4ª DiagnóStico Laboratorial

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4ª DiagnóStico Laboratorial

  1. 1. Mad I Aula:17/08 Diagnostico laboratorial A importância do diagnostico através de teste de laboratório: Existem doenças virais que são clinicamente semelhantes, como por exemplo, as hepatites viral. Essas doenças só podem ser diagnosticadas por exames laboratoriais, pois suas complicações clinicas são muito semelhantes. Ainda sim as Hepatites B e C, importante o acompanhamento do paciente, e esse monitoramento e feito em exames laboratoriais. O diagnostico para determinar a conduta de um paciente, como por exemplo, a diferenciação de meningites virais e bacterianas. Filhos de mãe portadores de hepatite B, todas mulheres q no pré-natal as portadoras de hepatite B, e isso e conhecido por exames laboratoriais quando grávida essa mulheres tem todo procedimento partícula, como por exemplo a utilização de parto cessaria, e a vacinação dos bebes, e ate a soro conversão do bebe essa mãe n pode amamentar. Um cão com suspeita de raiva, o diagnostico é feito em laboratórios. Diagnostico de rubéola congênita, mulheres q durante a gravidez q tiveram suspeita de rubéola na gravidez e assim coleta-se soro do cordão umbilical e pesquisa-se IgM nesse soro de cordão. Métodos laboratorias: O que coletar para diagnosticar uma infecção: Os vírus são muitos diversos e cada doença tem um a forma de entrada e tem uma forma de ser eliminado e isso vai depender da infecção que o paciente esta tendo. Em linhas gerais, as doenças são divididas por síndromes respiratórias, genitais, entéricas, oculares, do sistema nervoso central ou de pele e isso vai determinar a forma de coleta e transporte do espécime. Na duvida do que coletar, coletas matéria na porta de entrada do vírus. No caso das infecções respiratórias, em geral, existem alguns espécimes que você pode coletar secreção nasal ou de garganta, aspirado naso-faringeano. Esse muco é coletado por intermédio de uma bomba de sucção. Outro espécime é o suab, que faz raspagem do local a ser pesquisado e a partir da você faz o diagnostico laboratorial. No caso de infecção entérica a espécime clinica é as fezes. No de infecções de mucosas com porta de entrada ocular e genital utiliza-se o suab. Vírus que causa lesões de pele, que se apresentam como vesículas você também utiliza suab ou coleta do tecido ao redor da lesão. No caso de infecções do SNC, utiliza-se o liquor. Em outras situações coleta-se o sangue, onde será importante a pesquisa de vírus e anticorpos. No caso de necropsia a coleta de tecido para pesquisa vai diagnosticar a causa mortes do individuo. Na coleta de tecido, utiliza-se s fixação e desidratação das células.
  2. 2. O transporte da espécime clinica também é importante que de uma forma adequada. No caso dos suabs eles são transportados dentro de um tubo de ensaio com uma solução de sais, com um pH controlado e antivirais e antibióticos para proteger aquele espécime clinica de outro agente patológicos. No caso de que você retira com fezes e urina você transporta na forma de resfriado, nesses casos a temperatura depende do tempo de transporte. O sistema mais utilizado é o gelo seco, que mantém a temperatura estável. Existem três formas principais de se diagnosticar as infecções virais: 1- Aumento clássico de diagnostico, isto é isolamento do vírus num sistema hospedeiro. Ou seja, com um agente infeccioso, inoculando essa espécime clinica suspeita numa célula susceptível e vai observar a propagação desse vírus no sistema hospedeiro. Os métodos mais empregados na rotina, que consiste na detecção direta pela observação da partícula viral e a pesquisa de antígenos virais que são os métodos imunológicos, Elisa aglutinação, imunofluorescência e a pesquisa de genoma viral, por métodos moleculares como o PCR, esses são os métodos rápidos com resultados em media em 1 hora. A pesquisa da sorologia, ou seja, a pesquisa de anticorpos específicos para esse vírus. Figura: Aqui mostra o perfil de uma infecção viral. No ponto 0 (zero) mostra o momento da infecção. A partir daí, o paciente esta na fase de incubação que varia de tempo dependendo do vírus e do organismo infectado, este período. Esse período corresponde ao tempo que o vírus leva para chegar ao órgão alvo e causar nesse uma lesão. Esse período é o que antecede o período da fase aguda. A presença de vírus pode ser detectada desde o período de incubação, então na verdade a parir do inicio da fase aguda você tem o Maximo de vírus no organismo, a partir dai a quantidade de vírus vai diminuindo pela ação do sistema imunológico. A pesquisa de anticorpos esta relacionado a IgM, na fase aguda e IgG que esta relacionado ao período de convalescença. Assim, percebe-se a escolha do método depende da fase em que a infecção viral esta nesse organismo.  O método clássico de diagnostico é o isolamento, que consiste na inoculação em sistema hospedeiro (culturas celulares ésteres), a espécime clinica numa célula susceptível. Mas para isso você utiliza métodos de tratamento, retirando tudo que não seja vírus dessa amostra. Esse método depende de uma única partícula viral infecciosa (virion), teoricamente, que dará origem a milhares de vírus o que faz dessa partícula, uma partícula infecciosa. Mas nem todos os vírus se propagam en vitro.
  3. 3. Métodos Imunológicos: métodos que detectam antígenos virais, todos esse também detectam anticorpos. Esses métodos para detecção de antígenos são divididos em 2 grupos. Os primeiros utilizavam reagentes não marcados, como imunodifusão. Esse método utiliza uma lamina de agarose, faz dois orifícios e em um coloca-se anticorpo e no outro o antígeno correspondente, antígeno anticorpo se difunde, assim forma um complexo imune q precipita, formando uma linha que visível a olho nu. A eletroforese aumenta a velocidade desse processo. Essas técnicas são poucos visíveis porque se necessita de muito antígeno ou muito anticorpo para ocorrer detecção, essas foram substituídas por reações que utilizam reagentes marcadas, como a floresceina, os isótopos radioativos, essas reações são mais sensíveis do que as primeiras. Assim, diminui a chance de dar um falso negativo. A Hemoaglutinação, que embora seja uma técnica de baixa (.....), é muito utilizada na praticas laboratoriais com anticorpos hemoaglutinantes. Existem sítios que apresentam na sua superfície uma proteína chamada de hemaglutinina, essa proteína fica na superfície dos envelopes de vírus como o vírus influenza, o vírus da dengue, o vírus do sarampo. A simbologia dessa proteína é HÁ, e tem a propriedade de aglutinar hemácias. Assim, desenvolveram se uma reação pra detecção de vírus hemaglutinantes baseados nessa propriedade, Exemplo se você tem um paciente com suspeita de influenza, você inocula no ovo embrionário. A partir dai, com a replicação viral, você colhe a suspensão viral e faz reagir com uma solução de hemácias. Essa hemácia tem estar tratada. Então ocorre uma interação da hemácia com o vírus, essa reação então é processada uma microplaca, como por exemplo, de Elisa. Assim se houve vírus a hemácia permanece em suspensão, caso não tenha vírus, as hemácias aglutinam e precipitam. A outra metodologia chamada de inibição de hemaglutinação se presta a dois propósitos ou o 1º que é mais utilizado na detecção de anticorpos destinados contra essa hemaglutinina, ou para confirmar o resultado acima. Os primeiros testes para dengue partiam desse principio, assim coletavam-se o soro (sangue) do paciente e nesse soro o objetivo é saber se têm anticorpos direcionados por vírus da dengue. Esses anticorpos vão reagir com o vírus da dengue, no laboratório para revelar essa reação, você joga hemácia, assim vai pode-se observar dois processo. Ou vai ocorre a reação do vírus com a hemácia, quando não houver anticorpo, levando a hemaglutinação. Mas quando houver anticorpo, esse vão se ligar nos sítios dos vírus, logo, impossibilitaram a ligação das hemácias com o vírus, e com isso, provocam aglutinação das hemácias no recipiente. Métodos que empregam reagentes marcados: Imunoflorescência e Elisa.
  4. 4.  Imunoflorescência: utilizado na pesquisa de antígenos virais em células. Por exemplo, o diagnostico de raiva, que é a pesquisa do antígeno rabico. É coletados o tecido nervoso de cães com suspeita de raiva. As células são depositadas em laminas de microscópios óticos. Assim, essas lâminas são desenhadas pela imunofluorescencia em locais onde você pode detectar amostras pareadas especificamente. Depois se adiciona laminas anticorpos específicos marcados com corantes, como a fluoresceina. Assim caso essas células tenham antígenos específicos para raiva, quando esses anticorpos forem adicionados, eles vão reagir com os antígenos e a partir daí, você lava a lâmina, logo, esses anticorpos ficam ali grudados, e depois se coloca no microscópio de fluorescência. Logo ao ser excitado por uma luz fluorescente esse corante emite uma luz verde, por exemplo, o que permite a leitura visual nesse microscópio. Esse método pode confirmar, após um exame positivo de Elisa, a suspeita de HIV positivo.  E.L.I.S.A (ensaio imunoenzimático): o método mais utilizado em laboratórios. Na pesquisa de antígenos, como por exemplo, o HGsAg. Assim em cada cavidade da microplaca de Elisa, você adiciona anticorpo contra o antígeno q você quer pesquisar. Esses anticorpos estão revestindo totalmente a cavidade das microplaca. Assim se nesse soro houver HGsAg, ele vai se ligar nos anticorpos. A pos esse evento, você adiciona mais anticorpos anti HBsAg liga a uma enzima, por exemplo a peroxidase. Logo pra você enxergar a reação você adiciona peróxido de hidrogênio ligado ao cromógeno, esse Dara a cor da reação. Ele é normalmente incolor, que quando a enzima oxida esse cromógeno ele vai colorir o ambiente da microplaca. A intensidade da cor vai variar diretamente proporcional a quantidade de antígeno na amostra.  Técnica de Westn Blot: utiliza como método complementar de detecção de algumas infecções, como HIV e hepatite C. Quando você tem um resultado mais para essas infecção, você pode utiliza essa técnica. Ela conjuga duas metodologias, a primeira é a separação eletroforética das ptn e a outra é o Elisa. Assim uma suspensão viral é submetida a esse processo, colocado num gel, e submetendo à corrente elétrica, promovendo movimentação. Essa movimentação vai ser diretamente proporcional a peso molecular. Assim no final, você vai ter banda vista no gel, onde você vai ter todas ptns viral separadas. Logo você transfere esse gel a uma membrana de nitrocelulose. Esse papel é recortado em laminas, separando todas as ptns do vírus por peso molecular. Assim quando você adicionar o soro do paciente, os anticorpos vão se ligar nas ptn especificas então você tem uma discriminação contra que anticorpos apresenta.
  5. 5. Essa pesquisa de antígenos pode ser realiza para detectar antígenos em tecidos, ou seja, faz uma biopsia, você pode detectar antígenos virais na célula daquele tecido. Assim você pode utiliza o Elisa ou a imunoflorescência. Hibridização: o resultado positivo mostra a forma de um híbrido, onde numa cadeia a seqüência nucleotídica do genoma do vírus é pareada a outra que complementar a formação de híbrido e a sua sombra, marcada para poder enxergar-se. O exemplo e o diagnostico de HPV, em biopsia de amostras retiradas de lesões sexuais. Digamos que uma pessoa está com suspeita de infecção de HPV, o diagnostico é feito com a coleta das células das lesões essas células são depositadas em laminas de microscópios, e o objetivo do exame é pesquisar o genoma viral naquela amostra. Mas o genoma não esta disponível para detecção. Pois o DNA esta em dupla fita pareada e fechada. Para que você possa rastrear esse genoma e assim detectá-los, antes de tudo você precisa desnatura essa dupla fita, ou seja, abrir a dupla fita do DNA. Esse processo e conseguido com a elevação de temperatura, e assim fica passível de ser detectada. Essa detecção ocorre adicionando-se sonda, sonda q nada mais é do que uma seqüência nucleotídeos complementar marcada, com, por exemplo, uma enzima, assim essa sonda se for complementar ela se liga a fita alvo a ser pesquisada e ocorre a formação do híbrido, se a sonda n for complementar após a lavagem ela é retirada, e não ocorre visualização. A revelação é feita com a adição do substrato da enzima com um cromógeno. Ai o resultado é o desenvolvimento de cor, logo se houver células infectadas por HPV, vai aparecer à cor do cromógeno, se na houver não aparecera a cor. DA mesma maneira essa sonda pode ser marcada com o isótopo radioativo, mas nesse caso a revelação é diferente, pois se utiliza um filme de raios-X, obtendo-se a impressão da radioatividade mediante aquela sonda que esta ligada ao genoma do vírus HPV. Atualmente os laboratórios trabalho com enzima, pois a utilização de isótopos radioativos necessita de um serie de prejuízo não só em relação à saúde porque é um a substancia cancerígena, como ele tem uma meia vida curta, embora ele tenha uma ótima sensibilidade, os laboratórios essencialmente trabalham com substancias não radioativas. A reação de hibridização é uma reação bastante sensível, agora ela não amplifica, você vai detectar o q tiver de genoma ali na amostra, já o PCR como reação molecular ele tem a grande vantagem de amplificar o que você possa ter no amostra, logo a aplicabilidade tem suas as vantagens no caso. O PCR é figurinha fácil nos laboratórios de pesquisa e utiliza fundamentos de síntese, é uma técnica que permite que você sintetize em vitro uma determinada seqüência alvo, na verdade você faz artificialmente o q ocorre naturalmente no corpo, ou seja, sintetizar uma seqüência de DNA. Os princípios são a reação da polimerase em cadeia, que permite a amplificação
  6. 6. de uma seqüência especifica de DNA, mas para tanto você precisa conhecer a parte dessa seqüência, a fim de selecionar os primeres ou oligonucleotídeos, que são pequenas seqüências de nucleotídeos que vão delimitar a porção do que você que amplificar no DNA. Eles vão atuar como iniciadores para que a tac polimerase, que só se liga se tiver o primer liga a fita de nucleotídeos. Essa reação ocorre num aparelho chamado termoficador, de controla a temperatura em questão de segundos, eleva e abaixa a temperatura para que você possa ter esse processo de síntese. A cada ciclo do PCR eh feito com três etapas, desnaturação; hibridização dos oligonucleotideos; polimerização. A partir de um DNA alvo, que você quer amplificar. Assim você desnatura essa dupla fita, com um processo de elevação da temperatura em torna de 90 graus, a fim de abrir a dupla fita de DNA, feito pelo termoficador, e todos os dna que estiverem na amostra vão abrir suas cadeias. Em seguida essa temperatura é abaixa para em torno de 50 grua, a fim de promover a ligação dos primeres à dupla fita, assim cada oligonucleotideos vai se ligar na sua fita complementar, ou se liga numa fita e outro na outra fita, isso acontece em torno de 50º graus, nessa temperatura os primeres são capazes de ligar-se a fita, essa parte é chamada de hibridização. Em seguida n terceira etapa, a temperatura eleva-se um pouco, e fica em torno de 70º grau, essa temperatura é ótima para o funcionamento da tac polimerase. Essa enzima foi o grande achado para a reação do PCR, ela foi descoberta em bactérias de águas termais e não sofre desnaturação em temperaturas elevadas, ate 90º graus, o q é imprescindível, porque qualquer outra ptn seria desnaturada a essas temperaturas. Na terceira etapa do ciclo corresponde a polimerização da cadeia complementar, então a tac vai se ligar aos primeres e construir a cadeia complementar, logo a partir de uma você forma duas novas. Isso é um ciclo do PCR, esse ciclo se processa n vezes, de 20 a 30 vezes, o resultado disso, no final do processo você vai ter 2 elevado a n copias , onde n é o numero de ciclo, então esse processo é uma projeção geométrica de produção de DNA. Logicamente a reação de PCR é antecedida de uma etapa de extração. Digamos q você esta com um aspirado naso-faringeano, amostra fecal, ou com sangue, você precisa extrair o dna para fazer a reação, separando do espécime clinica o dna alvo, e ai você vai identificar se tem o genoma do vírus em questão está presente. No final a reação vai apresentar vários pedaços de DNA, e você prova se o dna viral em questão é do vírus correspondente, a forma mais simples de leitura é você corre num gel de eletroforese, você vai faze o gel, numa bacia você adiciona agarose, no momento q solidifica, você abre as canaletas, onde você vai colocar suas amostra, logicamente você vai ter sempre um padrão de peso molecular para a corrida. Quando você seleciona os primeres, você sabe
  7. 7. exatamente o tamanho dos fragmentos esperados, você sabe quantos pares de bases vão ter no fragmento em teste na reação, quando você seleciona a região de interesse você quantos nucleotídeos ali tem. É preciso você saber isso para a escolha exata dos primeres. Isso é o q se faz em laboratórios para exame do vírus da hepatite C, então a gente espera que a amostra positiva do meu fragmento de PCR (amplicon), tenha 280 pares de bases de acordo com os primeres de bases que eu uso. Na corrida eletroforética, a minha amostra vai ser positiva caso meu fragmento faça banda em 280 pares de bases de acordo com meu padrão de peso molecular, caso não de nada ou de uma banda fora desse lugar meu exame dá negativo. A reação de PCR teoricamente, sabendo que existe muitos processo de contaminação, você só amplifica se seu primer sofrer hibridização, se isso não ocorrer o resultado é negativo. Os métodos de diagnósticos virológicos se dividem em dois tipos diretos, que significa a detecção do vírus, de antígenos, do genoma e indiretos, que significa a pesquisa de anticorpos, ambos são extremamente aplicados. Sem duvida nenhuma grande parte das infecções virais são diagnosticas indiretamente, pela pesquisa de anticorpos. Existem duas formas de pesquisar anticorpos. Você pode pesquisar da classe IgM e classe IgG, e a interpretação desses casos vai ser diferente. Os métodos atualmente se baseam na pesquisa de classe IgM, ou seja, se eu tenho uma mulher grávida com suspeita de rubéola, para você saber se elas esta com rubéola, é pesquisar se ela esta com IgM para o vírus da rubéola, pq se der positivo, com certeza ela esta tendo uma infecção aguda de rubéola naquele momento. Não existe a necessita de pesquisar o vírus. O IgM VC PRECISA DE APENAS UMA AMOSTRA coleta naquela fase aguda que sela o diagnostico. E se você identificar IgG, dando IgG positivo e IgM negativo, ela esta infectada? Não. A não ser que você faça a chamada conversão sorológica, antigamente não existia a técnica para detecção de IgM, o q se fazia era a pesquisa pareada de IgG, como assim, coleta-se uma amostra na fase aguda(1) e outra na fase convalescente(2), e essas amostras era simultaneamente observadas, e ai você poderia afirmar que aquela pessoa estava doente naquele momento, caso a o titulo da amostra 2 fosse pelo menos 4 vezes maior do que o titulo a amostra 1, porque isso significa conversão sorológica, que é o aumento de pelo menos 4 vezes no titulo de anticorpos entre amostras coletados na fase aguda e na fase convalescente, se você identificar esse aumento no titulo você pode afirmar que embora seja da classe IgG aquela pessoa teve a infecção no passado recente. Mas se o titulo for igual entre as amostras, significa que essa pessoa teve uma infecção passada. O que vocês têm que entender é que a pesquisa de anticorpos vai depender da classe, se for IgM, basta a coleta de uma amostra na fase aguda da infecção, se for IgG precisa da coleta de duas amostras uma
  8. 8. na fase aguda e outra na fase convalescente, e você precisa verificar esse aumento no titulo de anticorpos, o problema é que na fase convalescente o individuo está quase curado e por isso que o teste de IgM é mais correto.

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