XL-47P9

1. [Limão Siciliano 011]
Óleo essencial: Citrus spp.
Composto: Limoneno, óxido de cis-limoneno, trans-carveol, carvona, óxido de
trans-limoneno, cis-p-Mentha-2,8-dien-1-ol, trans p-Mentha-2,8-dien-1- ol, álcool
perrilla, cis-carveol, cis-p-Mentha 1, 8-dien-2-ol e 1,8-menthadien-4-ol
Título: Unraveling the selective antibacterial activity and chemical composition of citrus
essential oils
“Desvendando a atividade antibacteriana seletiva e a composição química de óleos
essenciais cítricos”
Autor: Carmen M. S. Ambrosio, Natália Y. Ikeda, Alberto C. Miano, Erick Saldaña,
Andrea M. Moreno, Elena Stashenko, Carmen J. Contreras-Castillo & Eduardo M.
DaGloria
Journal: Scientific Reports
Vol/Issue: 9:17719
Ano: 2019
DOI:10.1038/s41598-019-54084-3
TAGs: Citrus sinensis; óleo de laranja; óleo de casca de laranja; terpenos de laranja
brasileiros; fase de óleo de limão do Taiti; Citrus terpenos; composição química; óleos
cítricos; limoneno; diarreia; antimicrobiano; Escherichia coli; Lactobacillus; in vitro;
limão; antibacteriano; diarreia pós-desmame; intestino; porco; bactéria intestinal; flora
intestinal; carvona; Citrus spp.; limão; triagem de difusão por disco; concentração
inibitória mínima; concentração bactericida mínima; suínos; veterinária; resistência à
antibióticos; crescimento microbiano; crescimento bacteriano; cálculo de parâmetros
cinéticos.
Sobre o artigo:

2. A incidência de diarreia pós-desmame (DPD) é um problema sério na indústria suína
em todo o mundo, causando graves perdas econômicas devido ao aumento da
morbidade e mortalidade dos suínos, diminuição da taxa de crescimento e aumento da
necessidade de medicamentos para o tratamento dos animais.
A DPD é causada principalmente pela bactéria Escherichia coli enterotoxigênica
(ETEC), que está altamente presente no trato gastrointestinal de porcos afetados. Esse
tipo de patógeno é caracterizado pela produção de adesinas, que intermediam a
aderência bacteriana ao intestino e de toxinas que levam à hipersecreção de água e
eletrólitos.
A presença de ETEC no meio ambiente é um importante fator de transmissão, pois
podem sobreviver protegidos no esterco por cerca de 6 meses. Por outro lado, E. coli
multiplicam-se rapidamente e pode atingir até 109
CFU por grama de fezes, com a
infecção produzida dependente do grau de colonização bacteriana.
Para controlar os surtos de DPD causados por enterobactérias como ETECs,
antibióticos têm sido frequentemente incluídos na dieta de leitões desmamados como
tratamento, medida preventiva ou promotor de crescimento.
No entanto, o uso contínuo de antibióticos tem sido sugerido como uma das causas do
surgimento e disseminação mundial de bactérias resistentes. Atualmente, existe uma
grande preocupação com o surgimento de resistência à colistina (antibiótico) mediada
por plasmídeo em E. coli, um mecanismo de resistência a uma importante classe de
antibióticos, que foi amplamente utilizada na produção de suínos como promotor de
crescimento.
Assim, o uso prolongado de antibióticos pode provocar diminuição da diversidade da
microbiota e aumento das chances de patógenos colonizarem o intestino.
Contudo, o Lactobacillus – principal grupo de bactérias benéficas presentes na
microbiota intestinal de suínos – foi identificado como um importante grupo de bactérias
capazes de prevenir doenças intestinais.

3. Os possíveis mecanismos dos Lactobacilos para combater infecções pós-desmame em
leitões foram descritos como (1) a inibição direta do crescimento do patógeno e sua
virulência pela secreção de metabólitos antimicrobianos como bacteriocinas, (2) a
modulação da composição da microbiota e sua atividade e, (3) a estimulação do
sistema imunológico do hospedeiro e a melhoria da integridade da barreira intestinal.
Nesse cenário, encontrar um aditivo antimicrobiano para ração com atividade
antibacteriana seletiva, atividade de alto espectro em bactérias patogênicas e efeito
reduzido ou não em bactérias benéficas como Lactobacillus seria muito desejável.
Na última década, compostos fitogênicos como óleos essenciais têm recebido mais
atenção como potenciais alternativas para substituir os promotores de crescimento
antimicrobiano na produção animal devido às suas conhecidas propriedades biológicas:
antimicrobiana, antioxidante e antiinflamatória.
Alguns estudos relataram que alguns OEs podem suprimir bactérias patogênicas
enquanto estimulam microrganismos benéficos, como os lactobacilos, no intestino de
suínos.
Especificamente, os OEs cítricos, subprodutos da produção de suco de laranja, podem
ser uma excelente alternativa para esse fim, uma vez que apresentam bom potencial
no combate a bactérias patogênicas como Listeria spp., Salmonella spp., E. coli,
Staphylococcus aureus e Bacillus cereus.
Além disso, o uso de OE de cítricos na alimentação animal pode se tornar viável, uma
vez que existe uma grande disponibilidade desses óleos no mercado mundial.
Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antibacteriana seletiva de seis
OEs comerciais de cítricos sobre cepas ETEC isoladas de intestino de suíno e sobre
duas espécies de Lactobacillus, bem como determinar a composição química desses
OEs.
Os óleos foram nomeados como: essência de fase oleosa de laranja (FOL), óleo de
casca de laranja (OCL), terpenos de laranja brasileira (TLB), fase oleosa de limão tahiti
(FOLT) e terpenos cítricos (TC).

4. Resultados:
1. Atividade antibacteriana
1.1. Triagem por disco de difusão
Uma boa representação da atividade antibacteriana dos óleos cítricos foi obtida e os
resultados do diâmetro da zona de inibição (DZI) mostraram que todos os óleos cítricos
tinham alta atividade antibacteriana em todos os ETECs, enquanto uma baixa atividade
nas duas espécies de Lactobacillus foi observada.
Além disso, ao contrário do antibiótico colistina, um antibiótico que apresentou
desempenho seletivo (atividade antibacteriana nas ETECs e nenhuma atividade nas
espécies de Lactobacillus), os OEs cítricos apresentaram desempenho superior nos
ETECs.
Olhando para o PCA (Fig. 1), quatro dos cinco OEs cítricos, TLB, FOL, TC e OCL,
foram os óleos mais seletivos, visto que foi observada uma associação mais próxima
de sua atividade antibacteriana com ETECs do que com espécies de Lactobacillus,
com DZIs maiores do que 18 mm.
Porém, desses quatro OEs, o TLB se destacou por exibir a melhor atividade
antibacteriana seletiva, pois foi o que apresentou os maiores DZIs para todas as
ETECs, assim como consideráveis DZIs baixos para as duas espécies de Lactobacillus
avaliadas. Portanto, esse óleo foi selecionado pelos pesquisadores para dar
continuidade ao estudo.
Em relação à suscetibilidade dos ETECs, E. coli U7 foi a cepa mais sensível à atividade
dos OEs, uma vez que os maiores DZIs foram observados. Por outro lado, E. coli U21
foi a menos sensível ou a mais resistente ETEC, já que foram obtidos os menores DZIs
nesta bactéria.
No caso das espécies de Lactobacillus, observou-se que L. plantarum foi a bactéria
benéfica mais resistente à atividade dos OEs, uma vez que os menores DZIs foram
obtidos neste organismo.

5. Figura 1: Análise de componentes principais de seis OEs de citros com base em sua atividade
antibacteriana na cepa ETECs e nas espécies de lactobacillus. Essência de fase oleosa de
laranja (FOL), óleo de casca de laranja (OCL), terpenos de laranja brasileira (TLB), fase de óleo
de limão tahiti (TLOP), e terpenos cítricos (TC).
1.2. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração
bactericida mínima (CBM)
As determinações de CIM e CBM foram feitas usando apenas o OE mais seletivo (TLB)
para a cepa mais resistente (E. coli S21), e para a espécie mais sensível de
Lactobacillus (L. rhamnosus).
Os valores de CIM e CBM para TLB, conforme determinado pelas curvas de
sobrevivência e teste de resazurina, foram ambas de 1,85 mg/mL para a bactéria;
enquanto que para L. rhamnosus foi 3,70 mg/mL e o CBM de 7,40 mg/mL.
Assim, esses resultados reafirmam a atividade antibacteriana seletiva desse óleo
cítrico, uma vez que para inibir totalmente o crescimento da bactéria benéfica L.
rhamnosus exigia uma concentração de OE equivalente a duas vezes a CIM observada

6. para E. coli U21 e para eliminá-la totalmente exigia uma concentração de quatro vezes
da CIM. Portanto, fica bastante claro que a bactéria patogênica foi mais sensível ao
TLB do que a bactéria benéfica.
1.3. Modelagem de crescimento bacteriano e cálculo de parâmetros cinéticos
As curvas de sobrevivência ou cinética de crescimento de E. coli U21 mostraram que
as quatro maiores concentrações de TLB inibiram totalmente o crescimento dessa
bactéria e o crescimento só foi observado para concentrações iguais ou inferiores a
0,925 mg/mL de óleo.
No caso de L. rhamnosus, o crescimento bacteriano foi observado até a concentração
de 1,85 mg/mL de TLB e as três maiores concentrações causaram a inibição completa
dessa bactéria.
Além disso, os pesquisadores observaram que a concentração de TLB foi capaz de
provocar maiores distúrbios na cinética de crescimento normal de E. coli U21 do que L.
rhamnosus.
Observou-se que a densidade máxima de cultura bacteriana (A) foi muito reduzida
conforme a concentração de TLB foi aumentada. Por exemplo, A foi reduzido em 39%
na concentração mais baixa e em 56% na concentração subinibitória mais alta (0,925
mg/mL), como mostra a figura 2.

7. Figura 2: Parâmetros A para E. coli U21 em função da concentração de TLB. Os pontos são os
valores experimentais, as barras verticais são o desvio padrão e as curvas são o modelo das
equações 1 e 2, respectivamente.
Em relação a L. rhamnosus, este parâmetro não foi afetado pelas concentrações de
OE, onde não foram detectadas diferenças significativas.
A taxa máxima de crescimento para ambas as bactérias, E. coli U21 e L. rhamnosus,
não foi afetada pelas concentrações de OE. Consequentemente, a taxa de crescimento
foi bastante maior para L. rhamnosus do que para E. coli U21.
Em relação à duração da fase de latência (λ), observou-se que para ambas as
bactérias esse parâmetro aumentou com o aumento da concentração de OE. Para E.
coli U21, λ foi ligeiramente mais longo do que o controle nas três concentrações mais
baixas de OE, mas de 0,463 mg/mL para acima, a fase de latência aumentou
notavelmente.
Por exemplo, λ aumentou aproximadamente oito vezes na concentração subinibitória
mais alta de TLB (0,925 mg/mL), em contraste com o controle (0 mg/mL). Portanto,
esse parâmetro teve um comportamento exponencial em função da concentração de
OE (Fig. 3b).

8. Figura 3: Parâmetro λ para E. coli U21 em função da concentração de TLB. Os pontos são os
valores experimentais, as barras verticais são o desvio padrão e as curvas são o modelo das
equações 1 e 2, respectivamente.
Para L. rhamnosus, λ sofreu apenas um aumento significativo, aproximadamente 1,6
vezes na maior concentração efetiva de TLB subinibitória (1,85 mg/mL), e o
comportamento de λ para este organismo benéfico foi linear em função da
concentração de OE (Fig. 4).
Figura 4: Parâmetros λ para L. rhamnosus em função da concentração de TLB. Os pontos são
os valores experimentais; as barras verticais são o desvio padrão e as curvas são o modelo da
equação.
Portanto, a avaliação dos parâmetros cinéticos de crescimento bacteriano confirmou
que o óleo cítrico TLB, teve um efeito mais forte sobre a bactéria patogênica do que
sobre a bactéria benéfica, provocando maiores distúrbios em sua cinética de
crescimento, comprovando as características antibacterianas seletivas do TLB.
1.4. Caracterização da composição química de óleos essenciais
Para os cinco óleos cítricos, o limoneno foi detectado como o composto principal, no
entanto, FOLT apresentou a menor quantidade relativa desse importante composto
(46,53%).

9. Os óleos TLB, TC, FOL e OCL apresentaram um perfil de composição química muito
próxima e foram caracterizados por terem a maior atividade antibacteriana seletiva.
Portanto, isso permite sugerir que a atividade antibacteriana dos OEs cítricos não pode
ser atribuída especificamente ao limoneno, uma vez que compostos comuns menores,
como óxido de cis-limoneno, trans-carveol, carvona, óxido de trans-limoneno,
cis-p-Mentha-2,8-dien-1-ol, trans-p-Mentha-2,8-dien-1 -ol, álcool de perrila, cis-carveol,
cis-p-Mentha-1, 8-dien-2-ol e 1,8-menthadien-4-ol também foram detectados e estavam
presentes exclusivamente nesses quatro OEs ou em quantidades maiores do que no
FOLT.
Na prática:
Como sugere o estudo, a inclusão do OE cítrico em uma dieta balanceada auxilia na
manutenção de uma boa flora intestinal, pois este óleo tem a capacidade seletiva de
atacar apenas bactérias patógenas (causadora de doenças) e resguardando as
espécies benéficas responsáveis pela regulação positiva do intestino e
consequentemente melhorando a vida dos animais.
Vale ressaltar que a mesma coisa acontece no intestino humano, onde as bactérias
benéficas e maléficas em equilíbrio proporcionam a saúde do sistema digestivo e o seu
desequilíbrio pode causar infecções e problemas de saúde graves.