécies de interesse são: P. aeruginosa (mais patogênica, que cresce a 42ºC), P. fluorescens, P. putida, P. cepacia (Burholderia cepatia, encontrada na putrefação da cebola, em lesões úlcero-necroticas em humanos, em pacientes com fibrose cística em paciente com estenose de uretra, após o uso de sondas), P. stutzeri (água e solo, raro em infecções) e P. maltophilia (Stenotophomonas maltophila, encontrada no aparelho respiratório, sangue, feridas e urina e pacientes com infecções oportunistas), P.pseudomallei(Burkholderia pseudomallei) 7- Staphylococcus, spp As espécies que causam infecções urinárias são: S. aureus, S. saprophyticcus, S. xylosus e S. epidermides (quando a contagem de colônias está muito alta ele também pode causar infecções urinárias). Outros patógenos que podem causar infecções urinárias e outras infecções (Bacilos Gram negativos ,não fermentadores de açúcares: 1) Flavobacterium meningosepticum = Chryseobacterium meningosepticum (patogênicos para prematuros) 2) Oligella urethralis (infecções no ouvido e urinárias) 3) Neisseria elongata (subsp. nitroredutans) endocardite 4) Sphingobacterium spiritivorum (sg, urina, antigo Flavobacterium spiritivorum) 5) Shingomonas paucimobilis (Pseudomonas paucimobilis) encontrada em várias amostras clínicas. 6) Weeksella virosa (Flavobacterium genitale) = colônia mucóide, infecções urinárias e genitais. 7) Alcalígenes faecalis (antigo odorans) = nebulizadores, lavado brônquico, sg, escarro, urina. 8) Acinetobacter baumannii (penicilina resistente). Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 23 de 87
  • 24. Universidade Católica de Goiás Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 24 de 87
  • 25. Universidade Católica de Goiás AULA 4 COPROCULTURA Este exame é destinado a isolar os microrganismos causadores das diarréias, disenterias purulentas, sanguinolentas e mucosas e dores abdominais. As fezes podem se apresentar sólidas, líquidas ou pastosas; normalmente, as fezes líquidas e pastosas são características de agentes gastrointestinais patogênicos. Quando as fezes do paciente estão sólidas e ele está apresentando dores abdominais, o médico pode administrar um laxante para facilitar o trabalho da coprocultura; se as fezes estiverem líquidas ou pastosas há necessidade de se fazer uma suspensão em salina estéril. A semeadura é feita num caldo de enriquecimento, podendo ser utilizado o caldo selenito, caldo tetrationato ou caldo GN, ou em meios seletivos (SS, Hektoen, XLD [xilose lisina desoxicolato], ágar sulfito-bismuto, ágar MacConckey, EMB ou ENDO). As espécies que podem ser encontradas causando gastroenterites são: Campylobacter pylori, Camppylobacter jejuni, Salmonella, spp; Shiguella, spp; E. coli (enterotoxinogênica e enteropatogênica), Vibrio cholerae, Vibrio, spp; Yersinia enterocolitica, Clostridium difficile e Staphylococcus aureus. COLETA DE AMOSTRAS Coletar em recipientes estéreis, de boca larga e que possam ser hermeticamente fechados. Para isolar Shiguella, spp e Neisseria gonorrhoeae, utilizar Swab retal, sendo que para a N. gonorrhoeae tocar o Swab apenas no esfíncter anal tendo o cuidado de não entrar em contato com as fezes. Para o isolamento de bactérias patogênicas é bom colocar as fezes em um conservante como o tampão fosfato de sódio ou potássio a 0,033 M mais Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 25 de 87
  • 26. Universidade Católica de Goiás glicerol. Se a suspeita for de Salmonella, spp ou Shiguella, spp, colocar em caldo selenito ou caldo GN. São Bactérias Causadoras de Gastroenterites: 1- Campylobacter jejuni subsp. jejuni: Quadro clínico - dor abdominal, diarréia, vômito, febre, dor de cabeça, mialgia e artralgia. Acomete mais indivíduos adultos na faixa etária de 20 a 29 anos. Transmissão - água e alimentos contaminados. Coleta - as fezes diarreicas podem ser transportadas à temperatura ambienta se for para cultivo imediato, caso contrário às fezes devem ser refrigeradas. Cultura - não cresce a 25 ºC cresce pouco a 37 ºC, mas cresce bem a 42-43 ºC. Requer atmosfera gasosa adequada (2-5 % de CO2); não se deve usar a jarra de anaerobiose devido à concentração de O2 que é de 12 - 17 % e o microrganismo em questão necessitam de 3 - 6 % de O2. O meio mais usado é o Campy-Bap a 42 ºC é microaerófilo (↓O2) e Capnophilico (↑CO2). O crescimento da cultura deve ser avaliado em 24, 48 e 72 horas através de lâminas coradas pelo Gram (bastonetes curvos Gram negativos); pode ser feita a montagem a fresco para avaliar a presença de motilidade em flecha. Se o material vier de ágar não inibidor a 37 ºC fazer uma lâmina corada pelo Gram e uma montagem a fresco para observar os mesmos aspectos do microrganismo em estudo, em seguida semear no ágar sangue a 25 ºC, podendo ou não haver crescimento (no ágar sangue o C. jejuni não cresce a 37 ºC). O C. jejuni hidrolisa o hipurato e é sensível ao ácido nalidixico (30 mg) e à cefalotina. Pode-se fazer teste de aglutinação em látex ou Gen Probe (sonda genética), a partir das colônias. 2- Helicobacter pylori É um novo microrganismo associado à gastrite e úlcera gastroduodenal. Apresenta-se em espiral, porém, é mais semelhante ao gênero Spirillum que ao Campylobacter, além de apresentar ácidos graxos em sua parede celular que o difere das outras espécies de Campylobacter. Tem sensibilidade aos sais de bismuto, produz urease com atividade forte (fator de patogenicidade), não é muito ativo bioquimicamente, não fermenta carboidratos, não reduz nitratos e não hidrolisa o hipurato de sódio. Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 26 de 87
  • 27. Universidade Católica de Goiás A sua morfologia em espiral é vista no tecido gástrico corado pelo Gram, HE e acridina-orange, mas os melhores resultados foram obtidos com a coloração da prata de Warthin-Starry. Para a cultura é utilizado o ágar chocolate ou o meio ágar Campylobacter de Skirrow (7% de sangue de cavalo, vancomicina, ácido nalidixico e trimetroprim). É redutor de nitrato-nitrito variável, cresce na presença de 0,5% de glicina e cresce à 30ºC, 42ºC. Outras sps de Helicobacter, spp: H. cinaedi (swabs retais em homossexuais), H. fennelliae (swabs retais em homo e bissexuais), Flexipira rappini (semelhante ao H. pylory), pacientes com ou sem AIDS, Gastropirillum hominis (gastrite em humanos semelhantes a H. pylori). 3- Shigella, spp O gênero Shigella, spp é constituido de quatro sorotipos ou subgrupos: A) S. dysenteriae, B) S. flexineri, C) S. boydii e D) S. sonnei. A sorotipagem com antisoros polivalentes ou grupo específicos é o método mais adequado para identificar um microorganismo isolado que tenha características bioquímicas e morfológicas parecidas com as da Shigella,spp. Os biotipos imóveis e não produtores de gás de E. coli, pertencentes ao grupo de Alkaligenes dispar, podem se assemelhar às Shiguella, portanto, não se dispensa a sorotipagem (A - D). Possuem antígeno ‘’O’’ específico, certas estirpes têm antígenos K (termolábil) e não têm antígenos H. As Shigella, spp permanecem restritas ao TGI (a septicemia é rara), são lactose negativa, imóveis e não produzem gás a partir da glicose; As exceções são a S. flexineri sorotipos Newcastle e Manchester, que diferem dos biogrupos de 1 - 5 por serem indol negativo, arginina negativa e CO2 positivo. Sua identificação bioquímica fica confusa com outros gêneros como Hafnia alvei, Enterobacter, Providencia e E. coli invasiva. As Shiguella, spp exigem um maior número de provas bioquímicas devido à quase total negatividade nestes testes. Todas as espécies são produtoras de enterotoxinas, mas uma delas , a S. dysenteriae, produz uma exotoxina conhecida como neurotoxina de Shiga, que é potente e responsável pela patogenia desta espécie. As Shigella, spp causam no homem uma doença debilitante denominada disenteria bacilar, mas são menos invasivas que as Salmonellas, spp. As shigeloses podem apresentar-se desde a forma de infecção inaparente, pequenas infecções com desconforto abdominal e pouca diarréia até a Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 27 de 87
  • 28. Universidade Católica de Goiás disenteria bacilar. O início é súbito com tenesmo, diarréia e febre após um período de incubação de 1 a 4 dias. Todas as Shigella, spp são patogênicas para o homem causando lesões no TGI (íleo e cólon), lesões no epitélio e mucosa e inflamação aguda com presença de restos celulares (S. flexineri). As lesões superficiais do TGI (mucosas) ocorrem devido à ineficiência dos anticorpos IgG, os quais têm efeito de proteção. Há um aspecto a ressaltar sobre a formação de uma pseudomembrana, nas áreas ulceradas do TGI, composta por restos celulares, bactérias e mucosa necrosada. As fezes devem ser colhidas na fase aguda antes do início do tratamento. O paciente está sujeito à reinfecção. O tratamento é feito com cloranfenicol, tetraciclinas (bacteriostáticas) ou ampicilina. Pode-se fazer a administração de Lactobacillus acydophillus que acidulam o meio tornando-o impróprio para o crescimento das Shiguella, spp. A vacinoterapia não tem valor algum. As Shiguella, spp são anaeróbios facultativos, crescem bem em aerobiose. Existem variações coloniais dos tipos lisa (S) e rugosa (R), não invasiva. 4- Salmonella, spp É o gênero mais complexo com 2.200 sorotipos diferentes descritos por Kauffman-White. Neste esquema elas são agrupadas, em A, B, etc. com base nos antígenos O (somáticos), e em sorotipos 1, 2, etc. segundo os antígenos flagelares H. Todos os subgrupos de Salmonella, spp e Arizona, spp são considerados pertencentes à mesma espécie. A contaminação se dá, normalmente, por ingestão de leite, água e alimentos contaminados por fezes de humanos e animais. Podem-se obter três tipos clínicos: 1. Gastroenterites - diarréia de leve a fulminante, febre baixa, náuseas e vômitos; 2. Bacteremia ou septicemia - febre alta com hemoculturas positivas (S.cholerae suis é a espécie invasiva); 3. Febres entéricas - febra amena e diarréia. Pode ser causada por qualquer espécie de Salmonella, exceto a S. typhi que causa constipação. Nos primeiros 7 a 10 dias as hemoculturas são positivas e o indivíduo apresenta diarréia sanguinolenta, posteriormente se positivam as culturas de fezes e urina. O indivíduo continua eliminando o microorganismo após 1 ano de desaparecimento da clínica. Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 28 de 87
  • 29. Universidade Católica de Goiás As Salmonella, spp são móveis (exceto as aviárias), lactose negativa, H2S positivo, citrato positivo e uréia negativa. As espécies de interesse são: S. typhi, S cholerae-suis e S. enteritidis, sendo que os mais de 2.200 sorotipos pertencem à espécie S. enteritidis. A Arizona hinshawii mudou de gênero e passou a ser subespécie da S. enteritidis e é causadora de gastroenterites nos humanos e animais. Existem outras espécies como S. pullorum (causa diarréia em pintos), S. galinanum, S. schottmülleri (S. paratyphi A, B, C), porém a taxonomia aceita somente as três primeiras espécies citadas anteriormente. Doenças: 1- Febre tifo - S. typhi; (sorogrupo 1). 2- Febre paratifóide no homem - S. paratyphi B; (sorogrupo 1). 3- Gastroenterite aguda no homem e animais - S. typhimurium; (S.enteritidis sotipo typhimurium) 4- Paratifo em leitões - S. cholerae-suis. A identificação sorológica é feita colocando-se uma gota da suspensão de Salmonella, spp com uma gota de antisoro diluído. A S. typhi multiplica-se no tecido linfóide, submucosa intestinal ( placas de Peyer) e linfonodos regionais, propaga-se para o baço, fígado e medula óssea e volta ao sangue com liberação de endotoxinas. A hemocultura positiva na primeira semana, mas na convalescência a coprocultura fica positiva e o indivíduo fica portador. O diagnóstico laboratorial é feito através de hemocultura e reação de Widal (soroaglutinação com anticorpos anti O e anti H). A coprocultura tem valia no caso de infecções alimentares; a semeadura é feita em caldo selenito e depois em ágar SS ou ágar sulfito-bismuto (inibe a E. coli). A imunidade é duradoura (celular e humoral). 5- E. coli enteropatogênica (EPEC) As estatísticas mostram que a faixa etária mais acometida por este sorotipo vai de 0 a 2 anos. No intestino delgado forma abcessos localizados, o indivíduo apresenta tenesmo (calafrios e abdômen endurecidos), as fezes são líquidas e mucopiosanguinolentas. Os adultos só são afetados quando debilitados. A semeadura deve ser feita em ágar simples ou ágar sangue porque os meios seletivos podem inibir o crescimento de algumas dessas cepas. 6- E. coli enterotoxinogênica (ETEC) Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 29 de 87
  • 30. Universidade Católica de Goiás Raramente invade a mucosa do intestino delgado ou grosso, mas pode produzir exotoxina que atua na mucosa intestinal provocando grande liberação de água. Essas diarréias são copiosas, não contém sinais de piócitos ou hemácias e têm como conseqüência desidratação sem febre. Algumas estirpes de E. coli são produtoras de exotoxinas e contém fímbrias (fatores de colonização, adesão à mucosa). As técnicas de ELISA são positivas para antígenos TL e TE. Em crianças é chamada de ¨cólera infantil¨ e adultos ¨diarréia dos viajantes¨. 7- EIEC (enteroinvasiva) Invade células epiteliais (febre + colite + diarréia e PMN nas fezes + tenesmos). 8- EHEC (enterohemorrágica) Elaboração de citoxinas = diarréia com sg e sem febre acompanhada de dor abdominal. 9- EaggEC (enteroagregativa) Pode durar até 14 dias o processo diarréico é aquoso e promove desidratação grave. Este patógeno adere às células epiteliais. 10- Vibrio, spp A espécie tipo é o Vibrio cholerae, que foi causa de diarréias potencialmente graves durante séculos. A doença leva à diarréia, muitas vezes severas, desidratação e infecções extra intestinal que podem resultar em septicemia fatal; as fezes ficam líquidas e acinzentadas podendo ter coágulos. As espécies de destaque são: V. parahaemoliticus (frutos do mar contaminados e mal cozidos), V. mimicus (mariscos) e V. alginolyticus (biotipo 2 do parahaemoliticus feridas e ouvido). A cólera clássica, quando aparece, tem como microrganismo responsável o V. cholerae biotipo El-Tor. Os microorganismos podem ser isolados dos vômitos na fase aguda e para este isolamento é usado o meio TBCS (tiosulfato-citrato-bile-sacrose). Os Vibrio, spp são flagelados. O Vibrio cholerare tem 3 sorogrupos: Inaba (EUA, Peru, CHILE, Brasil, Equador = variedades EL TOR) Ogawa (sudeste da Ásia) e Hikojima. Pode ser tratado com Tetraciclina. Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 30 de 87
  • 31. Universidade Católica de Goiás As provas pós-cultura que são confirmatórias para V. cholerae são: Gelatinase + , aglutinação de eritrócitos de galinha +. 11- Yersinia enterocolitica Características gerais: bacilo Gram negativo pertencente às enterobactérias. Espécies: Y. intermedia, Y. fredericksenii, Y. kristensenii (Y. enterocolitica atípica). A manifestação clínica depende do sorotipo, dos fatores genéticos e das condições do indivíduo. As manifestações primárias são enterites, linfadenite mesentérica, ileíte terminal, pericardite, pneumonia, etc.; as secundárias incluem eritema nodoso, púrpuras, artralgias, mono e poliarterites, glomerulonefrites, doenças da tireóide e tromboses. Em crianças e adolescentes predominam os sintomas de gastroenterite mesentérica; as diarréias agudas e artrite acometem mais as pessoas de 20 a 60 anos. Quadro laboratorial: a semeadura em meios seletivos deve ser feita quando houver flora mista, podemdo usar o ágar tripticase soja (TSA). É um dos patógenos entéricos que tem a habilidade de crescer a 4 ºC (enriquecimento a frio em tampão fosfato). Os sorotipos O3, O8 e O9 crescem em ágar sulfito-bismuto, MacConckey, SS, XLD e Hektoen. Há relatos de contaminação por tranfusão sanguínea e preparados caseiros com tripas e em alimentos dessa natureza que foram armazenados em supermercados. Bioquímica: fermenta a sacarose, uréia, ornitina, lisina e arginina e tem motilidade a 37 ºC. Podemos utilizar a sorotipagem para confirmar. Outras sps de Yersinia, spp: Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis (linfadenite mesentérica em crianças, simulando apendicite.). 12-Clostricium difficile É uma espécie toxinogênica que causa enterocolite e diarréia associada a antibióticos (outra causa rara é o S. aureus). É encontrado na água, no intestino de animais, vagina e uretra de humanos, fezes de crianças e apenas 3 % das fezes de adultos sadios. É muito encontrado em adultos hospitalizados. Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 31 de 87
  • 32. Universidade Católica de Goiás Os antimicrobianos aplicados na doença gastrointestinal associada ao C. difficile incluem penicilina, clindamicina, lincomicina, metronidazol e anfotericina B. Este microrganismo é encontrado associado à colite pseudomembranosa, doenças intestinais inflamatórias inespecíficas, obstrução e estrangulamento do intestino. Ele elimina a flora normal por competição e produz a enterotoxina A e citotoxina B. 13- Staphylococcus, spp Provoca intoxicação alimentar, pela enterotoxina que fica incubada de 1 a 8 horas, com náuseas, vômitos e diarréia; a convalescência é rápida e não há febre. Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 32 de 87
  • 33. Universidade Católica de Goiás Novos gêneros e espécies de enterobactérias que causam infeccões em humanos: a) Cedecea davisae: Escarro(VAI) b) Cedecea lapagei: VAI c) Cedecea neteri: Hemocultura de paciente com valvulopatia d) Ewigella americana: sg, escarro e) Kluyvera ascorbata: sg, urina, fezes (pigmento púrpura escuro) f) Leclercia adecarboxylata: várias espécimes clínicas,água e comidas g) Leminorella grimontii: fezes e urina h)Tatumella ptyseos: escarro i) Trabusiella guamensis: Fezes (microbiota), não causa diarréia Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 33 de 87
  • 34. Universidade Católica de Goiás j) Yokenella regensburgei (similar a Hafnia alvei): VAS (orofaringe), escarro, fezes, ferida Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 34 de 87
  • 35. Universidade Católica de Goiás AULA 5 ANTIBIOGRAMA O antibiograma continua sendo na atualidade, o método mais utilizado na determinação da sensibilidade bacteriana devido à sua facilidade de execução, e mais do que isso, devido à sua boa correlação com resultados obtidos na prática clínica. Naturalmente, esta boa correlação está em função dos constantes estudos feitos por um grande número de pesquisadores de profundo conhecimento sobre a matéria. Os antibiogramas de antigamente utilizavam três concentrações de um mesmo disco de sensibilidade, mas hoje, depois de estudos, usa-se uma concentração só para cada disco. INDICAÇÕES, SELEÇÃO DOS DISCOS, INTERPRETAÇÕES E LIMITAÇÕES DO TESTE. Os testes de sensibilidade são indicados para qualquer organismo que contribui para a formação de um processo infeccioso de forma a garantir uma antibioticoterapia correta. Isto, naturalmente, se não pudermos predizer de antemão, conhecendo o organismo e a sua normal sensibilidade. Os organismos causadores de infecções devem ser identificados quase que simultaneamente com a realização da prova de sensibilidade. O teste é bem recomendado para Staphylococcus, spp e Enterobactérias, uma vez que tais organismos exibem regular resistência aos antibacterianos comumente usados. Como já foi dito, alguns organismos possuem sensibilidade conhecida frente a determinados agentes antibacterianos. Assim, por exemplo, é conhecida universalmente a aparente sensibilidade, nos EUA, do Streptococcus pyogenes e Neisseria meningitides à Penicilina. No entanto, o S. pyogenes originário de um paciente alérgico à Penicilina deve ser testado frente à Eritromicina e Tetraciclina para que se possa conhecer a sua sensibilidade. Cepas de Streptococcus pneumoniae que sejam resistentes à Penicilina são raramente encontradas, assim sendo, não requerem TSAQ, todavia o método de discos está estabelecido para estes organismos. Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 35 de 87
  • 36. Universidade Católica de Goiás Os testes de sensibilidade são também indicados nos estudos de resistência epidemiológica e nos estudos de um novo antibacteriano a ser introduzido, ou que tenha sido recentemente introduzido, no mercado. Recomenda-se que o teste de sensibilidade seja feito de colônias isoladas e supostamente patogênicas, partindo-se do isolamento primário. A mistura de diferentes organismos não deve ser submetida ao TSAQ. A prática de conduzir o teste de sensibilidade diretamente do material clínico também deve ser evitada, exceto em emergências clínicas nas quais o Gram direto sugere um único patógeno. Mesmo assim o teste deve ser repetido segundo determina a metodologia padrão. Quando a natureza da infecção não for clara e o material biológico contiver mistura de organismos ou flora normal, sendo que os organismos em questão guardem pouca relação com o processo infeccioso que está sendo tratado, os testes de sensibilidade são desnecessários e errôneos. SELEÇÃO DOS ANTIBACTERIANOS A SEREM USADOS ROTINEIRAMENTE Para se fazer um teste rotineiro razoável deve ser limitado o número de antibacterianos a serem testados. No geral, deve-se testar apenas um antibacteriano representativo de cada grupo com espectro de ação similar. Para evitar confusão é recomendado o uso do nome genérico do antibacteriano. De um modo geral, a seguite recomendação é feita na seleção dos antibacterianos: 1- Grupo das Penicilinas: Normalmente é conveniente testar o Staphylococcus, spp frente à Penicilinase resistente (PCR), tal como a oxacilina. O Staphylococcus, spp deve ser testado frente à Ampicilina ou Penicilina, mas não frente às duas. As enterobactérias devem ser testadas frente à Ampicilina e Carbenicilina. Proteus, spp e Pseudomonas aeruginosa devem ser testados frente à Carbenicilina. A Penicilina tem na sua estrutura um anel de tiazolidina mais ácido 6- amino-penicilânico que pode ser clivado por enzimas beta-lactamases, passando a ácido penicilinóico (inativo). Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 36 de 87
  • 37. Universidade Católica de Goiás O mecanismo de ação das Penicilinas é a inibição da síntese da parede celular das bactérias através do bloqueio das ligações cruzadas terminais dos glicopeptídeos lineares nos complexos glicopeptídicos (atua no quarto estágio). As formas L atuam mais em Gram positivos do que em Gram negativos (exceto Ampicilina e Carbenicilina). São produtores de beta-lactamases os: Staphylococcus, spp; Pseudomonas, spp; Haemophylus, spp e Coliformes. A administração é por via oral ou intramuscular, a absorção é rápida e a excreção se dá pelos rins. Uso clínico da PG: Streptococcus, spp; Neisserias, spp; Espiroquetas, Clostridium, spp; Staphylococcus, spp não produtores de beta-lactamases e bastonetes Gram positivos por via intramuscular; para infecções menores a administração deve ser por via oral. Ampicilina - infecções do TGU por coliformes; 2 a 3g por dia. Amoxilina - níveis mais elevados que a Ampicilina. As Penicilinas podem causar hipersensibilidade com irritações no SNC (encefalopatia, delírio e convulsões); o nível de toxicidade é de mais de 30g por dia. Por via oral causa diarréia. 2- Grupo das Cefalosporinas: Estão normalmente classificadas em três diferentes grupos: de primeira, segunda e terceira gerações; como elas têm espectro de ação diferente, deve- se usar apenas uma daquelas que não se correlaciona com as demais. Os Staphylococcus, spp são previsíveis quanto à sua sensibilidade às Cefalosporinas, exceto as cepas de S. aureus que são Meticilina resistentes (antibiótico que não tem no Brasil). Os enterococos são considerados resistentes às Cefalosporinas, porém, eles podem apresentar-se sensíveis sob certas condições do teste e a cura com algum antimicrobiano deste grupo poderá ocorrer, contudo, as Cefalosporinas não devem ser usadas rotineiramente frente a estes microrganismos. As Cefalosporinas são isômeros da Penicilina e atuam para Gram positivas e Gram negativas. São compostas pelo ácido 7-aminocefalosporânico (em lugar do 6- aminopenicilânico). Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 37 de 87
  • 38. Universidade Católica de Goiás Não devem ser usadas em meningites, mas podem ser administradas para infecções do trato urinário e respiratório. Proteus, spp e Klebsiella, spp são Cefalosporinas sensíveis. Enterobacter, spp, Serratia, spp e Pseudomonas, spp são Cefalosporinas resistentes. A Cefalordina é nefrotóxica e está sendo retirada do mercado. 3- Grupo das Tetraciclinas: As Tetraciclinas apresentam boa correlação na rotina laboratorial, contudo, algumas bactérias podem apresentar-se mais sensíveis à Doxiclina e Minociclina (novas), sendo que a Clortetraciclina é a mais instável. São absorvidas pelo trato intestinal, têm pouca ação no LCR e as mais novas têm uma excreção mais lenta. O seu modo de ação é a inibição da síntese protéica pela inibição da ligação do amino-ARN-t com as unidades 30s dos mini-ribossomos bacterianos. São bacteriostáticos e são drogas de primeira escolha para os casos de Clamidia e Mycoplasma, mas estimulam o aumento das leveduras. Existem, ainda, Staphylococcus, Proteus e Pseudomonas resistentes às Tetraciclinas. Têm médio espectro de ação. Apresentam como sintomas de toxicidade distúrbios gastrointestinais e erupções cutâneas; em gestantes causa danos hepáticos e crianças podem apresentar alterações na cor dos dentes. 4- Cloranfenicol: Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 38 de 87
  • 39. Universidade Católica de Goiás Distribui-se facilmente no SNC e LCR e ainda penetra nas células, mas é inativado no fígado quando está associado ao ácido glicurônico. Tem como modo de ação a inibição da síntese protéica dos microrganismos, sendo, portanto, bacteriostático. Atua bem em Neisseria (pacientes sensíveis à Penicilina), Salmonella, Haemophylus e bactérias anaeróbias. A resistência se dá através da enzima cloranfenicol-transferase. Os efeitos colaterais: distúrbios no TGI, aumento do ferro sérico e anemia aplástica; em recém-nascidos e prematuros provoca a síndrome da medula cinzenta. No TSAQ usa-se somente um disco. 5- Macrolídeos: Na prática atual só a Eritromicina necessita ser testada. Têm como modo de ação a ligação às subunidades 50s dos ribossomos. A Eritromicina é utilizada nas VAS e em infecções por Corinebacterium, spp (C. minutissimum causadora de eritrasma); A Espiramicina é usada nas VAS, a Oleandomicina nas VD, a Trioleandomicina nas VAS e a Leucomicinas nas VAS e VD. 6- Aminoglicosídeos: Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 39 de 87
  • 40. Universidade Católica de Goiás É neste grupo de antibióticos que estão incluídos a Amicacina, Gentamicina, Canamicina, Netilmicina, Tobramicina, Sizomicina, Ribostamicina, Dipecacina e Espectinomicina. O espectro de ação deles não é idêntico o suficiente para assegurar a resistência cruzada. Contém atividades bacterianas tóxicas. O seu modo de ação é a inibição da síntese protéica das bactérias. São ativos em pH alcalino, ototóxicas e nefrotóxicas, são carregados positivamente, e em hemoculturas são inibidos pelo sulfonato polietanetol de sódio e outros detergentes. As bactérias Gram negativas (enterobactérias) e as anaeróbias são resistentes aos aminoglicosídeos, mas eles são usados em septicemias e em Gram negativas. Particularidades: # Canamicina - é menos tóxica do que a Amicacina, bactericida para Gram negativas (exceto Pseudomonas, spp e Serratia, spp) e é nefro e ototóxica. # Amicacina - derivado sintético da Canamicina, no SNC atua sobre bactérias Gram negativas entéricas ou não (Pseudomonas), é nefro e ototóxica (oitavo par craniano). # Neomicina - tópica e das VD, é nefro e ototóxica. # Gentamicina - é bactericida para Gram positivas e Gram negativas (Proteus, spp; Pseudomonas, spp e Serratia, spp), os Staphylococcus, spp e bacterióides são resistentes, é altamente nefrotóxica. Tem uso tópico em queimaduras e lesões cutâneas. # Tobramicina - é ativa contra Pseudomonas, spp e é nefro e ototóxica. Não deve ser usada com diuréticos porque potencializa a ação desta droga. # Estreptomicina - é um bactericida (inibe a síntese proteica) bom para Mycobacterium tuberculosis (BK), Gram negativas e Gram positivas. É muito ototóxica. Pode ser associada à Isoniazida. # Espectinomicina - usada em infecções gonocócicas (gonorréia) = Tobricin. 7- Lincomicina e outras drogas: Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 40 de 87
  • 41. Universidade Católica de Goiás O ideal é testar somente a Clindamicina (derivado clorado da Lincomicina) para Gram positivas e infecções ósseas provocadas por Bacterioides fragilis Staphylococcus, spp. # Clindamicina - para anaeróbios e Bacterioides fragilis. # Vancomicina - bactericida para enterococos e Staphylococcus, spp em infecções sistêmicas. Pode cauasr surdez e dano renal. # Novobiocina - bacteriostática que inibe a síntese de ADN e ácido teitóico (membrana celular). É ideal para cocos Gram positivos, inclusive os produtores de beta-lactamases, e bacilos Gram negativos (Proteus, spp). # Rifamicina - inibe a síntese de ARN (bactérias e Clamydia, spp); na tuberculose é utilizada associada ao Etambutol. Antibióticos de uso tópico: Neomicina, Bacitracina, Furacin, Gentamicina (quimioterápico que atua em membrana e mucosa) e Nebacetin (bactericida para Gram positivas). # Polimixina-B e Colistina - polipeptídicos bactericidas para bacilos Gram negativos (Pseudomonas, spp). Seu modo de ação é envolver a membrans celular da bactéria e destruir sua função osmótica (detergentes catiônicos). 8- Quimioterápicos: # Nitrofurantoína - para Gram positivas e Gram negativas; # Furadantina - atua nas VGU; # Furacin - uso tópico; # Furoxona - uso nas VD; # Ácido nalidixico - VD e VGU; # Ácido oxolínico - VGU; # Ácido piperanídico - VGU; # Metronidazol - VGU e VAS; # Terizidona - VGU; # Sulfonamidas - uso sistêmico; # Sulfametaxazol-trimetoprim (Bactrim) - serve para fazer associações e para uso sistêmico. LIMTAÇÕES DO MÉTODO O teste com os discos foi padronizado para organismos de crescimento rápido tais como Enterobactérias, Staphylococcus, Pseudomonas, Acinetobacter e algunas Streptococcus, sendo que foi modificado para testar Haemophylus, Neisseria e S. pneumoniae. Os estudos nesta área não permitiram, ainda, uma padronização definitva para outros organismos que requerem condições anaeróbias para crescimento lento em ágar Müller-Hinton, ou ainda, para aquelas bactérias que apresentam Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 41 de 87
  • 42. Universidade Católica de Goiás taxa de crescimento diferente de cepa em cepa; estes microrganismos não devem ser testados pelo método de discos. OBSERVAÇÒES SOBRE O MEIO DE CULTIVO A adição de fosforilase, ou mesmo sangue lisado de cavalo, pode melhorar a difusão e auxiliar assim a confiança nos testes com Sulfonamidas e Trimetoprim com a maioria dos patógenos, exceto entrococos. A variação de íons Ca e Mg podem afetar resultados com Tetraciclina, Polimixina e Aminoglicosídeos frente a Pseudomonas aeruginosa. Cepas que não crescem em ágar Müller - Hinton deve-se acrescer sangue de carneiro a 5 % desfibrinado. Ágar chocolate (com sangue de carneiro) não serve para fazer TSAQ de Haemophylus, mas serve se acrescer 1 % de hemoglobina e um suplemento tipo Isovitaex (fator X e V) ou suplememnto sintético equivalente com pH ideal de 7,2. Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 42 de 87
  • 43. Universidade Católica de Goiás Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 43 de 87
  • 44. Universidade Católica de Goiás AULA 6 CULTURA DE ESCARRO Em laboratório clínico a pesquisa do escarro se destina à pesquisa de vários microrganismos que podem causar infecções na árvore brônquica e provocar secreções sanguinolentas ou não. As principais bactérias pesquisadas no escarro são: Mycobacterium tuberculosis (BAAR), Streptococcus pneumoniae, Haemophylus influenzae, Leigionella pneumophilla, Staphylococcus aureus e Fusobacterium nucleatum. A coleta pode ser feita através de aspirado brônquico ou punção transtraqueal. 1- Mycobacterium tuberculosis Quando o escarro chega ao laboratório, vários exames relacionados com BAAR podem ser solicitados: cultura, inoculação ou simplesmente o TSAQ. 1.1 - Coleta: escarro espectorado, colhido por nebulização ultrasônica ou por aspirado brôquico, logo pela manhã após o despertar preferencialmente sem assepsia bucal. As culturas podem se positivar ou se negativar com facilidade, por isso, faz-se necessário à coleta de três a cinco amostras, no mínimo (no princípio da manhã). Estas amostras devem ser refrigeradas e, no caso de amostras com flora bacteriana mista, deve-se fazer a descontaminação (liquefação do muco e impedimento no crescimento de bactérias contaminantes). 1.2 - Descontaminação: é feita com NaOH ou NALC (N-acetil-L-cisteína). O NALC é mucolítico sem atividade bacteriana (destrói as ligações dissulfeto); com a liquefação, as bactérias podem sedimentar com mais facilidade na centrifugação, que é o próximo passo. O NaOH a 2% (ou 3% em climas quentes) é o agente descontaminante. A neutralização do agente descontaminante pode ser feita com HCL ou NaOH concentrado. O NALC é vantajoso porque tem tampão fosfato que lava a amostra e mantém o pH ideal de diluir as substâncias tóxicas. A centrifugação deve ser feita a uma alta rotação (3800 rpm), o que possibilita a melhor pesquisa de bacilos em lâminas e maior positividade das culturas. Os Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 44 de 87
  • 45. Universidade Católica de Goiás lípides da parede celular das micobactérias estão em alta porcentagem, potanto, abaixam a densidade dos organismos, justificando assim o uso de alta rotação para a obtenção de melhores resutados. Técnica: * 10 ml de escarro em frasco estéril; * colocar o escarro em tubo de centrifugação com capacidade para 50 ml; * adiciona-se 10 ml de NALC mais NaOH a 2%; * agitar e deixar em repouso por 15 minutos (descontaminação); * homogeneizar com 30 ml de tampão fosfato com pH 6,8 (neutralização); Precauções: Não se recomenda o uso de Swabs para a coleta de micobactérias porque os lípides da parede celular são hidrófobos e inibem a transferência das bactérias dos Swabs para os meios aquosos. Se os Swabs forem utilizados, devem ser deixados em contato com o meio por quatro semanas. Como as amostras são extremamente perigosas, utilizar todas as medidas de segurança. 1.3 - Cultura: o meio mais empregado (considerado seletivo para micobactérias) é o de Lowestein-Jensen, modificado por Gruft, que contém ovos inteiros coagulados, sais, glicerol, farinha de batata e RNA-5 mg/100 ml; tem como agente inibidor descontaminante o Verde de Malaquita (0,025g/100ml), Penicilina (5ug/ml) e ácido nalidixico (35 mg/ ml). Existem outros meios, tais como: Lowestein-Jensen com Cicloheximida, Midlebrook 7H10 (usado para TSAQ) e 7H11 (seletivo de Mitchisen). 1.4 - Coloração: coram-se bem pela fucsina e descoram-se por solução álcool- ácido. Precisa da presença de 10.000 bacilos/ml para que possam ser detectados pelo microscópio ótico. Existe uma boa correlação entre esfregaço positivo e cultura positiva; quando o paciente sofre antibioticoterapia as culturas negativam primeiro que os esfregaços (impede a replicação, mas não a combinação com o corante). O número de bacilos do escarro informa sobre a resposta imune e o tratamento. As técnicas mais usadas são: * Ziehl-Neelsen - tem como corante de contraste o azul de metileno; as bactérias coram pela fucsina e resistem ao descoramento pela solução álcool/ácido. * Kinyoun - azul de metileno como corante de contraste; fucsina em maior quantidade para corar as bactérias e a solução álcool/ácido para descorar. * Flourocrômica - auramina fenólica, álcool/ácido e permanganato de potássio como contraste. Método para relatar o número de BAAR observados em esfrgaços corados: Número BAAR observados Método de relatar do CDC Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 45 de 87
  • 46. Universidade Católica de Goiás 1 a 2 em 300 campos Núm observ. ( + / - ) 1 a 9 em 100 campos Núm médio/10 campos (1+) 1 a 9 em 10 campos Núm médio/10 campos (2+) 1 a 9 por campo Núm medio/campo (3+) mais de 9 por campo Mais de 9/campo (4+) Quando a pesquisa de BAAR for negativa, o método de liberação relatado pelo CDC é: negativo para BAAR. 1.5 - Identificação de Mycobacterium tuberculosis: * Temperatura ótima e tempo de crescimento - as micobactérias crescem melhor a uma atmosfera de 3 a 11 % de CO2 sob a temperatura de 37 ºC, sendo que a 30 ou 42 ºC o seu crescimento é considerado fraco. No meio a base de ovo crescem em doze dias (seis ou mais semanas para cepas ocasionais). Existe um tipo de subcultivo feito em caldo 7H11 mais Tween 80 (polissobato) com uma diluição de 1:100, semeadura em estrias para colônias isoladas; o M. tuberculosis tem crescimento lento enquanto que o M. fortuitum tem crescimento rápido. * Produção de pigmentos - depende do fato de haver ou não exposição à luz ambiente (envolver o tubo com papel alumínio para evitar exposição). O M. tuberculosis não produz pigmentos, exceto uma cor camurça, mesmo quando exposto à luz intensa; Runyon separou as micobactérias atípicas de acordo com a sua fotorreatividade e produção de pigmentos. Grupo de Runyon Pigmentos Organismos I - Fotocromogênicas Carotenóide amarelo (luz M. kansasii forte) M. marinum M. simiae M. szulgai II - Escotocromogênicas Amarelo brilhante (luz ou M. scrofulaceum (escuras) escuro; intensifican a cor M. gordonae quando expostas à luz) M. flavescens M. xenopi (42 ºC) M. avium - intracellulare (complexo) III - Não Pouco pigmento amarelo M. malmoense fotocromogênicas claro que não intensifica a M. terrae Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 46 de 87
  • 47. Universidade Católica de Goiás cor com a luz. M. gastri M. nonchromogenicum triviali (complexo) M. haemophilum IV - Crescimento rápido Pigmento amarelo intenso M. fortuitum (crescem em 3 a 5 dias e M. chelonae, philey causam infecções cutâneas M. smegmatis ou oculares em pacientes imunossuprimidos) * Acúmulo de niacina - o M. tuberculosis não converte a niacina livre em niacina ribonucleotídea provocando o acúmulo de niacina hidrossolúvel em meio à base de ovo. No mercado existem algumas tiras de papel de filtro com reagente, a produção de cor amarela no meio indica positividade. * Redução do nitrato a nitritos - a bactéria tem nitroredutase, no meio tem nitrito; adiciona-se sulfonilamida alfanaftilenodiamina (corantes vermelhos). * Catalase - é uma prova diferente das outras provas de catalase; 30 % de peróxido de hidrogênio mais Tween 80 a 10 % (detergente - ajuda na dispersão das bactérias). Pingar uma a duas gotas sobre a colônia e dá formação de bolhas. A prova da aril-sulfatase é usada na diferenciação entre os grupos III e IV de Runyon. A formação de cor rosa no substrato, próximo ao crescimento bacteriano, após a adição de carbonato de cálcio - fenolftaleína livre - é uma prova positiva para micobactérias patogênicas para o homem ( M. kansasii, M. szulgai pulmonar e extra-pulmonar, M. malmoense e M. haemophilum). 1.6 - Prova de sensibilidade – TSAQ: as micobactérias têm resistência aleatória às drogas, mesmo sem serem expostas a estas drogas; os pacientes são, então, tratados com duas ou três drogas devido ao aparecimento de mutantes resistentes. O TSAQ é recomendado quando o paciente sofre reicidiva durante a quimioterapia. É aconselhável manter uma cultura de seis meses a um ano para o caso do paciente não responder à terapia. Concentrações das drogas (mg/mL) usadas em meios de cultura. DROGA CONCENTRÇÃO Tuberculostáticas MEIO DE LOW.-JEN. MEIO 7H11 Isoniazida (INH) 0,2 - 1,0 0,2 - 1,0 Ác. para-amino-salicílico (PAS) 0,5 8,0 Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 47 de 87
  • 48. Universidade Católica de Goiás Estreptomicina 4,0 2,0 Rifampicina 40,0 1,0 Etambutol 2,0 7,0 Etionamida 20,0 10,0 Canamicina 20,0 6,0 Capreomicina 20,0 10,0 Cicloserina 30,0 30,0 Pirazinamida NT NT * Prova direta: escarro pre-diluído e não diluído, colhido direto na placa, com bacterioscopia positiva. * Prova indireta: bacterioscopia realizada de uma colônia vinda de uma cultura pura isolada a partir da amostra clínica. O TSAQ direto é mais rápido (de três a quatro semanas) e o indireto mais demorado (cinco a sete semanas), mas a direta só é bem sucedida quando há muitos bacilos no material. As placas de Petri são divididas em quatro quadrantes, sendo que cada quadrante terá 5,0 ml de ágar: o primeiro não contém antimicrobianos (contraste), o segundo, terceiro e quarto terão concentrações variáveis da droga a ser avaliada (PAS, INH, Etambutol ou Rifampicina). O método de discos é eficaz e simples. 2- Legionella, spp Exitem várias espécies relacionadas à pneumonia e, consequentemente, o material clínico usado é o escarro ou aspirado brônquico. Podem ser encontrados esfregaços positivos pela coloração de Ziehl Neelsen, mas também pode-se fazer esfregaços fixados pelo metanol e corados pelo Gram. As espécies que causam pneumonia são: L. micdadei, L. dumoffii, L. bozemanii, L. longbeachae e L. pneumophila. O método mais sensível para a detecção de Legionella, spp é o teste de anticorpo fluorescente direto (DFA) que, quando realizado no escarro, pode ser considerado positivo se forem encontrados de 1 a 5 microrganismos. Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 48 de 87
  • 49. Universidade Católica de Goiás A cultura é feita em BCYE a 35 ºC em 5 a 10 % de CO2, (exames diários durante duas semanas), em 2 a 3 dias crescem colônias puntiformes, brilhantes, convexas, circulares ou pouco irregulares e com borda contínua. Apesar de serem bastões Gram negativos, não crescem em ágar Mac Conckey. Após crescimento pode-se fazer a prova de DFA para confirmar isolamento presuntivo. Tem-se, ainda, a IFI no soro. 3- Haemophillus influenzae A doença é geralmente crônica com exacerbação purulenta periódica. O paciente apresenta tosse improdutiva persistente, sibilo, dispinéia e respiração asmática característica. O material para exame é o escarro, lavado brôquico (bronquite) ou aspirado transtraqueal. A pneumonia por H. influenzae tipo B tende a ter distribuição lobar ou segmentar simulando uma pneumonia pneumocócica. Provas para H. influenzae: # esfregaços corados pelo Gram - centrifugar a amostra antes de fazer o esfregaço a partir do sedimento. Podem aparecer cocobacilos Gram negativos (podem corar de vermelho-laranja) característicos como filamentos pleomórficos. # esfregaços corados pelo Azul de metileno - coram-se em azul escuro a negro. # prova de Quellung (intumescimento de cápsula) - colocar uma gota de anti- soro de H. influenzae tipo B, adicionar uma gota da amostra clínica (ou suspensão colonial) e um pouco de solução de azul de metileno; quando positiva confirma a identificação. # detecção de anticorpos específicos capsulares - 5 minutos. # ELISA # aglutinação em látex e em lâmina. Existem 464 cepas diferentes de H. influenzae, sendo que os biotipos II e III são os mais isolados em culturas de escarro e material ocular em crianças de 1 a 5 anos. Os Haemophilus requerem fatores X, V e NAD para seu crescimento. Estes fatores são vendidos comercialmente em discos de papel que são aplicados sobre o ágar inoculado que em seguida é incubado na estufa por 24 h. Observar o crescimento ao redor do disco. Procedimento - cultura a identificar é colocado e em seguida em ágar de Haemophilus, spp ( BHI). Se for feito no Müller-Hinton colocar uma tira de fator X (hemina), outra de fator V e NAD sobre o ágar (1,0 cm de distância), incubar e fazer leitura: Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 49 de 87
  • 50. Universidade Católica de Goiás 1- H. aphrophilus - requer somente fator X 2- H. parainfluenzae - requer somente fator V 3- H. influenzae - requer fatores X e V 4- Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus e Streptococcus pneumoniae. Já foram vistos em aulas anteriores, bem como suas triagens. OBSERVAÇÃO: microrganismos anaeróbios podem causar pneumoniae necrotizante. Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 50 de 87
  • 51. Universidade Católica de Goiás AULA 7 EXSUDATO DE OROFARINGE As infecções na cavidade oral podem acontecer também na cavidade oral anterior (tendo como exemplos as gengivites marginais, gengivo-estomatites cremosas ou gengivites úlcero-necrotizantes). As patologias da cavidade oral posterior estão intimamente relacionadas com faringites, amigdalites, epiglotites, coqueluches, difteria, infecções nas paredes laterais ulceradas, glossites e infecções herpéticas. GENGIVITES 1- Gengivites marginais - acontecem às margens da gengiva, próximas aos dentes; é mais comum pela perda do suporte ósseo do dente criando bolsas dentárias (fendas gengivais e ósseas ao redor dos dentes). Isto promove maior acúmulo de bactérias e resíduos e a formação de cálculos levando à perda do dente. Os exsudatos são purulentos, acompanhados de edema e de dor. Os agentes são, normalmente, os Streptococcus mitis ou S. salivarius. O diagnóstico laboratorial é feito através da triagem para Streptococcus, spp. 2- Gengivite aguda - frequentemente se refere a esta afecção como gengivite ulcerativa necrozante aguda (GUNA) ou angina de Vincent (gengivite + infecção de garganta associada à Fusobacterium, spp + Treponema, spp ou Borrelia, spp). Não obedece a qualquer poder etiológico e não existe nenhuma evidência de que seja contagiosa, mas está frequentemente associada a organismos fusiformes (Fusobactérias, Borrelia, spp ou Treponema de Vincent). Quadro cliínico: infecção aguda associada à dor, odor fétido com ulcerações na boca e gengivas; pode haver sangamento sem febre e com linfadenopatia. Assemelha-se a gengivites causadas por discrasias sangüíneas ou infecções virais. Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 51 de 87
  • 52. Universidade Católica de Goiás Quadro laboratorial: faz-se exame direto do esfregaço com carbofucsina diluída (corante de Ziehl-Neelsen diluído com 10 a 15 volumes de água destilada) por quinze segundos. O diagnóstico é feito pelo encontro de muitos espiroquetas e bacilos fusiformes em meio a numerosos piócitos. A cultura não é necessária para o diagnóstico desta infecção. As bactérias desse tipo de infecção são anaeróbias. O tratamento é feito com Penicilina (1.000 a 1.500 mg/dia) ou Eritromicina como droga de segunda escolha. Observando sempre uma boa higiene não haverá reicidiva. Ë uma infecção que atinge mais adultos do que crianças sendo os fatores predisponentes a má higiene bucal e doença sistêmica. Quando a infecção chega à faringe esta é recoberta por uma pseudomembrana fina, amarelo-acinzentada. A coleta é feita com um Swab seco e o procedimento laboratorial é o mesmo da GUNA. 3- Gengivo-estomatite cremosa - há formação de porções esbranquiçadas sobre a gengiva suspeitando-se, quase sempre, de uma infecção por Candida, spp. Pelo Gram podem-se encontrar células leveduriformes e algumas pseudohifas Gram positivas no exudato. A cultura feita no Sabouraud ou ágar batata que é exame confirmativo. O tratamento é feito com Nistatina (Micostatin oral). FARINGITES E AMIGDALITES (TONSILITES) Os principais agentes etiológicos destas infecções na faringe e amígdalas são de origem bacteriana, sendo o S. pyogenes, flora normal faringeana de pessoas sadias, citado como o mais importante dos agentes. Este fato dificulta a diferenciação entre a doença e a colonização por este agente. No que se refere à lesão diftérica e estomatites, estas podem atingir a faringe, portanto, o estudo laboratorial para a detecção desses agentes etiológicos deve ser feito quando houver evidências clínicas. Microrganismos, tais como H. influenzae tipo B e S. pneumoniae são frequentemente identificados no laboratório como agentes de faringites, muito embora possam fazer parte da flora normal. Quando os pacientes estão hospitalizados, podem ser encontrados bacilos Gram negativos, como Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 52 de 87
  • 53. Universidade Católica de Goiás pneumoniae, porém, não são patógenos orofaringeanos e não devem ser relatados. Existam várias bactérias que podem causar infecções na orofaringe: S. aureus, Micobacterium gengivalis e M. hominis (BAAR), Corynebacterium diphteriae, N. gonorrhoeae e Actinomyces, sp (anaeróbio). A N. meningitides não é considerada como agente etiológico das faringites. Hoje em dia a faringite gonocócica é mais rara devido aos hábitos sexuais; por outro lado, é fundamental que o médico informe especificamente ao laboratório de que há suspeita de infecção gonocócica. Apenas nesses casos o material da garganta deverá ser semeado em meios de cultura especiais para N. gonorrhoeae (ágar chocolate em anaerobiose). O procedimento laboratorial depende do quadro da bacterioscopia direta, que vai indicar a predominância do agente etiológico. É necessário observar bem a morfologia das bactérias para uma triagem correta e isolamento fidedigno. A presença de cocos Gram negativos riniformes na orofaringe de crianças de 0 a 6 anos não sugere infecção gonocócica, pois, na flora normal dessas crianças há N. catarrhalis, que simula um quadro gonocócico. Existem bactérias filamentosas, Gram positivas, que podem ser encontradas na cavidade oral e que causam algumas infecções faringeanas (Actinomyces, spp que são anaeróbias). O ideal é que quando estejamos frente a algumas infecções de orofaringe, façamos lâminas para corar pelo Gram, Ziehl-Neelsen e Fontana-Tribondou. A difteria é uma infecção aguda causada por cepas toxigênicas, que são bacilos Gram positivos pleomórficos e claviformes (Corynebacterium diphteriae). Estes bacilos apresentam coloração uniforme e, quando em cultura velha, descoram-se facilmente. Possuem grânulos de reserva de polimetanofosfato, os quais são metacromáticos e conhecidos como corpúsculos de Volutina ou de Babes-Ernst. As cepas toxigênicas são lisogenizadas pelo fago beta e produzem uma toxina (sintetizada no local da infecção) que é absorvida e transportada por via hematogênica, causando efeitos tóxicos no coração e nervos periféricos. Os bacilos multiplicam-se na superfície das mucosas onde produzem a toxina que necrosa os tecidos adjacentes, provocando uma resposta inflamatória com formação da chamada pseudomembrana diftérica, composta de bactérias, epitélio necrosado, fagócitos e fibrina. O seu aparecimento ocorre, inicialmente, nas tonsilas ou faringe posterior, podendo atingir o palato e região nasofaríngea, laringe e traquéia. A difteria laringeana é, particularmente, perigosa devido à possibilidade de asfixia. A difteria cutânea é comum em regiões tropicais, mas tem-se observado o seu crescimento em outras regiões. Acredita-se que pesquisas rotineiras de C. diphteriae de lesões de pele poderão revelar alta incidência desta bactéria, Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 53 de 87
  • 54. Universidade Católica de Goiás determinando a pele como importante reservatório deste microorganismo. A difteria assemelha-se muito à angina de Vincent, sendo diferentes apenas no laboratório. Diagnóstico laboratorial: # Coleta do material - colhe-se com Swab que devem ser inoculados em meio de Loeffler ou Tinsdale para posterior encaminhamento. # Bacterioscopia - colorações em Gram, Albert Layborn e Azul de metileno de Loeffler. No Gram visualizam-se bacilos diftéricos pleomórficos Gram positivos. Em Albert Layborn, bacilos esverdeados com granulações de Volutina. Pelo corante de Loeffler, bacilos róseos. # Isolamento e identificação - os meios utilizados são: Tinsdale (com telurito de potássio), Loeffler e ágar sangue (para outros microorganismos como o S. pyogenes), incubados a 37 ºC por 6 a 18 horas. Após a semeadura no meio de Loeffler, devem ser feitos esfregaços do crescimento bacteriano, os quais são corados pelas técnicas já citadas. Para o isolamento das colônias suspeitas, as mesmas devem ser repicadas em meio Tinsdale. Neste meio as colônias de C. diphteriae são lisas, de cor cinza escuro, brilhantes e convexas com coloração marrom, não se prestando, porém, para colorações, testes imunoquímicos ou toxigenicidade, necessários para a identificação definitiva. Para tanto, as colônias típicas isoladas no Tinsdale, devem ser novamente repicadas em meio de Loeffler para posterior caracterização. As características do bacilo diftérico são: catalase positiva reduzem nitratos, não hidrolizam uréia, glicose e maltose positivas, CO2 positivo, sacarose e trealose negativas. Outro meio que pode ser usado é o CT (cistina e telurito) que é melhor e mais duradouro do que o Tinsdale. # Pesquisa de toxina diftérica - In Vitro, a prova de Elek e In Vivo a prova de letalidade em cobaias. As provas devem ser padronizadas e o técnico bem treinado. Espécies de interesse: C. diphteriae, C. ulcerans, C. haemoliticus, C. aquaticum, C. pseudodiphteriticum (hoffmanii), C. xefrosis, C. pyogenes renale, C. pseudotuberculosis (ovis) e C. bovis. Observações: O C. ulcerans pode causar faringite pseudomembranosa, porém, não produz toxina. Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 54 de 87
  • 55. Universidade Católica de Goiás AULA 8 DOENÇAS SEXUALMENTE TRANSMITIDAS – DST. INTRODUÇÃO As DST exigem uma transmissão por contato direto íntimo representado pelo coito. É difícil determinar quando a promiscuidade sexual, prostituição por excelência, passou a ser estigmatizante, mas, seguramente, a estigma passou a acompanhar as doenças a elas ligadas. A partir do último quarto do século passado, os diferentes quadros e seus diferentes agentes passaram a ser identificados. A multiplicidade de variações sexuais tem proporcionado não só um novo mecanismo de transmissão para doenças classicamente não relacionadas, mas também a disseminação das venéreas. Dessas considerações de longa data a União Brasileira contra doenças venéreas tem visto a denominação de DST não como uma expressão apenas estigmatizante, mas uma visão epidemiológica nova para um problema antigo. Vemos nas DST um grupo de doenças endêmicas de múltiplas causas que incluem as doenças venéreas em um número crescente de entidades clínicas e síndromes que tem como traço comum a transmissão durante a atividade sexual. Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 55 de 87
  • 56. Universidade Católica de Goiás GONORRÉIA Tem como agente a Neisseria gonorrhoeae. A contaminação pode ser sexual e acidental; está em 1° lugar entre as DST, tendo como faixa etária mais acometida entre 15 e 30 anos e predominando no sexo masculino. Causas de manutenção da endemia: 1) Fatores relacionados com sexo (promiscuidade sexual, homossexualismo, prostituição etc); 2) Atitude pública (indiferença ao contágio e auto medicação); 3) Fracasso das autoridades sanitárias; Período de Incubação: O período de incubação é de 2 a 10 dias; existem relatos de 24hs e casos que ultrapassam 15 dias. Agente Etiológico: São cocos gram negativos riniformes agrupados 2 a 2 com faces côncavas, aeróbios, imóveis, sensíveis a antissépticos e morrem fora do habitat. São intra e extra celular e suas características morfotintoriais podem estar alteradas nos processos crônicos ou após antibioticoterapia. A característica extra celular é da fase aguda. Foi determinado recentemente o fator R (plasmïdio de resistência às drogas) e os achados mais recentes são as cepas capsuladas. É uma doenças exclusiva de seres humanos. Meio de Cultura: 1) Ágar Sangue (não hemólise); 2) Ágar Ascite; 3) Ágar Chocolate; Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo. Página 56 de 87