Centro Universitário - UNIBRASIL
PCR
Reação em Cadeia de
Polimerase
Professora: Lyia
Alunas: Aldiny Paula
Kamelyn Casagran...
PCR – consiste em fazer cópias de DNA “in vitro”,
usando os elementos básicos do processo de
replicação natural do DNA.
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1984 - PCR foi apresentada pela primeira em
um encontro científico
Publicação:
Mullis and Faloona, 1987
Saiki at al. 1988
...
PCR requer 7 componentes essenciais:
- DNA polimerase termoestável
- Um par de oligonucleotídeos para iniciar a síntese
de...
Considerações
-Validade dos reagentes
-Número de congelamentos e
descongelamentos
-Contaminação (cabelos, pele...)
-Pureza...
PCR é um processo iterativo, consistindo de
três elementos:
1- Desnaturação da template por aquecimento
2- Pareamento dos ...
Cada uma das novas fitas de DNA estendidas a partir
dos “primers” serve como template para síntese de
uma nova fita. Os “p...
Fases da PCR:
1ª Fase: Aquecimento a mais
de 90ºC para a separação da
dupla fita
Separa tanto a Fita de DNA original quant...
3ª Fase: Extensão dos primers - duplicação do DNA
Temperatura ótima em torno de 72ºC
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1989 - DNA Thermal Cycler, primeiro termociclador
automático
Efeito Plateau: desvio da quantidade teórica
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>>Acúmulo de inibidores
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Tipos de PCR e Variações da técnica
PCR que ocorre dentro de uma célula em lâmina.
Pode ser realizada em células ou tecidos fixados.
Variação da PCR
Convencional, na qual são
utilizados 2 pares de
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PCR com 2 ou mais conjuntos de primers para
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Real Time – PCR
-Detecção, amplificação e quantificação numa única
etapa (agilidade na obtenção de resultados)
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PCR: Aplicabilidade
- diagnóstico médico (Polimorfismos)
- mapeamento genético
- detecção de doenças hereditárias
- clonag...
Real Time – PCR:
-Todas as aplicações da PCR tradicional
-Quantificação de Carga Viral
-Quantificação de Expressão gênica
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Doença de Alzheimer
-Genes da proteína β- amilóide
(PPA,cromossomo 21) e
-Da proteína apolipoproteína E
(APOE, cromossomo ...
Referencias utilizadas:
BOTELHO, Ingrid Thaís Beltrame .Reação em cadeia da Polimerase.
UFSC. Disponível em:<http://proto....
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PCR - fundamentos da técnica, tipos, aplicações e materiais utilizados.

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PCR

  1. 1. Centro Universitário - UNIBRASIL PCR Reação em Cadeia de Polimerase Professora: Lyia Alunas: Aldiny Paula Kamelyn Casagrande 4BMAD
  2. 2. PCR – consiste em fazer cópias de DNA “in vitro”, usando os elementos básicos do processo de replicação natural do DNA. PCR alcançou objetivos bem mais amplos que os propostos inicialmente. PCR é comparada em importância à definição da estrutura do DNA.
  3. 3. 1984 - PCR foi apresentada pela primeira em um encontro científico Publicação: Mullis and Faloona, 1987 Saiki at al. 1988 1976: Thomas D. Brock descobriu a DNA polimerase termoestável de Thermus aquaticus. 1988: Esta DNA polimerase foi usada por Saiki para fazer PCR.
  4. 4. PCR requer 7 componentes essenciais: - DNA polimerase termoestável - Um par de oligonucleotídeos para iniciar a síntese de DNA - Deoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs) - Cátion divalente: toda DNA pol. requer cátion divalente, usualmente Mg2+ - Tampão para manter o pH -Cátions monovalentes, usualmente K+ (KCl) - Template de DNA
  5. 5. Considerações -Validade dos reagentes -Número de congelamentos e descongelamentos -Contaminação (cabelos, pele...) -Pureza (1,8 valor de referência, espectrofotômetro) -Quantidade de material genético –Pouco: pouca amplificação –Muito: pouca amplificação Abs 260 P= ________ Abs 280
  6. 6. PCR é um processo iterativo, consistindo de três elementos: 1- Desnaturação da template por aquecimento 2- Pareamento dos iniciadores à sequência alvo fita única 3- Extensão dos iniciadores pela DNA polimerase termoestável
  7. 7. Cada uma das novas fitas de DNA estendidas a partir dos “primers” serve como template para síntese de uma nova fita. Os “primers” presentes na reação fazem o pareamento com as novas fitas, na região de complementariedade antiparalela entre “primer”- “template”. Isso garante a aumento exponencial do número de novas fitas. Todas as fitas de DNA sintetizadas durante a PCR têm a sequência de um dos primers na extremidade 5’ e a sequência complementar ao outro primer na extremidade 3’
  8. 8. Fases da PCR: 1ª Fase: Aquecimento a mais de 90ºC para a separação da dupla fita Separa tanto a Fita de DNA original quanto os produtos de amplificação 2ª Fase: Anelamento dos primers Hibridização Temperatura varia entre 40 a 70ºC conforme o par de primers Determina a especificidade da ligação
  9. 9. 3ª Fase: Extensão dos primers - duplicação do DNA Temperatura ótima em torno de 72ºC Ao final da reação, a quantidade de DNA amplificado em relação ao DNA inicial é igual a 2n, sendo que n= número de ciclos da PCR Exemplo: PCR de 29 ciclos: 229= 536.870.912 cópias para cada fita original
  10. 10. 1989 - DNA Thermal Cycler, primeiro termociclador automático
  11. 11. Efeito Plateau: desvio da quantidade teórica >>Perda da atividade da Polimerase >>Acúmulo de inibidores >>Limitação dos componentes >>Competição entre produtos >>Pareamento Produto x Molde >>Competição com anelamento do primer
  12. 12. Tipos de PCR e Variações da técnica
  13. 13. PCR que ocorre dentro de uma célula em lâmina. Pode ser realizada em células ou tecidos fixados.
  14. 14. Variação da PCR Convencional, na qual são utilizados 2 pares de primers (ao invés de um par), para amplificar um mesmo fragmento. 2 Pares para amplificar um mesmo fragmento
  15. 15. PCR com 2 ou mais conjuntos de primers para amplificar diferentes fragmentos de uma mesma amostra. Amplificar diferentes fragmentos de uma mesma amostra
  16. 16. Real Time – PCR -Detecção, amplificação e quantificação numa única etapa (agilidade na obtenção de resultados) -É uma ótima técnica quantitativa e muito utilizada atualmente -Utiliza Mix comerciais como reagente Metodologia da PCR + Detecção de sinais fluorescentes
  17. 17. PCR: Aplicabilidade - diagnóstico médico (Polimorfismos) - mapeamento genético - detecção de doenças hereditárias - clonagem de genes - testes de paternidade -criação de organismos transgênicos -Genética forense
  18. 18. Real Time – PCR: -Todas as aplicações da PCR tradicional -Quantificação de Carga Viral -Quantificação de Expressão gênica -Testes de Eficiência terapêutica -Detecção de Agentes Infecciosos -Caracterização de Agentes (Genotipagem)
  19. 19. Doença de Alzheimer -Genes da proteína β- amilóide (PPA,cromossomo 21) e -Da proteína apolipoproteína E (APOE, cromossomo 19) >> PSEN1, PSEN2, TNF-a, o PSEN1 e o CYP46
  20. 20. Referencias utilizadas: BOTELHO, Ingrid Thaís Beltrame .Reação em cadeia da Polimerase. UFSC. Disponível em:<http://proto.ufsc.br/files/2012/03/PCR.pdf> .Acesso em:26/10/2015 VIEIRA, Daniel Perez. Técnicas de PCR: Aplicações e Padronização de Reações. Disponível em:< http://etallcorp.xpg.uol.com.br/aula3.pdf>. Acesso em:27/10/2015
  21. 21. Obrigada!!

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