Este documento discute estratégias de sequenciamento, análise de sequências e aplicações de genômica, transcritômica e metagenômica. Aborda tópicos como sequenciadores, formatos de arquivos, montagem, predição de genes, RNA-seq, análise diferencial de expressão genética e estudos funcionais e filogenéticos em metagenômica.

1. +
Bioinformática
Genômica,Transcritômica e Metagenômica
Gabriel da Rocha Fernandes
Universidade Católica de Brasília
gabrielf@ucb.br - fernandes.gabriel@gmail.com

2. +
Estratégia de sequenciamento
2

3. +
Estratégia de sequenciamento
3

4. +
Sequenciadores
4

5. +
Arquivos de sequências
nAB1 e ESD - Sanger
nFastq - Illumina
nSFF - 454
nEsses arquivos tem que ser processados e a sequencia FASTA
gerada.
nAlguns programas disponibilizam também o arquivo de
qualidade das sequencias.
nPossível montagem sem a conversão em FASTA.
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6. +
FastQ
6

7. +
Qualidade
7

8. +
Montagem
8

9. +
Análise de sequências?
nTransformar os dados do sequenciador em conhecimento
biológico.
nBase calling.
nMontagem.
nPredição de genes.
nIdentificação de promotores e marcadores.
nGenômica comparativa.
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10. +
Montagem do genoma
nAlinhamento das sequencias para geração de um consenso.
nIdentificação e eliminação dos gaps.
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11. +
Predição de genes
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12. +
Análise Funcional
nAssocia uma função aos genes preditos.
nBaseada na homologia entre sequências.
nUtiliza bases de dados de sequências conhecidas e programas
de alinhamento.
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13. +
Transcritoma
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nConjunto de todas as moléculas de RNA encontradas em uma
população celular:
n mRNA
n tRNA
n rRNA
n miRNA
nTotal de transcritos encontrados em um organismo, tipo
celular, condição...
nReflete os genes que estão sendo expressos em um
determinado momento.
nSnapshot da função celular.

14. +
Métodos de estudo
nExpressed Sequence Tags.
nSequenciado por método de Sanger.
nClonagem dos fragmentos usando
vetores.
nNão funciona em procariotos.
nLow throughput.
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15. +
Métodos de estudo
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nMicroarray.
nArranjos com os genes em locais
determinados.
nComparação de amostras par a par.
nHibridização.

16. +
Next Generation Sequencing
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17. +
Custo do sequenciamento
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18. +
RNA-seq
nUltra larga escala.
nNão necessita de clonagem.
nBaixo custo.
nValores absolutos.
nAnálise multi amostras.
nGrande cobertura.
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19. +
Protocolo
nProtocolo para montagem da biblioteca pode variar de acordo
com a tecnologia e com o objetivo:
nRemoção de rRNA.
nAmplificação por PCR.
nConversão a cDNA.
nSingle read ou pair end.
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20. +
Genoma referência vs. Montagem
de novo
nMapeamento dos reads a um genoma referência.
n Quantificação da expressão.
n Identificação de variantes de splicing.
nMontagem de novo do transcritoma.
n Caracterização dos genes expressos.
n Identificação de isoformas.
n Ausência de genoma referência.
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21. +
O que sai do sequenciador?
nFormato padrão para análises é o FastQ.
n @SEQ_ID
GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTCAACTCAC
+
!”*((((***+))%%%++)(%%%%).1***-+*”))**55CCF»»»CCCCCCC65
nPrimeira linha: identificador da sequência.
n Nome da sequência.
n Informação sobre filtros.
nTerceira linha: qualidade da chamada da base (em código).
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22. +
Montagem
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23. +
Mapeamento e quantificação
nAs sequências produzidas são mapeadas a um genôma
referência.
nAlinhou em apenas uma região = ótimo.
nAlinhou em mais que uma região = dilema.
nO uso de replicatas é FUNDAMENTAL!
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Repl. 1 Repl. 2 Repl. 3
Gene A 5 3 12
Gene B 16 25 35
Gene C 10 15 3
Gene D 750 500 500
Gene E 1504 1005 1030

24. +
Interpretando a contagem dos
genes
nNo exemplo da tabela, o Gene E tem duas vezes mais reads
que o Gene D:
n Gene E é expresso duas vezes mais que o Gene D.
n Ambos os genes se expressam na mesma intensidade, mas o Gene E é
duas vezes maior que o Gene D.
n Ambos os genes tem o mesmo tamanho e se expressam na mesma
intensidade, mas o Gene D tem um parálogo no genoma ao qual metade
dos seus reads foram mapeados.
nA causa é os três ao mesmo tempo.
nMas quando analisamos o mesmo gene em 2 condições
diferentes, os efeitos 2 e 3 são desconsiderados.
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25. +
Identificando genes
diferencialmente expressos.
nComparar diferentes condições: controle com testes.
n Célula normal com célula tumoral.
n Planta sem e com estresse hídrico.
n Animal sem e com parasita...
nGenes em duas condições diferentes VÃO apresentar
quantidades de reads diferentes.
nEssa variação pode ser diferença biológica entre as duas
condições, ou ruído experimental.
nAplicação de testes estatísticos.
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26. +
Identificando genes
diferencialmente expressos.
nPara identificar uma diferença estatisticamente significantes, é
necessário que a diferença de expressão entre as duas
condições seja maior que a imprecisão do nível de expressão
sob uma determinada condição.
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27. +
Sou pobre, não vou usar replicata.
nLição de vida:
n Um Gene H, em uma célula normal extraída do Zé Moreno, tem 5 reads.
n O mesmo Gene H, em célula tumoral extraída do mesmo Zé Moreno,
tem 10 reads.
n Uoua! O Gene H é duas vezes mais expresso na célula tumoral!
n Ganhei uns trocados e fiz transcritoma da célula normal de mais 2
pacientes. De brinde, ganhei o sequenciamento do Zé moreno de novo.
n O Gene H teve 12 reads na célula do Zé Moreno, 17 reads na Maria Tolé,
e 22 reads na célula do Tião Torresmo.
nMoral da história: quanto mais medições fizer, mais vai ter
certeza dos níveis de expressão dos genes.
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28. +
Replicata técnica vs. Replicata
biológica
nTécnica: explica a variação
encontrada que pode ter
sido causada por critérios
técnicos: preparação da
biblioteca, qualidade do
sequênciamento, cobertura
do gene...
nBiológica: explica a
variação encontrada que
pode ter sido causada pela
variabilidade de expressão
que não está associada à
mudança nas condições do
experimento.
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29. +
Fontes de variação
Variância de Poisson
nÉ a incerteza existente em qualquer medição em que algo é
amostrado e contado.
nComo é baseado no valor da contagem em si, não é específico
do experimento.
nEssa variância está relacionada a quantidade total de reads.
nPor exemplo, a diferença na expressão de um gene medido
com 1 read versus 2 reads é inerentemente menos seguro do
que as diferenças na expressão de um gene medido com 100
reads versus 200 reads, apesar de ambas as diferenças serem,
nominalmente, uma mudança 2X.
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30. +
Fontes de variação
Variância de Poisson
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31. +
Fontes de variação
Variação Técnica Não-Poisson
nAssociado à incapacidade da
técnica não conseguir medir
a expressão perfeitamente.
nVisto em replicatas técnicas.
nCausas:
n Seleção de miRNA.
n Depleção de rRNA.
n Amplificação por PCR.
n Armazenamento.
n RNA-later.
nMoral da história: Manipule
sua amostra o mínimo
possível.
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32. +
Fontes de variação
Variação Biológica
nOcorre naturalmente nas amostras.
nA expressão naturalmente flutua
em células sob a mesma condição.
nCausas da variações biológicas
podem ser diferenças genéticas,
de maquinaria celular, ou de
resposta a variação do ambiente.
nVariação biológica também sofre a
influência das outras duas
variações vistas.
32

33. +
Filosofando...
nMais replicatas vs. Mais reads.
nComo lidar com batch-effects?
nPreciso validar com RT-PCR?
nEu considero como diferencialmente expresso genes com p-
value < 0.01.
nCalcular FDR (False discovery rate)
nLeia artigos que tenham usado benchmarks.
nConverse com o bioinformata que vai fazer as análises.
33

34. +
Metagenômica
nMetagenoma: material genético recuperado diretamente de
amostras ambientais.
nFornece informações sobre os organismos em seu habitat
natural.

35. +
Metagenômica
nCerca de 99% das bactérias não são cultiváveis.
nPermite o estudo de organismos que não são facilmente
cultivados em laboratório.
nIdentificação de funções em espécies ainda não identificadas.

36. +
Análise do gene do rRNA 16s
nGene altamente conservado em bactérias e archaea.
nRegião hiper variável confere sequências com assinatura
específica.
nFornece um perfil da diversidade na amostra.

37. +
Whole Genome Shotgun e nova
geração de sequenciadores
nPermite uma visão mais global da comunidade.
nAnálise dos níveis da diversidade filogenética e
polimorfismos intraespecíficos.
nEstudo de genes completos e de vias metabólicas da
comunidade.
nReconstrução dos genomas.
nDemanda intensa análise bioinformática.

38. +
Etapas da análise metagenômica
nFatores influentes.
nInterdependências ocultas.

39. +
Métodos de estudo - Funcional
nIsolamento do DNA da amostra.
nClonagem do DNA em um
hospedeiro.
nExpressão do gene e análise
funcional.
nAnálise das sequências.

40. +
Métodos de estudo - Genômico
nDNA isolado pode ser submetido a
um sequenciamento aleatório ou
direcionado.
nPermite montagem de todo
metaboloma.
nAnálise filogenética.
nMetagenômica comparativa.

41. +
Análise filogenética e funcional

42. +
Pipeline de análise

43. +
Assinatura filogenética
nCada read é associado a um organismo (espécie, gênero,
família…)
nUtiliza bases de dados de genômas referência ou base de dados
NT do NCBI.
nFerramenta de alinhamento.
nValores de identidade para definir o nível cladístico assinado.
88% 98% 99%
Bacteroides fragilis
Escherichia coli
70%

44. +
Assinatura filogenética
nComposição geral da amostra
nPrograma: MEGAN
nAgrupa multiplos alinhamentos
em um nível cladístico.

45. +
Análise filogenética
nQual clado prevalece na amostra?
nExiste um perfil filogenético?
nIdentificação de marcadores filogenéticos.
nAssociação da presença de um clado a uma determinada
característica.

46. +
Anotação funcional
nAvaliar o potencial genético da amostra.
nMontagem dos contigs.
nPredição dos genes.
nAlinhamento dos genes preditos a uma base de dados.

47. +
Análise funcional
nQual função está mais presente?
nExiste alguma função do seu interesse?
nMontagem do mapa metabólico do ambiente.
nRastrear a função e identificar o organismo que executa.

48. +

49. +

50. +

51. +

52. +

53. +
Visualização