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3. crescimento-microbiano
- 2. Cultivo e Crescimento de Micro-organimos Everlon Cid Rigobelo 2
- 3. Objetivos • Cultivo laboratorial de Micro-organismos – Técnica asséptica • Meios de cultura • Meios sólidos • Meios Líquidos 3
- 4. Objetivos • Crescimento de micro-organismos – Crescimento de bactérias – Crescimento de Fungos – Multiplicação dos vírus 4
- 5. Objetivos • Métodos utilizados para a contagem do crescimento de micro-organismos – Contagem em placas – Contagem em lâmina – Turbidimetria 5
- 6. Micro-organismos Escherichia coli Aspergillus niger Bacteriófago Fonte: www.hyperscience.com 6
- 7. Finalidade de cultivo • Isolar e identificar • Testes utilizados: – Tintoriais, morfológicos, bioquímicos sorológicos e moleculares 7
- 8. Morfologia dos Micro-organismos Vírus animal Bactérias do solo Micorrizas Fonte: www.hyperscience.com 8
- 9. Testes de Identificação Teste Tintorial Teste Bioquímico Teste Molecular Teste Sorológico Fonte: www.rehagro.com.br 9
- 10. Importância dos micro-organismos Doenças de Planta Álcool e Bebidas Bactericidas Produtos Láctios Probióticos Antibióticos Fonte: www.brasilescola.com.br 10
- 11. Cultivo laboratorial de micro- organismos • Cultura com um único micro-organismo – Ausência de contaminantes – Meios sólidos crescimento das colônias – Uniformidade das colônias Cultura Pura Fonte: www.worldespress.com 11
- 12. Cultivo laboratorial de micro- organismos • Técnica asséptica – Meios esterilizados – Câmara de fluxo laminar – Uso da chama do bico de Bunsen Esterilização calor úmido Fonte: www.worldespress.com 12
- 13. Técnicas Assépticas Fluxo Laminar Bico de Bunsen Fonte: www.worldespress.com 13
- 14. Cultivo de micro-organismos • Meios de Cultura – Soluções nutrientes crescimento microbiano que promovem o • Classes de meios de cultura – Meios definidos e meios complexos Agar Sangue Fonte: www.biomedicinamicro.com 14
- 15. Meios Definidos • Quantidades precisas de compostos: – Orgânicos e inorgânicos – Fonte de Carbono – Origem e a concentração da fonte de Carbono • Depende – Do micro-organismos cultivado 15
- 16. Meios Complexos • Digestos de produtos animais ou vegetais – Caseína (proteína do leite) – Carne (extrato de carne) – Soja (caldo tríptico de soja) – Células de leveduras (extrato de leveduras) Agar Trípico Soja Fonte: www.biomedicinamicro.com 16
- 17. Meios Complexos • Possuem substâncias altamente nutritivas • Porém impuras • Comercializados na forma de pó – Pesados e dissolvidos em água destilada Agar Seletivo Fonte: www.biomedicinamicro.com 17
- 18. Meios Complexos caseína Extrato de carne Trípico de soja Extrato de Levedura Fonte: www.biomedicinamicro.com 18
- 19. Meios Seletivos • Inibem seletivamente micro-organismos – Presença de compostos o crescimento de Agar Baird Parker Fonte: www.pvl.pt 19
- 20. Meio Diferencial • Possui um indicador Agar TSI – Permite a diferenciação de reações químicas – Específicas que ocorrem durante o crescimento • Alguns microrganismos realizam: – Reações particulares outros não – São úteis na distinção e espécies bacterianas 20 Fonte: www.pvl.pt
- 21. Meio Sólido • Adição de um agente gelificante aos meios líquidos • Vantagens – Imobilizam as células – Crescem em massas isoladas e visíveis Agar NI Fonte: www.mkldiagnostic.com 21
- 22. Agar Alga da classe Rodophyta Agar Agar Mitis Salivarius Fonte: www.mkldiagnostic.com 22
- 23. Crescimento de Bactérias • Fase elongação – Podem atingir o dobro do comprimento • Formação do septo – Crescimento da membrana plasmática – Parede celular no interior da célula • Divisão – Formam partição que divide a célula em duas 23 Fonte: www.mkldiagnostic.com
- 24. Fissão Binária • Geração • Tempo de geração 24
- 25. Crescimento de bactérias • Culturas de batelada – Sistema fechado – Sofre alterações contínuas – Atividades metabólicas dos micro-organismos – Alterações drásticas na composição química e física dos meios de culturas 25
- 26. Culturas de Batelada FermentaçãoAlcoólica Fonte: www.shared.com Usina Sucro alcooleira Fermentação Acoólica 26
- 27. 27
- 28. Ciclo de Crescimento Microbiano • Fase Lag – Pouca ou ausência de divisão celular – Síntese enzimática e de moléculas variadas – Pode ser curta ou longa dependendo das condições fisiológicas do inóculo – Aumento da quantidade de proteínas no peso seco, e no tamanho celular 28
- 29. Ciclo de Crescimento Microbiano • Fase Exponencial – Crescimento Exponencial das células – Tempo de geração constante • Taxa de Crescimento Exponencial – Número de gerações por Unidade de Tempo – Será curto ou longo dependendo da disponibilidades de nutrientes – Estudos enzimáticos são realizados nesta fase 29
- 30. 30
- 31. Ciclo de Crescimento Microbiano • Fase Estacionária – Não se observa crescimento microbiano – Podem prosseguir o metabolismo energético e processos biossintéticos – Consumo de um nutriente essencial – Acúmulo de um produto de excreção do organismo 31
- 32. Ciclo de Crescimento Microbiano • Fase Morte – Número de células mortas excede o de células vivas – A taxa de morte pode ser inferior a taxa de crescimento exponencial – A contagem total permanece constante, enquanto que a taxa de células viáveis cai lentamente – Pode ocorrer lise celular 32
- 33. Cultura contínua: quimiostato • Culturas são mantidas constantes – Longo período de tempo – Sistema aberto – Mantém um volume constante – Adicionado um meio de cultura fresco a uma taxa constante – Remove-se o mesmo volume de meio usado 33
- 34. Cultura contínua: quimiostato • Cultura contínua – Sistema em equilíbrio • O volume do quimiostato – Número de células e a quantidade de nutrientes – Permanecem constantes 34 Fonte: www.podcastmicro.com
- 35. Quimiostato • Permite o controle – Taxa de crescimento populacional da cultura – Densidade populacional da cultura • Fatores importantes para esse controle – Taxa de diluição – Concentração de um nutriente limitante C - N 35
- 36. Crescimento em Fungos – Crescimento e disseminação de filamentos de hifas – Produção assexuada de esporos – Produção esporos sexuais – Simples divisão celular - brotamento 36
- 38. Crescimento de vírus • Vírus – Parasitas obrigatórios – Crescimento utilizando a maquinaria celular da célula hospedeira 38 Fonte: www.infoescola.com
- 39. Multiplicação dos Vírus • Multiplicação do vírus – Culturas de células – Hela, Vero, BHK, IBRS2 Células de Fibroblastos 39 Fonte: www.infoescola.com
- 40. Multiplicação dos Vírus • Inoculação em ovos embrionados Vias de Inoculação Lesões Virais 40 Fonte: www.infoescola.com
- 41. Multiplicação Viral • Animais de Laboratório 41 Fonte: www.infoescola.com
- 42. Medidas do Crescimento Microbiano Contagem de Células Totais Contagem de Viáveis Verificação da Turbidez Medidas do Crescimento Microbiano 42 Diretas Indiretas
- 43. Medidas de Crescimento • Contagem Direta – No número de células viáveis – Alterações na concentração componente celular de algum – Proteínas, ácidos nucleicos e peso seco das próprias células 43
- 44. Medidas de Crescimento • Contagem de Células Totais – Contagem microscópica células – Amostras secas ou líquidas • Amostras secas – Podem ser coradas para aumentar o contraste em as células e o fundo 44
- 45. 45 Medidas Diretas do Crescimento Microbiano • Contagem em placas – Contagem das células viáveis – Cada colônia é originada de uma única bactéria (UFC) – Inóculo original é sempre homogêneo – Não existe agregação de células • Desvantagem: precisa de 24 horas de incubação
- 46. Contagem de Células Viáveis • Viável – capaz de se dividir • Contagem do número de células em uma placa – Capazes de formar colônias – Contagem de placa • Método da semeadura por espalhamento • Método da semeadura em profundidade 46
- 47. 47
- 48. Método da Semeadura por Profundidade – Volume de 0,1 – 1mL – Pipetado em uma placa de meio estéril – Adiciona-se meio de cultura fundido – Mistura-se com movimentos delicados • Formação de colônias por toda a placa – Não somente na superfície do ágar 48
- 50. Medidas Diretas do Crescimento Microbiano • Contagem em Lâmina – Utilização de câmaras de contagem (Neubauer) – Lâmina quadriculada de área conhecida (grid) – Lamínula sobre a superfície da lâmina de vidro 50 Fonte: www.infoescola.com
- 51. 51 Limitações da Contagem Microscópica • Apesar de serem rápidas e simples • Limitações são: – Não se distingue células vivas e mortas sem coloração especial – Células pequenas são de difícil visualização – Técnica pouco precisa – Células móveis precisam ser fixadas
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- 53. Método da Semeadura por Espalhamento – Volume de 0,1mL – Espalhado sobre a superfície do meio sólido com o auxílio de alça – Incubação da placa e crescimento – Contagem do número de colônias 53
- 54. Contagem por Turbidimetria • Medição do aumento de componentes celulares – Proteínas, DNA e peso seco de uma cultura • Medidas de turbidez – Suspensão celular – aspecto turvo – Quanto maior o número de células – maior a luz dispersa – Avaliação da massa total de células proporcional ao número de células 54
- 57. Contagem de Vírus • Placas de Lise – Inoculação do vírus em culturas celulares – Contagem de células lisadas – Cada célula equivale a um vírion • Teste de Elisa – Número de ligações entre os vírus e o anticorpo 57
- 58. Contagem de Vírus em Placas de Lise 58
- 60. Temperatura e Crescimento Microbiano • Temperatura – Fator mais importante que afeta o crescimento microbiano – Temperaturas muito frias ou muitos quentes os micro-organismos não são capazes de crescer – As temperaturas máximas e mínimas refletem a variação da temperatura média de seus hábitats. 60
- 61. 61 Classes Térmicas de Micro- organismos • Psicrófilos – Temperaturas baixas • Mesófilos – Temperaturas medianas • Termófilos – Temperaturas altas • Hipertermófilos – Temperaturas muito elevadas
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- 63. 63 Fatores que influenciam a atividade enzimática • Temperatura – Em altas temperaturas, as enzimas sofrem desnaturação e perdem suas propriedades catalíticas – Em baixas temperaturas, a taxa de reação diminui • pH – pH no qual a atividade enzimática é máxima é conhecido como pH ótimo • Concentração do substrato – Dentro de limites, a atividade enzimática aumenta com o aumento da concentração do substrato
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- 66. 66 Literatura Consultada Microbiologia de Brook, Michael T. Madigan, 2010. Pelczar, Jr., Joseph Michael. Microbiologia,