YK-08D1

1. [Olíbano 004]
Óleo essencial: Boswellia carteri, Pinus pinaster e Pelargonium hortorum
Composto: Não demonstrado
Título: Frankincense, pine needle and geranium essential oils suppress tumor
progression through the regulation of the AMPK/mTOR pathway in breast câncer
“Os óleos essenciais de olíbano, agulha de pinheiro e gerânio suprimem progressão
tumoral através da regulação da Via AMPK / mTOR no câncer de mama”.
Autor: Peng Ren, Xiang Ren, Lei Cheng e Lixin Xu
Journal: Oncology Reports
Vol/Issue: 39 (1)
Ano: 2017
DOI: 10.3892/or.2017.6067
TAGs: Olíbano; agulha de pinheiro; gerânio; câncer; câncer de mama; viabilidade
celular; neoplasia maligna; quimiorresistência; toxicidade; MCF-7; ciclo celular;
atividade antitumoral; Boswellia carteri; Pinus pinaster; Pelargonium hortorum; in vitro;
proliferação celular; capacidade migratória; apoptose; citometria de fluxo; vias de
sinalização; proteínas; células cancerígenas; ensaio de formação de colônias; ensaio
de cicatrização de feridas;

2. Sobre o artigo:
O Câncer de mama (CM) é a doença maligna mais comum entre as mulheres em todo
o mundo e está associada à alta morbidade e mortalidade.
A cirurgia combinada com terapia adjuvante foi a principal estratégia de tratamento
desenvolvida para pacientes com CM. E, além disso, as terapias endócrinas e
direcionadas também foram gradualmente aplicadas à terapia clínica.
No entanto, no tratamento de casos agressivos, a quimiorresistência e a toxicidade são
as principais causas de falha. Assim, é importante definir e desenvolver novos agentes
terapêuticos, que possam se ligar às células do CM de forma específica e eficaz.
O olíbano, a resina de goma derivada da espécie Boswellia, contém ingredientes
bioativos que já demonstraram modular atividades biológicas críticas, incluindo
atividades antirreumatismo, anti-inflamatória, antibacteriana, antifúngica e anticâncer. O
óleo essencial de olíbano é preparado pela destilação a vapor da resina de goma de
olíbano.
A agulha de pinheiro (Pinus densiflora) é normalmente utilizada como um medicamento
fitoterápico, infusão de saquinhos de chá e suplemento de saúde em países do Leste
Asiático, como Coréia e China. É benéfico na terapia de pacientes com doença
cardíaca coronária (CHD), distúrbios neurodegenerativos e carcinoma.
O óleo essencial de gerânio tem sido usado nas indústrias de cosméticos, perfumes,
aromaterapia e alimentos. Além disso, o óleo, famoso por suas propriedades
antibacterianas, antioxidantes e anti-inflamatórias, é utilizado como medicamento
tradicional há muito tempo.
No entanto, se os óleos essenciais de olíbano, agulha de pinheiro e gerânio têm algum
efeito na progressão do CM em células cancerígenas (MCF-7) ainda não está claro.

3. O presente estudo investigou as propriedades anticâncer dos óleos essenciais
preparados nas células MCF-7 (uma linha celular de câncer de mama isolada). E, além
disso, os pesquisadores buscaram elucidar a via regulatória AMPK / mTOR envolvendo
óleos essenciais na proliferação, invasão e desenvolvimento de apoptose de células
CM.
Portanto, foram avaliados os possíveis efeitos dos óleos essenciais de olíbano, agulha
de pinheiro e gerânio na viabilidade celular, proliferação, migração e invasão, bem
como os possíveis mecanismos. As células MCF-7 (linha celular de câncer) foram
tratadas com óleos e as associações com o câncer de mama foram investigadas.
Resultados:
1. Viabilidade e proliferação das células MCF-7
Para determinar se esses três óleos essenciais afetaram a viabilidade das células
MCF-7, o número de células viáveis foi determinado seguindo várias diluições (olíbano,
1:1000 a 1:4000; agulha de pinheiro, 1:1000 a 1:4.000; gerânio, 1:1000 a 1:8000) de
exposição ao óleo.
E como mostrado em Fig. 1A-C, a viabilidade celular diminuiu de forma dependente da
dose quando as células MCF-7 foram tratadas com os óleos. Além disso, podemos
observar nos gráficos abaixo que nenhuma célula MCF-7 viável permaneceu após 48 h
de tratamento com diluição 1:1000 de óleo.

4. Figura 1: Os óleos essenciais de olíbano, agulha de pinho e gerânio suprimem a viabilidade
celular de células MCF-7. (AC) células MCF-7 foram semeadas em uma cultura de tecidos de
96 poços. As células foram submetidas a diluições em série de olíbano, agulha de pinheiro e
tratamento com óleos essenciais de gerânio (WT, células tratadas com nada; DMSO, células
tratadas com DMSO; óleo, células tratadas com óleo; PTX, células tratadas com paclitaxel). A
viabilidade celular foi determinada 48 h após o tratamento com óleo essencial pelo ensaio
CCK-8.
Com base no ensaio CCK-8, os valores de IC50 (a concentração inibitória de 50% de
olíbano / agulha de pinheiro / óleo essencial de gerânio) para células MCF-7 foram 42,8
µg/ml, 90.2 µg/ml e 73.9 µg/ml, respectivamente.
Além disso, para determinar se o óleo suprime a viabilidade celular, as células MCF-7
também foram submetidas à avaliação morfológica.
As células MCF-7 sofreram alterações morfológicas significativas, como destacamento
das placas de cultura de tecidos e encolhimento após a exposição ao óleo (com
tratamento de diluição IC50 por 48 h).
Além disso, o ensaio de formação de colônias revelou que o tamanho da colônia e a
capacidade de formação de colônias das células MCF-7 foram fortemente reduzidos na
presença dos óleos em comparação com os controles (Fig. 1E).

5. Esses resultados indicaram que os óleos essenciais de olíbano, agulha de pinheiro e
gerânio desempenharam um papel na proliferação de células BC.
Figura 1E: Os óleos essenciais de olíbano, agulha de pinho e gerânio suprimem a proliferação
de células MCF-7. As células foram semeadas em placas, subsequentemente expostas e
incubadas com olíbano / agulha de pinheiro / óleo essencial de gerânio (1: 3000; 1: 3300; e 1:
6000 v/v). Após 8 dias de cultura, as colônias sobreviventes foram contadas com coloração
com violeta cristal.
2. Regulação da agressividade das células MCF-7
Para examinar se esses três óleos essenciais exerceram uma regulação direta na
resposta à agressividade do CM, as células MCF-7 foram tratadas com diferentes óleos
essenciais.
Após tratamentos com olíbano, agulha de pinheiro e óleo essencial de gerânio, a
capacidade migratória foi significativamente diminuída conforme determinado pelo
ensaio de cicatrização de feridas (Fig. 2A).

6. Concomitantemente aos experimentos mencionados, os pesquisadores investigaram o
papel potencial desses três óleos essenciais na mediação das habilidades invasivas
das células MCF-7.
Os resultados do ensaio de invasão revelaram que o número / campo de células
invadidas foi muito menor do que no grupo de controle (Fig. 2B). Coletivamente, esses
resultados demonstraram que os óleos essenciais de olíbano, agulha de pinheiro e
gerânio regulavam a agressividade das células BC.

7. Figura 2: Os óleos essenciais de olíbano, agulha de pinheiro e gerânio suprimiram a migração
e invasão de células MCF-7. (A) A capacidade de migração das células foi comparada em
tratamentos com olíbano, agulha de pinheiro e óleo essencial de gerânio e grupos de controle
com base na cicatrização de feridas. (B) A análise de gel ECMatrix in vitro foi realizada para
comparar a invasão celular entre 3 células tratadas com óleo essencial e grupos de controle.
3. Apoptose e o ciclo celular das células MCF-7
Para explorar o papel potencial desses três óleos essenciais na modulação da
apoptose e do ciclo celular, as células MCF-7 foram tratadas com óleos (olíbano, 1:
3.300; agulha de pinheiro, 1: 3000; óleo essencial de gerânio, 1: 6000) por 48 h,
respectivamente. A apoptose celular e o ciclo celular foram analisados por citometria
de fluxo.
Como mostrado em Fig. 3A, o número de células apoptóticas foi aumentado nos
grupos tratados com os óleos, em comparação com os grupos de controle WT e
DMSO.

8. Figura 1A: Os óleos essenciais de olíbano, agulha de pinheiro e gerânio regulam a apoptose e
o ciclo celular das células MCF-7. (A) células MCF-7 foram tratadas com óleos (olíbano, 1:
3300; agulha de pinheiro, 1: 3000; óleo essencial de gerânio, 1: 6000) por 48 h,
respectivamente. A apoptose celular foi analisada por citometria de fluxo.
A clivagem de PARP está envolvida no reparo do DNA após estresse ambiental, e,
portanto, os pesquisadores detectaram a expressão de PARP clivada para avaliar a
atividade apoptótica de células MCF-7 tratadas com os óleos. Com isso, os níveis de
PARP clivados aumentaram nas células tratadas com óleo.
Também se determinou a expressão da proteína Bcl-2 e descobriu-se que os óleos
induziram uma diminuição na expressão de Bcl-2.
Além disso, após a análise do ciclo celular de células MCF-7 os pesquisadores
descobriram que a porcentagem de células presas nas fases G0 / G1, S e G2-M não
foram significativamente alteradas (Fig. 3C).
Coletivamente, esses resultados indicaram que os óleos essenciais de olíbano, agulha
de pinheiro e gerânio induziram apoptose, mas não a parada do ciclo celular de células
MCF-7.

9. Figura 3: Os óleos essenciais de olíbano, agulha de pinheiro e gerânio e o ciclo celular das
células MCF-7. (C) Células MCF-7 foram tratadas com 3 óleos essenciais e o ciclo celular foi
analisado por citometria de fluxo.
4. A atividade da via AMPK / mTOR
A ativação da AMPK regula os principais eventos de sinalização proliferativa, como
mTOR / p70S6K. Além disso, o mTOR demonstra ser um controlador central da
proliferação, crescimento e sobrevivência celular.
No presente estudo, os pesquisadores analisaram a atividade de sinalização de AMPK
e seu alvo a jusante por tratamento de células MCF-7 com olíbano, agulha de pinheiro
e óleo essencial de gerânio.
A análise revelou que os níveis de AMPK fosforilada foram aumentados em células
MCF-7 tratadas com estes 3 óleos essenciais (Fig. 4A e B).
Concomitantemente, os graus de fosforilação de mTOR e seu efetor 4E-BP1 a jusante
foram marcadamente diminuídos em células MCF-7 tratadas com esses 3 óleos
essenciais.

10. Por outro lado, não houve alteração na quantidade total de AMPK e proteína mTOR,
demonstrando uma verdadeira diminuição no status de fosforilação. Esses resultados
revelaram que o efeito antiproliferativo, anti-invasivo e de apoptose induzida de óleos
essenciais de olíbano, agulha de pinheiro e gerânio em células MCF-7 envolveu a
inibição de mTOR iniciada por AMPK.
Figura 4: Efeito da via de sinalização AMPK / mTOR ativada por olíbano, agulha de pinheiro e
óleo essencial de gerânio. (A) células MCF-7 foram expostas a óleos (olíbano, 1: 3300; agulha
de pinheiro, 1: 3000; óleo essencial de gerânio, 1: 6000). Podemos observar que a expressão
de moléculas de sinalização AMPK / mTOR foi suprimida nos níveis de proteína com esses três
tratamentos de óleo essencial em células MCF-7. Os óleos essenciais de olíbano, agulha de
pinheiro e gerânio aumentaram significativamente a fosforilação de AMPK e diminuíram a
fosforilação de mTOR. Os blots foram sondados para β-actina como um controle de
carregamento.
5. O óleo essencial de olíbano modula o crescimento do tumor em um modelo de
camundongo com xenoenxerto
Finalmente, examinou-se a tumorigênese do óleo essencial de olíbano em células
MCF-7 por experimentos in vivo.

11. A administração com injeção subcutânea de olíbano, esfregaço de olíbano, injeção
subcutânea combinada com esfregaço de olíbano suprimiu significativamente o
crescimento do tumor em camundongos nus implantados com tumores MCF-7
estabelecidos (Fig. 5A).
Além disso, a taxa de crescimento do tumor do grupo combinado foi mais lenta do que
a do grupo da injeção e do grupo do esfregaço. Ainda, o ensaio TUNEL revelou um
número significativamente maior de células TUNEL-positivas que foram detectadas no
grupo experimental, em comparação com o grupo de controle.
Os resultados demonstraram que o número de células apoptóticas no grupo de
combinação foi maior do que nos outros grupos de controle experimental (Fig. 5B).
Coletivamente, estudos in vivo confirmaram que o olíbano suprimiu o crescimento do
tumor e induziu a apoptose.
Figura 5: O óleo essencial de olíbano regula o crescimento do tumor em um modelo de
camundongo com xenoenxerto. (A) células MCF-7 foram implantadas nos flancos esquerdos e
direitos de camundongos nus, respectivamente. Uma semana depois, os ratos foram divididos
aleatoriamente em 7 grupos, seguido de tratamento. Os volumes do tumor são mostrados
como indicado. (B) A apoptose no tumor foi detectada pelo ensaio TUNEL.

12. Na prática:
Os resultados demonstram claramente que os óleos essenciais de olíbano, agulha de
pinheiro e gerânio suprimiram a viabilidade, proliferação e invasão celular na linhagem
celular de CM humano através das células MCF-7.
Além disso, os óleos essenciais de olíbano, agulha de pinheiro e gerânio induziram
apoptose, mas não afetaram a progressão do ciclo celular. O óleo essencial de olíbano
também foi eficaz na inibição do crescimento tumoral e na indução da apoptose de
células tumorais em modelo de camundongo.
E ainda, os óleos essenciais de olíbano, agulha de pinheiro e gerânio suprimiram a
progressão celular através da via AMPK / mTOR, enzimas responsáveis pelo equilíbrio
energético das célula.