Aula completa.

1. Utilização de
Polimorfismos em
Análises Forenses
Emmanuella Rodrigues

3. Relembrando...
 Polimorfismo Genético  É a coexistência de
alelos múltiplos em um lócus cromossômico;
regiões do genoma nas quais existem variações
entre as pessoas.
 Polimorfismo de sítio de restrição (RFLP)
 Polimorfismo de nucleotídeo único (SNP)
 Polimorfismos de inserção/deleção (indels)
 Polimorfismos de minissatélites (VNTR)
 Polimorfismos de microssatélites (STR)

4. Qual a importância desses
polimorfismos?
 Fonte de variabilidade;
 Permitem construir um perfil genético
indivíduo-específco  “DNA fingerprint”;
importante em Medicina Forense

5. Por que analisar tais
polimorfismos no DNA?
 Determinação de paternidade;
 Resolução de casos criminais envolvendo:
Estupro;
Homicídio;
Rapto;
Troca ou abandono de crianças.

6. De onde pode ser extraído o DNA?
 Sangue  padrão-ouro;
 células epiteliais da mucosa oral: saliva, pontas
de cigarro, selos e envelopes, gomas de
mascar, copos, tampas de caneta mordidas,...;
 Pêlos e fios de cabelo (com ou sem o bulbo
capilar);
 Unhas;
 Esfregaços;

7. De onde pode ser extraído o DNA?
 Manchas de material biológico: líquido seminal,
urina, saliva, sangue;
 Tecidos de biópsias cirúrgicas;
 Ossadas (carbonizadas ou não);
 Tecidos mumificados ou congelados;
 Células deixadas por impressão digital;
 Dentes;
 outras

8. Como extrair o DNA?
 Técnicas específicas para cada tipo de
amostra;
 CUIDADO: O sucesso da tipagem de DNA
depende basicamente da qualidade e
quantidade de DNA extraído

9. Métodos disponíveis para
utilização:
 VNTRs estudados com sondas multilocais;
 STRs estudados com PCR;
 DNA mitocondrial (mtDNA);
 STRs do Cromossomo Y;
 Técnicas mais recentes.

10. VNTRs estudados com sondas
multilocais
 Princípio do método: após clivagem por
endonucleases, cada indivíduo tem um
padrão de bandas específico com tamanhos
determinados pela presença, ou não, do sítio
da enzima e pela quantidade de repetições
em tandem. Para que possa-se visualizar,
esses fragmentos devem ser hibridizados a
sondas radioativas de seqüência invariável.

11. VNTRs estudados com sondas
multilocais

12.  Técnica de custo razoável;
 DNA não degradado;
 Quantidade suficiente de DNA;
 Várias dificuldades inerentes à técnica.
VNTRs estudados com sondas
multilocais

13.  Teste de paternidade:
VNTRs estudados com sondas
multilocais

14.  Identificação de um criminoso:

15. STRs estudados com PCR
 Princípio do método: Reação de PCR
utilizada para copiar extensivamente
várias regiões de STR, fornecendo
fragmentos de tamanhos diferentes
visualizados por eletroforese em gel de
poliacrilamida ou por seqüenciamento

16. STRs estudados com PCR

17. Recuperação de DNA em amostras de tecidos e fluidos
Amostra (tecidos e
fluidos)
Quantidade
recuperada
Análise de RFLP Análise de STR
1mL de sangue 20 a 40mg SIM SIM
Manchas de
sangue seco de
1cm3
200ng NÃO SIM
Sêmen 150 a 300mg por
mL
SIM SIM
Sêmen (esfregaço
vaginal pós-coito)
0 a 3mg (DNA dos
espermatozóides)
SIM SIM
Cabelo com raiz
(contendo bulbo
capilar)
1 a 750ng por fio NÃO SIM
Saliva 1 a 10mgpor mL SIM SIM
Retirado de “Os exames de DNA nos Tribunais”, Revista Ciência Hoje (vol. 29, nº 169 - março/2001)

18.  Vantagem sobre a técnica de VNTR:
como o DNA é “amplificado”, a amostra a
ser analisada pode ter uma quantidade
inicial muito menor.
 Mesmo existindo contaminação por DNA
de outras espécies, a técnica de PCR é
específica o suficiente para amplificar
apenas o DNA humano
STRs estudados com PCR

19.  OBS: Quantas regiões são necessárias?

20. mtDNA
 Características importantes:
 Também contém regiões polimórficas que
permitem a “individualização”;
 Descendentes recebem apenas da mãe  permite
traçar a linhagem materna de uma pessoa;
 É mais resistente à degradação que o DNA
nuclear.
 taxa mutacional do mtDNA é 5-10 vezes maior que
a do DNA nuclear  poucos mecanismos de
reparo permitem que as variações nos
nucleotídeos sejam acumuladas

22.  Princípio do método: Reação de PCR com
o objetivo de copiar extensivamente
regiões polimórficas presentes no DNA
mitocondrial, analisado posteriormente por
sequenciamento
mtDNA

23. mtDNA

24.  Utilizado quando a amostra em questão tem
uma quantidade pequena ou não tem DNA
nuclear;
mtDNA

25.  Utilizado na identificação de corpos em
grandes desastres comparar a seqüência
de interesse com a obtida nos possíveis
irmãos ou ascendentes maternos;
 Identificação de maternidade sem o pai (p/
filhos e filhas)
 Não identifica um indivíduo específico;
 Estudos históricos ou evolutivos.
mtDNA

26. STRs crY
 Características importantes:
Também contém regiões polimórficas
que permitem a “individualização”;
Homens recebem apenas do pai 
permite traçar a linhagem paterna de um
homem;
Crossing-over com o crX em regiões
homólogas entre os 2 cromossomos.

28. STRs crY

29. STRs crY
 Identificação de paternidade sem o pai (p/
filhos);
 Elucidação de estupro (mistura de DNA);
 Não identifica um indivíduo específico;
 Estudos históricos ou evolutivos;

30. Técnicas mais recentes
 SNPs
 Minisseqüenciamento;
 São muito numerosos;
 Baixa taxa de mutação;
 Requer maior nº de marcadores;
 Indels
Estudados em produtos de amplificação muito curtos
(50pb ou menos)  vantagem sobre STRs em estudos
de DNA extremamente degradado (ex: cadáver em
estado avançado de decomposição ou carbonizado)


31. E no futuro...
 Bancos completos de perfil de criminosos
OBS:
 Inglaterra
 CODIS – Combined DNA Index System (1994)
 Amostra de DNA  “retrato falado”