Aula de Engenharia Genética sobre Reação em Cadeia da Polimerase

1. Profª. Drª. Priscila Mello
Elaborado por: Profa. Dra. Marta Bastos

2. Seqüência alvo
✓ Reação que permite a amplificação
de um fragmento específico de DNA,
aumentando a possibilidade de
visualização.
✓ “XEROX MOLECULAR”

3. ✓ 1952 - Watson & Crick:
 Modelo da molécula de DNA
✓ 1971 - Gobind Khorana:
replicação de um pedaço de
DNA 2 primers.

4. ✓ Maquinaria de
Replicação.

5. ✓ Separação da dupla fita de DNA
- Helicase X Aumento da temperatura

6. ✓ 1985 - Kary B. Mullis- Amplificação
de sequências de DNA.

7. Limitações:
-Síntese de primers
- Purificação de DNA polimerase
✓ Limitações:
- Síntese de primers
- Purificação de DNA polimerase

8. ✓ 1976 - Thomas D. Brock
- DNA polimerase termoestável de
Thermus aquaticus .

9. ✓ Desnaturação
✓ Anelamento
✓ Elongação

10. ✓ Termociclador

11. ✓ amostra de DNA (template- molde)
- DNA genômico
- cDNA

12. ✓ primers (iniciadores)
✓ dNTPs
✓ DNA polimerase
✓ MgCl2
✓ Solução Tampão e água destilada

15. ✓ primers (iniciadores)
✓ dNTPs
✓ DNA polimerase
✓ MgCl2
✓ Solução Tampão e água destilada
DNA

16. Esta reação permite a amplificação de qualquer
sequência de DNA coletada de amostras de materiais
biológicos como sangue, urina, outros fluidos corporais,
cabelo e fragmentos teciduais. Amostras de
microorganismos, células vegetais ou animais mesmo
que com milhares de anos, também podem ser
detectadas pela PCR.

17. * Aplicável em organismos mortos. Uma vez que a amplificação
ocorre in vitro, e depende apenas da amostra genética coletada,
não do complexo enzimático do organismo.
VANTAGENS

18. * Facilidade de contaminação: Devido a sua alta sensibilidade,
os fragmentos de amostras anteriormente trabalhadas
(amplicons na forma de aerossóis) podem vir a serem
amplificados no processo.
Para reduzir o risco de contaminações são fundamentais os
seguintes cuidados:
DESVANTAGENS

19. • A separação física em dois laboratórios “pré-PCR” e “pós-PCR”,
de modo que cada um tenha o máximo de independência
possível
• Descarte de ponteiras e tubos utilizados.
• Controle do fluxo de pessoas, também de visitantes externos,
mas principalmente do pessoal que pode transitar de um
laboratório para o outro. O maior risco de contaminação é
através dos amplicons (fragmentos de DNA) produzidos no
laboratório pós “PCR” e transportados pelos experimentadores
ate o laboratório de “pre-PCR”.
DESVANTAGENS

20. ✓ Composta por ciclos
✓Desnaturação das cadeias
✓Anelamento dos Primers ou iniciadores
✓ Polimerização das novas cadeias complementares pela
ação da enzima Taq DNA polimerase.

22. ✓ Temperatura de 94 a 96ºC (3 a 5 minutos )

23. ✓ Temperatura de 94 a 96ºC (30 segundos)

24. ✓ Temperatura varia de acordo com os primers
✓Tempo

25. ✓ Temperatura de 72ºC, tempo varia de acordo com tamanho
do amplicon

26. Desnaturação
Anelamento
Extensão
Final do ciclo
✓ Nº de ciclos variável: 25 a 30

29. 1 ciclo = 2 Amplicons
2 ciclos = 4 Amplicons
3 ciclos = 8 Amplicons
4 ciclos = 16 Amplicons
5 ciclos = 32 Amplicons
6 ciclos = 64 Amplicons
7 ciclos = 128 Amplicons
No. No. Amplicons
Ciclos Copias do DNA alvo
1 2
2 4
3 8
4 16
5 32
6 64
20 1.048.576
30 1.073.741.824

30. ✓ Eletroforese em gel de agarose

31. ✓ Real time PCR ou PCR em tempo real
ou PCR quantitativo

32. Intensa padronização
Contaminação
Não automatizado
Necessidade de pós-processamento do produto
da PCR
Resultados não são expressos em números

39. ✓ Real time PCR- PCR quantitativo

41.  Diagnósticos de doenças infecciosas:
 O diagnóstico de doenças infecciosas tem
como principio a detecção do patógêno ou de
sua ação..

42. Atualmente, o PCR é utilizado em laboratórios de
investigação médica e biológica objetivando diferentes
tarefas, como a identificação de doenças hereditárias, a
construção de árvores filogenéticas, a clonagem de genes,
teste de paternidade, detecção de organismos causadores
de infecções, concepção de organismos transgênicos, entre
outras.

43. ✓ Diagnósticos moleculares
Identificação de doenças hereditárias
Testes de paternidade

44. ✓ Teste de paternidade

45. ✓ Teste de paternidade
-Baseado em seqüências repetitivas encontradas no DNA
-Microssatélites (SNP- single nucleotide polimorphism): classe
de DNA repetitivo de poucas bases
- STR ou VNTRs : regiões com número variável de repetições

46. ✓ Microsatélites (SNPs)
✓ Marcador molecular de
doença

47. ✓ Teste de paternidade
(STRs ouVNTRs)

48. ✓ Teste de paternidade

49. ✓ Teste de paternidade
PM M F P1 P2

50. ✓ Identificação de indivíduos

51. DNA controle
Acusado Vítima
Amostra
✓ Análise Forense

52. ✓ Análise
Forense

53. ✓ Análise da expressão de genes (RT-PCR)
- Extração de RNAm
- Preparo do cDNA
- gene de referência (gene constitutivo)

54. ✓ RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA – DNA
polimórfico randomicamente amplificado)- DNA
fingerprinting
– PCR utilizando-se iniciadores aleatórios em baixa
estringência (especificidade no produto de DNA a ser
amplificado)
– Não é necessário um conhecimento prévio do genoma
– Uniformidade no padrão de bandas para espécies
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55. 400bp
310bp
260bp
75bp

56. ✓ RAPD