técnicas moleculares no tratamento do câncer

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técnicas moleculares no tratamento do câncer

  1. 1. REAÇÃO DA POLIMERASE EM CADEIA - PCR Polymerase Chain Reaction
  2. 2. O QUE É PCR?  É uma metodologia que se baseia na amplificação exponencial seletiva de uma quantidade reduzida de DNA de uma única célula, sem o uso de um organismo vivo.
  3. 3. HISTÓRICO  Karys Mullis descreveu a PCR no final da década de 1980.  Em 1989, a Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation patenteou este processo .  O Prêmio Nobel da Química foi atribuído à Karys Mullis pelo seu trabalho em 1993.  Atualmente, método PCR é usado habitualmente nos laboratórios de investigação médica e biológica para uma variedade de tarefas.
  4. 4. PARA QUE SERVE A PCR?  Diagnóstico médico;  Mapeamento genético;  Detecção de doenças hereditárias;  Clonagem de genes;  Testes de paternidade;  Criação de organismos transgênicos;
  5. 5. PARA QUE SERVE A PCR?  Medicina Forense:  pequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime (pedaços de cabelo, gotas de sangue ou saliva, pedaços de pêlo ou até mesmo a minúscula quantidade de DNA deixada em uma impressão digital) são amplificadas para serem analisadas pelo método de fingerprinting.
  6. 6. PROCEDIMENTOS  Devem ser realizados com o maior cuidado para evitar contaminações que possam alterar o resultado.  Em primeiro lugar, deve-se extrair o material genético da célula ou outro material a ser estudado (exemplo: vestígios de crimes) sem danificá-lo.(Normalmente o material extraído é o DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNA (ARN) em uma RT-PCR que é um desdobramento da PCR e possui outras aplicações).
  7. 7. PROCEDIMENTOS:  Após a extração do DNA, adiciona-se uma mistura (conhecida como pré-mix) que contém:  dNTPs  Primers (ou iniciadores)  Solução Tampão.  Enzima Taq DNA polimerase
  8. 8. Taq DNA polimerase  A Taq DNA polimerase, também denominada Taq polimerase ou apenas Taq, é uma DNA polimerase termoestável, utilizada na amplificação de fragmentos de DNA através da técnica de PCR. O seu nome é devido a ter sido identificada pela primeira vez na bactéria Thermus aquaticus, encontrada em fontes hidrotermais. A Taq polimerase suporta as elevadas temperaturas usadas em PCR, tendo uma semi-vida enzimática de 40 minutos (a 94ºC).
  9. 9. PROCEDIMENTOS  Toda esta mistura é colocada no termociclador, o qual faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para cada reação (fragmento a ser amplificado).
  10. 10. TERMOCICLADOR
  11. 11. PROCEDIMENTOS  O Ciclo da PCR, no termociclador, ocorre em três fases:  Fase de Desnaturação (94-96ºC)  Fase de Hibridização ou Anelamento (50-54ºC)  Fase de Extensão do DNA (72-76ºC)
  12. 12. Fase de Desnaturação  a temperatura é elevada de 94 a 96ºC por pouco tempo para que haja a separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação) através da quebra das pontes de hidrogênio, dando origem a duas fitas simples de DNA sobre as quais a síntese posteriormente vai ocorrer
  13. 13. Fase de hibridização ou anelamento  a temperatura é reduzida entre 50 a 60ºC dependendo da quantidade de C e G encontrada no primer, para que os primers se anelem (pareiem) com a fita molde de DNA (anelamento).
  14. 14. Fase de Extensão do DNA  a temperatura é elevada a 72ºC para que a enzima taq-polimerase possa funcionar sintetizando a nova molécula (extensão), em seguida um novo ciclo é iniciado.
  15. 15. PROCEDIMENTOS  O ciclo é repetido,em torno de 30 vezes.  Duas cadeias são sintetizadas a partir de cada cadeia molde em cada ciclo completo de PCR, o que dá um crescimento EXPONENCIAL, havendo ao fim de n ciclos 2n vezes mais cópias do que no início.
  16. 16. RESULTADOS Nº de Ciclos Nº de Cópias 1 2 2 4 3 8 6 64 20 1.048.576 30 1.073.741.824
  17. 17. RESULTADOS  O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida e depois é interpretado com a ajuda de um profissional competente.
  18. 18. VANTAGENS  Capacidade de amplificar uma sequência precisa de DNA.  Simplicidade, rigor, elevada sensibilidade e especificidade.  Não é necessário isolar o DNA que se pretende amplificar, mesmo que se encontre misturado com o DNA de outras espécies, uma vez que os primers definirão a especificidade.  Técnica rápida, barata e segura.
  19. 19. LIMITAÇÕES  Necessidade de conhecer a sequência de DNA a amplificar para sintetizar primers específicos.  Relativa facilidade com que ocorre a contaminação por DNA estranho.  Limitada extensão da sequência.  Incorporação errônea de bases durante a replicação.
  20. 20. VARIAÇÕES DA TÉCNICA BÁSICA DE PCR  Nested PCR  Hot Start  Real time PCR  RAPD-PCR  Entre outras...
  21. 21. Nested PCR  Para melhorar a especificidade e a eficiência da reação, o segmento genômico é amplificado primeiro de forma abrangente, copiando até mesmo seqüências localizadas fora dela, e utilizando-se este primeiro produto, segue- se à amplificação da real sequência-alvo.
  22. 22. Hot Start  Variação da PCR onde a reação de amplificação é iniciada a temperaturas elevadas.  Atividade da Taq DNA polimerase é inibida durante a preparação da reação  evitando a amplificação de produtos inespecíficos,aumentando a especificidade e melhorando o rendimento da reação.
  23. 23. Real time PCR  PCR em tempo real compreende uma amplificação convencional de DNA, porém a detecção do resultado é feita a longo dos ciclos através de marcadores.  O risco de contaminação se torna menor.
  24. 24. RAPD-PCR  Consiste na amplificação randômica do DNA, por um par de iniciadores de baixa especificidade para com o DNA molde, gerando assim anelamentos inespecíficos.  Essa técnica permite a tipagem do genoma de microorganismos, possibilitando sua comparação entre isolados de amostras clínicas.
  25. 25. BIBLIOGRAFIA  http://virtual.unipar.br/courses/GMBM/doc ument/aula-PCR- MESTRADO.pdf?cidReq=GMBM  http://www.fisiologia.kit.net/biomol/4.htm  http://pt.wikipedia.org/wiki/PCR
  26. 26. OBRIGADO!!!

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