REAÇÃO DA POLIMERASEREAÇÃO DA POLIMERASE
EM CADEIA - PCREM CADEIA - PCR
Polymerase Chain Reaction
O QUE É PCR?O QUE É PCR?
 É uma metodologia que se baseia naÉ uma metodologia que se baseia na
amplificação exponencial s...
HISTÓRICOHISTÓRICO
 Karys Mullis descreveu a PCR no final daKarys Mullis descreveu a PCR no final da
década de 1980.décad...
PARA QUE SERVE A PCR?PARA QUE SERVE A PCR?
 Diagnóstico médico;Diagnóstico médico;
 Mapeamento genético;Mapeamento genét...
PARA QUE SERVE A PCR?PARA QUE SERVE A PCR?
 Medicina Forense:Medicina Forense:
pequenas amostras de DNA retiradas dapequ...
PROCEDIMENTOSPROCEDIMENTOS
 Devem ser realizados com o maior cuidado paraDevem ser realizados com o maior cuidado para
ev...
PROCEDIMENTOS:PROCEDIMENTOS:
 Após a extração do DNA, adiciona-se umaApós a extração do DNA, adiciona-se uma
mistura (con...
Taq DNA polimeraseTaq DNA polimerase
 AA Taq DNA polimeraseTaq DNA polimerase, também denominada, também denominada
Taq p...
PROCEDIMENTOSPROCEDIMENTOS
 Toda esta mistura é colocada noToda esta mistura é colocada no
termociclador, o qual faz cicl...
TERMOCICLADORTERMOCICLADOR
PROCEDIMENTOSPROCEDIMENTOS
 O Ciclo da PCR, no termociclador, ocorreO Ciclo da PCR, no termociclador, ocorre
em três fase...
Fase de DesnaturaçãoFase de Desnaturação
 a temperatura é elevada de 94 a 96ºC pora temperatura é elevada de 94 a 96ºC po...
Fase de hibridização ouFase de hibridização ou
anelamentoanelamento
 a temperatura é reduzida entre 50 a 60ºCa temperatur...
Fase de Extensão do DNAFase de Extensão do DNA
 a temperatura é elevada a 72ºC para quea temperatura é elevada a 72ºC par...
PROCEDIMENTOSPROCEDIMENTOS
 O ciclo é repetido,em torno de 30 vezes.O ciclo é repetido,em torno de 30 vezes.
 Duas cadei...
RESULTADOSRESULTADOS
Nº de CiclosNº de Ciclos Nº de CópiasNº de Cópias
11 22
22 44
33 88
66 6464
2020 1.048.5761.048.576
3...
RESULTADOSRESULTADOS
 O resultado é analisado através de umaO resultado é analisado através de uma
eletroforese em gel de...
VANTAGENSVANTAGENS
 Capacidade de amplificar uma sequênciaCapacidade de amplificar uma sequência
precisa de DNA.precisa d...
LIMITAÇÕESLIMITAÇÕES
 Necessidade de conhecer a sequência deNecessidade de conhecer a sequência de
DNA a amplificar para ...
VARIAÇÕES DA TÉCNICAVARIAÇÕES DA TÉCNICA
BÁSICA DE PCRBÁSICA DE PCR
 Nested PCRNested PCR
 Hot StartHot Start
 Real tim...
Nested PCRNested PCR
 Para melhorar a especificidade e aPara melhorar a especificidade e a
eficiência da reação, o segmen...
Hot StartHot Start
 Variação da PCR onde a reação deVariação da PCR onde a reação de
amplificação é iniciada a temperatur...
Real time PCRReal time PCR
 PCR em tempo real compreende umaPCR em tempo real compreende uma
amplificação convencional de...
RAPD-PCRRAPD-PCR
 Consiste na amplificação randômica doConsiste na amplificação randômica do
DNA, por um par de iniciador...
BIBLIOGRAFIABIBLIOGRAFIA
 http://virtual.unipar.br/courses/GMBM/dochttp://virtual.unipar.br/courses/GMBM/doc
ument/aula-P...
OBRIGADO!!!
Próximos SlideShares
Carregando em…5
×

PCR 1

746 visualizações

Publicada em

PCR primeiro

Publicada em: Educação
0 comentários
0 gostaram
Estatísticas
Notas
  • Seja o primeiro a comentar

  • Seja a primeira pessoa a gostar disto

Sem downloads
Visualizações
Visualizações totais
746
No SlideShare
0
A partir de incorporações
0
Número de incorporações
3
Ações
Compartilhamentos
0
Downloads
20
Comentários
0
Gostaram
0
Incorporações 0
Nenhuma incorporação

Nenhuma nota no slide

PCR 1

  1. 1. REAÇÃO DA POLIMERASEREAÇÃO DA POLIMERASE EM CADEIA - PCREM CADEIA - PCR Polymerase Chain Reaction
  2. 2. O QUE É PCR?O QUE É PCR?  É uma metodologia que se baseia naÉ uma metodologia que se baseia na amplificação exponencial seletiva de umaamplificação exponencial seletiva de uma quantidade reduzida de DNA de umaquantidade reduzida de DNA de uma única célula, sem o uso de um organismoúnica célula, sem o uso de um organismo vivo.vivo.
  3. 3. HISTÓRICOHISTÓRICO  Karys Mullis descreveu a PCR no final daKarys Mullis descreveu a PCR no final da década de 1980.década de 1980.  Em 1989, a Hoffman La Roche & Perkin-ElmerEm 1989, a Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation patenteou este processo .Corporation patenteou este processo .  O Prêmio Nobel da Química foi atribuído àO Prêmio Nobel da Química foi atribuído à Karys Mullis pelo seu trabalho em 1993.Karys Mullis pelo seu trabalho em 1993.  Atualmente, método PCR é usadoAtualmente, método PCR é usado habitualmente nos laboratórios de investigaçãohabitualmente nos laboratórios de investigação médica e biológica para uma variedade demédica e biológica para uma variedade de tarefas.tarefas.
  4. 4. PARA QUE SERVE A PCR?PARA QUE SERVE A PCR?  Diagnóstico médico;Diagnóstico médico;  Mapeamento genético;Mapeamento genético;  Detecção de doenças hereditárias;Detecção de doenças hereditárias;  Clonagem de genes;Clonagem de genes;  Testes de paternidade;Testes de paternidade;  Criação de organismos transgênicos;Criação de organismos transgênicos;
  5. 5. PARA QUE SERVE A PCR?PARA QUE SERVE A PCR?  Medicina Forense:Medicina Forense: pequenas amostras de DNA retiradas dapequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime (pedaços de cabelo, gotascena de um crime (pedaços de cabelo, gotas de sangue ou saliva, pedaços de pêlo ou atéde sangue ou saliva, pedaços de pêlo ou até mesmo a minúscula quantidade de DNAmesmo a minúscula quantidade de DNA deixada em uma impressão digital) sãodeixada em uma impressão digital) são amplificadas para serem analisadas peloamplificadas para serem analisadas pelo método demétodo de fingerprintingfingerprinting..
  6. 6. PROCEDIMENTOSPROCEDIMENTOS  Devem ser realizados com o maior cuidado paraDevem ser realizados com o maior cuidado para evitar contaminações que possam alterar oevitar contaminações que possam alterar o resultado.resultado.  Em primeiro lugar, deve-se extrair o materialEm primeiro lugar, deve-se extrair o material genético da célula ou outro material a sergenético da célula ou outro material a ser estudado (exemplo: vestígios de crimes) semestudado (exemplo: vestígios de crimes) sem danificá-lo.(Normalmente o material extraído é odanificá-lo.(Normalmente o material extraído é o DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNADNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNA (ARN) em uma RT-PCR que é um(ARN) em uma RT-PCR que é um desdobramento da PCR e possui outrasdesdobramento da PCR e possui outras aplicações).aplicações).
  7. 7. PROCEDIMENTOS:PROCEDIMENTOS:  Após a extração do DNA, adiciona-se umaApós a extração do DNA, adiciona-se uma mistura (conhecida como pré-mix) quemistura (conhecida como pré-mix) que contém:contém: dNTPsdNTPs PrimersPrimers (ou iniciadores)(ou iniciadores) Solução Tampão.Solução Tampão. Enzima Taq DNA polimeraseEnzima Taq DNA polimerase
  8. 8. Taq DNA polimeraseTaq DNA polimerase  AA Taq DNA polimeraseTaq DNA polimerase, também denominada, também denominada Taq polimeraseTaq polimerase ou apenasou apenas TaqTaq, é uma DNA, é uma DNA polimerase termoestável, utilizada napolimerase termoestável, utilizada na amplificação de fragmentos de DNA através daamplificação de fragmentos de DNA através da técnica de PCR. O seu nome é devido a ter sidotécnica de PCR. O seu nome é devido a ter sido identificada pela primeira vez na bactériaidentificada pela primeira vez na bactéria Thermus aquaticusThermus aquaticus, encontrada em fontes, encontrada em fontes hidrotermais. A Taq polimerase suporta ashidrotermais. A Taq polimerase suporta as elevadas temperaturas usadas em PCR, tendoelevadas temperaturas usadas em PCR, tendo uma semi-vida enzimática de 40 minutos (auma semi-vida enzimática de 40 minutos (a 94ºC).94ºC).
  9. 9. PROCEDIMENTOSPROCEDIMENTOS  Toda esta mistura é colocada noToda esta mistura é colocada no termociclador, o qual faz ciclos determociclador, o qual faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos comtemperatura pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para cadatempos exatos específicos para cada reação (fragmento a ser amplificado).reação (fragmento a ser amplificado).
  10. 10. TERMOCICLADORTERMOCICLADOR
  11. 11. PROCEDIMENTOSPROCEDIMENTOS  O Ciclo da PCR, no termociclador, ocorreO Ciclo da PCR, no termociclador, ocorre em três fases:em três fases: Fase de Desnaturação (94-96ºC)Fase de Desnaturação (94-96ºC) Fase de Hibridização ou Anelamento (50-54ºC)Fase de Hibridização ou Anelamento (50-54ºC) Fase de Extensão do DNA (72-76ºC)Fase de Extensão do DNA (72-76ºC)
  12. 12. Fase de DesnaturaçãoFase de Desnaturação  a temperatura é elevada de 94 a 96ºC pora temperatura é elevada de 94 a 96ºC por pouco tempo para que haja a separaçãopouco tempo para que haja a separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação)da dupla cadeia de DNA (Desnaturação) através da quebra das pontes deatravés da quebra das pontes de hidrogênio, dando origem a duas fitashidrogênio, dando origem a duas fitas simples de DNA sobre as quais a síntesesimples de DNA sobre as quais a síntese posteriormente vai ocorrerposteriormente vai ocorrer
  13. 13. Fase de hibridização ouFase de hibridização ou anelamentoanelamento  a temperatura é reduzida entre 50 a 60ºCa temperatura é reduzida entre 50 a 60ºC dependendo da quantidade de C e Gdependendo da quantidade de C e G encontrada no primer, para que osencontrada no primer, para que os primers se anelem (pareiem) com a fitaprimers se anelem (pareiem) com a fita molde de DNA (anelamento).molde de DNA (anelamento).
  14. 14. Fase de Extensão do DNAFase de Extensão do DNA  a temperatura é elevada a 72ºC para quea temperatura é elevada a 72ºC para que a enzima taq-polimerase possa funcionara enzima taq-polimerase possa funcionar sintetizando a nova molécula (extensão),sintetizando a nova molécula (extensão), em seguida um novo ciclo é iniciado.em seguida um novo ciclo é iniciado.
  15. 15. PROCEDIMENTOSPROCEDIMENTOS  O ciclo é repetido,em torno de 30 vezes.O ciclo é repetido,em torno de 30 vezes.  Duas cadeias são sintetizadas a partir deDuas cadeias são sintetizadas a partir de cada cadeia molde em cada ciclocada cadeia molde em cada ciclo completo de PCR, o que dá umcompleto de PCR, o que dá um crescimento EXPONENCIAL, havendo aocrescimento EXPONENCIAL, havendo ao fim defim de nn ciclos 2ciclos 2nn vezes mais cópias dovezes mais cópias do que no início.que no início.
  16. 16. RESULTADOSRESULTADOS Nº de CiclosNº de Ciclos Nº de CópiasNº de Cópias 11 22 22 44 33 88 66 6464 2020 1.048.5761.048.576 3030 1.073.741.8241.073.741.824
  17. 17. RESULTADOSRESULTADOS  O resultado é analisado através de umaO resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou deeletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida e depois é interpretado compoliacrilamida e depois é interpretado com a ajuda de um profissional competente.a ajuda de um profissional competente.
  18. 18. VANTAGENSVANTAGENS  Capacidade de amplificar uma sequênciaCapacidade de amplificar uma sequência precisa de DNA.precisa de DNA.  Simplicidade, rigor, elevada sensibilidade eSimplicidade, rigor, elevada sensibilidade e especificidade.especificidade.  Não é necessário isolar o DNA que se pretendeNão é necessário isolar o DNA que se pretende amplificar, mesmo que se encontre misturadoamplificar, mesmo que se encontre misturado com o DNA de outras espécies, uma vez que oscom o DNA de outras espécies, uma vez que os primersprimers definirão a especificidade.definirão a especificidade.  Técnica rápida, barata e segura.Técnica rápida, barata e segura.
  19. 19. LIMITAÇÕESLIMITAÇÕES  Necessidade de conhecer a sequência deNecessidade de conhecer a sequência de DNA a amplificar para sintetizarDNA a amplificar para sintetizar primersprimers específicos.específicos.  Relativa facilidade com que ocorre aRelativa facilidade com que ocorre a contaminação por DNA estranho.contaminação por DNA estranho.  Limitada extensão da sequência.Limitada extensão da sequência.  Incorporação errônea de bases durante aIncorporação errônea de bases durante a replicação.replicação.
  20. 20. VARIAÇÕES DA TÉCNICAVARIAÇÕES DA TÉCNICA BÁSICA DE PCRBÁSICA DE PCR  Nested PCRNested PCR  Hot StartHot Start  Real time PCRReal time PCR  RAPD-PCRRAPD-PCR  Entre outras...Entre outras...
  21. 21. Nested PCRNested PCR  Para melhorar a especificidade e aPara melhorar a especificidade e a eficiência da reação, o segmentoeficiência da reação, o segmento genômico é amplificado primeiro de formagenômico é amplificado primeiro de forma abrangente, copiando até mesmoabrangente, copiando até mesmo seqüências localizadas fora dela, eseqüências localizadas fora dela, e utilizando-se este primeiro produto,utilizando-se este primeiro produto, segue-se à amplificação da realsegue-se à amplificação da real sequência-alvo.sequência-alvo.
  22. 22. Hot StartHot Start  Variação da PCR onde a reação deVariação da PCR onde a reação de amplificação é iniciada a temperaturasamplificação é iniciada a temperaturas elevadas.elevadas.  Atividade daAtividade da TaqTaq DNA polimerase éDNA polimerase é inibida durante a preparação da reaçãoinibida durante a preparação da reação  evitando a amplificação de produtosevitando a amplificação de produtos inespecíficos,aumentando ainespecíficos,aumentando a especificidade e melhorando o rendimentoespecificidade e melhorando o rendimento da reação.da reação.
  23. 23. Real time PCRReal time PCR  PCR em tempo real compreende umaPCR em tempo real compreende uma amplificação convencional de DNA, porémamplificação convencional de DNA, porém a detecção do resultado é feita a longoa detecção do resultado é feita a longo dos ciclos através de marcadores.dos ciclos através de marcadores.  O risco de contaminação se torna menor.O risco de contaminação se torna menor.
  24. 24. RAPD-PCRRAPD-PCR  Consiste na amplificação randômica doConsiste na amplificação randômica do DNA, por um par de iniciadores de baixaDNA, por um par de iniciadores de baixa especificidade para com o DNA molde,especificidade para com o DNA molde, gerando assim anelamentosgerando assim anelamentos inespecíficos.inespecíficos.  Essa técnica permite a tipagem doEssa técnica permite a tipagem do genoma de microorganismos,genoma de microorganismos, possibilitando sua comparação entrepossibilitando sua comparação entre isolados de amostras clínicas.isolados de amostras clínicas.
  25. 25. BIBLIOGRAFIABIBLIOGRAFIA  http://virtual.unipar.br/courses/GMBM/dochttp://virtual.unipar.br/courses/GMBM/doc ument/aula-PCR-MESTRADO.pdf?ument/aula-PCR-MESTRADO.pdf? cidReq=GMBMcidReq=GMBM  http://www.fisiologia.kit.net/biomol/4.htmhttp://www.fisiologia.kit.net/biomol/4.htm  http://pt.wikipedia.org/wiki/PCRhttp://pt.wikipedia.org/wiki/PCR
  26. 26. OBRIGADO!!!

×