1) O estudo avaliou a atividade antimicrobiana do óleo essencial de folhas de Citrus limon var. Pompia e seus gases contra Listeria monocytogenes em queijo ricotta salata. 2) A análise do óleo essencial revelou acetato de linalila como principal composto, enquanto seus gases continham mais limoneno e monoterpenos. 3) Testes in vitro mostraram que os gases inibiram o crescimento de L. monocytogenes, efeito sinérgico com refrigeração, mas citral foi menos efetivo

1. [Limão Siciliano 010]
Óleo essencial: Citrus limon
Composto: Acetato de linalila, limoneno e isômeros do citral
Título: Antimicrobial activity of gaseous Citrus limon var Pompia leaf essential oil
against Listeria monocytogenes on ricotta salata cheese
“Atividade antimicrobiana do óleo essencial gasoso de folhas de Citrus limon var
Pompia contra Listeria monocytogenes no queijo ricotta salata”
Autor: Francesco Fancello, Giacomo L. Petretto, Salvatore Marceddu, Tullio Venditti,
Giorgio Pintore, Giacomo Zara, Ilaria Mannazzu, Marilena Budroni e Severino Zara
Journal: Food Microbiology
Vol/Issue: 87
Ano: 2019
DOI: 10.1016/j.fm.2019.103386
TAGS: Antimicrobiano; queijo ricotta salata; acetato de linalila; limoneno; OE gasoso;
OE líquido; bactericida; bacteriostático; limão; pompia; bactéria resistente; Listeria
monocytogenes; Citrus limon; limão; preservação de queijos; in vitro; conservante de
alimento; Citrus limon var. Pompia Camarda; Listeria monocytogenes; vaporização;
incubação; concentração inibitória mínima; deterioração microbiana dos alimentos;
citral; análise morfológica.
Sobre o artigo:
A deterioração microbiana dos alimentos ocorre devido ao crescimento descontrolado
de microorganismos indesejáveis, os quais são responsáveis pela mudança no sabor e
podem produzir substâncias tóxicas que comprometam a saúde do consumidor.

2. Nos países europeus, mais de 23 milhões de pessoas adoecem por comer alimentos
contaminados todos os anos e embora os agentes químicos antimicrobianos tenham
sido empregados no processamento de alimentos por décadas com o objetivo de
reduzir o efeito da contaminação microbiana, há agora uma demanda crescente por
ingredientes e aditivos naturais para alimentos, incluindo compostos antimicrobianos
naturais.
Assim, para acompanhar as tendências de consumo, substâncias de origem natural,
como óleos essenciais de plantas estão sendo considerados como alternativas aos
antimicrobianos sintéticos.
Como a composição química dos OEs varia de acordo com a matéria-prima vegetal,
mesmo na mesma espécie botânica, o efeito antimicrobiano varia significativamente
com relação à origem da planta.
Além disso, os patógenos são capazes de desenvolver resistência a compostos
específicos, ao passo que pode ser mais difícil para eles desenvolverem resistência a
uma mistura complexa de compostos, como no caso dos OEs.
Embora a atividade dos OEs e seus componentes tenham sido avaliados in vitro contra
uma série de microrganismos de origem alimentar, poucos estudos foram realizados
sobre a aplicação de OEs como agentes antimicrobianos em sistemas alimentares
reais.
A conclusão geral que surge da literatura é que concentrações mais altas de OEs são
necessárias ao trabalhar com um sistema alimentar real para atingir o mesmo efeito
observado nas mesmas condições em ensaios in vitro.
Os protocolos desenvolvidos para estudar o efeito conservante dos OE em sistemas
alimentares podem ser divididos em 3 grupos principais: 1) contato direto com uma
solução de OE e Tween®; 2) inclusão dos OE em filmes comestíveis ou

3. nano-portadores capazes de interagir diretamente com a atmosfera e os alimentos; 3)
tratamento de alimentos por vapor com OE gasoso.
OEs gasosos (vaporização de OEs) não são adicionados diretamente aos alimentos,
mas podem ser usados como agentes antimicrobianos primários em materiais de
embalagem de alimentos e também como agentes sanitizantes para superfícies de
alimentos e superfícies de contato com alimentos.
A vantagem de usar gases de OE é que eles geralmente causam alterações mínimas
no aroma e sabor dos alimentos porque há penetração mínima na área subsuperficial.
Inclusive, foi recentemente descoberto que alguns gases de OEs exercem maior
atividade antimicrobiana contra patógenos de origem alimentar e bactérias
deteriorantes quando comparados com OEs em fase líquida.
Dispositivos também foram propostos para estudar a atividade antimicrobiana do vapor
de OE ou outros compostos voláteis aplicados diretamente na matriz alimentar, como
câmaras compactas feitas de materiais acrílicos capazes de conter o alimento e
produzir vapor ou gás de OE.
O grupo de pesquisa deste estudo avaliou recentemente a composição química e a
atividade antimicrobiana in vitro do OE extraído das folhas de uma variedade particular
de limão da Sardenha, a saber, Citrus limon var. Pompia Camarda, contra várias cepas
de Listeria monocytogenes e mostraram que seu OE exerce atividade antilisterial.
Esta bactéria já foi isolada de uma variedade de matrizes de alimentos crus e
processados, incluindo leite e produtos lácteos, carnes, ovoprodutos, frutos do mar,
vegetais e outros alimentos prontos para consumo.
Considerando suas propriedades físico-químicas, o queijo ricotta salata está sujeito à
contaminação por microrganismos patogênicos e deteriorantes, podendo ser facilmente

4. contaminado por L. monocytogenes devido à sua frequente manipulação durante o
processo de produção, apresentando sérios desafios ao controle do crescimento desta
bactéria.
Portanto, no presente trabalho, uma estratégia de barreira moderada foi usada para
testar o crescimento de L. monocytogenes inoculadas em queijo ricotta salata usando
óleo essencial de folha de Pompia e gases citrais em temperatura de refrigeração.
Resultados:
1. Composição química do OEP
A análise qualitativa por GC-MS do OE extraído das folhas de Pompia revelou alguns
resultados diferentes em comparação com os dados da literatura.
Em particular, o cromatograma de íon total (TIC) obtido por uma análise de varredura
completa mostrou a presença de 27 compostos, dos quais terpinen-4-ol, acetato de
linalila e alguns derivados de sesquiterpeno não foram relatados em estudos
semelhantes da literatura – estes foram encontrados em quantidades vestigiais, com
exceção do acetato de linalila, que teve uma concentração de quase 300 mg/mL de
OE.
O éster acético de linalol foi o principal composto detectado no OE, seguido pelo
limoneno detectado na concentração de cerca de 257 mg/mL. O Neral e geranial – os
dois isômeros do Citral – foram detectados em concentrações mais baixas em
comparação com as relatadas em nossa publicação anterior, precisamente 87 e 98
mg/mL, respectivamente, em comparação com 173 e 214 mg/mL.
2. Composição química do OEP gasoso

5. A fumigação do OEP foi realizada adicionando uma quantidade medida do OE em uma
placa de Petri usando um dispositivo e a análise química qualitativa dos compostos
liberados foi realizada por HS-SPME / GC-MS.
De acordo com o estudo anterior feito pela mesma equipe de pesquisa deste estudo, a
concentração dos componentes mais voláteis é maior na fase de vapor em relação ao
óleo puro; eles incluem os componentes que eluem na primeira parte do cromatograma
(ou seja, aqueles com tempos de retenção menores), como limoneno, mirceno e outros
compostos de monoterpeno.
Em contraste, os compostos menos voláteis, como neral, geranial, acetato de linalila e
a fração sesquiterpênica estavam presentes em concentrações mais baixas na fase de
vapor em relação ao óleo puro.
3. CIM de gases de OEP e citral
As concentrações inibitórias mínimas (CIMs) dos gases OEP e citral, determinados
pelo método de volatilização de disco, apresentaram um comportamento dependente
da deformação.
Enquanto o CIM do gás OEP (0,086 μL/cm³) foi o mesmo para todas as três cepas de
L. monocytogenes testadas, diferenças foram observadas em relação à sensibilidade
ao gás citral: a CIM do gás citral para a cepa de L. monocytogenes foi de 0.014 μL/cm³,
enquanto foi de 0,028 μL/cm³ para as outras duas cepas.
4. Determinação do efeito antimicrobiano sinérgico entre o tratamento OEP
gasoso e a temperatura de refrigeração
O tratamento em diferentes temperaturas apresentou resultados opostos – a 37 °C não
foram observadas diferenças no crescimento de L. monocytogenes tratadas com OEP

6. gasoso em relação à placa controle, exceto por um ligeiro atraso de crescimento no
primeiro dia de incubação.
Pelo contrário, quando o tratamento com OEP gasoso foi seguido de incubação a 5 °C,
observou-se um acentuado atraso no crescimento de Listeria, mesmo após 10 dias de
incubação (Figura 1).
Figura 1: Atividade antimicrobiana in vitro de uma exposição de 3 h a 0,5 mL de OEP gasoso
em placas inoculadas com 103 células/mL e incubadas a 5 °C por 10 dias. Na figura, as placas
de controle são mostradas na parte superior e as placas tratadas na parte inferior. As cepas de
L. monocytogenes foram inoculadas individualmente (20600 DSMZ, B STAA e E STAA) e
misturadas conforme indicado.
Em particular, o crescimento da cepa L. monocytogenes E foi completamente inibido
pelo tratamento e a incubação seguinte a 5 °C, enquanto o L. monocytogenes B foi o
menos sensível ao tratamento. Esses resultados mostraram que a temperatura de
refrigeração e o OEP gasoso têm um potente efeito sinérgico.
5. Atividade antimicrobiana de OEP gasoso contra cepas de L. monocytogenes

7. Os efeitos de duas concentrações de OEP gasoso na cepa L. monocytogenes DSMZ
20600 inoculada em queijo ricotta salata foram avaliados (Fig. 2A). Especificamente, as
atividades de 0,5 mL (dose baixa, LD) ou 1 mL (dose alta, HD) de OEP foram
avaliadas.
Figura 2: Atividade antimicrobiana de uma exposição de 3h a uma dose alta (HD) ou baixa (LD)
de vapor de óleo essencial de folha de pompia (1 mL ou 0,5 mL, respectivamente), realizada à
temperatura ambiente, em amostras de queijo ricotta salata experimentalmente contaminado
com (A) L. monocytogenes DSMZ 20600; ou (B) cepas mistas de L. monocytogenes (cepas
DSMZ, 20600, cepa B STAA e cepa E STAA), após 15 e 30 dias de incubação a 5 °C. Queijo
ricotta salata contaminado experimentalmente com aproximadamente 105
CFU/g of L.
monocytogenes DSMZ, mas não tratado desde as amostras de controle. Imagem 1, PC

8. (Controle Positivo); Imagem 2, LD (baixa concentração); Imagem 3, HD (alta
concentração).
O controle positivo para o crescimento bacteriano (CP) foi representado por L.
monocytogenes DSMZ 20600 inoculado em queijo ricotta na ausência de OEP. Sob
essas condições de PC, a bactéria atingiu uma densidade celular de cerca de 7
log10 CFU/g.
O efeito antilisterial de OEP foi dependente do tempo e da concentração. Assim, a
contagem viável de L. monocytogenes foi significativamente reduzida na presença de
uma alta dose de gases OEP (Fig. 2A).
O efeito foi perceptível após 15 dias de incubação, com reduções de cerca de 3 e 4
unidades log em relação ao PC em T0 e em T15, respectivamente. Portanto, ao final do
tratamento, em T30, a contagem viável foi de 1.69 log10 CFU/g – muito menor em
relação à amostra de PC em T30.
Contudo, a L. monocytogenes 20600 DMSZ mostrou menos suscetibilidade em baixas
doses do gás OEP, atingindo um valor significativamente menor de 6.08 log10 CFU/g
em T30 – uma unidade de log menor que a contagem de PC (7.29 log10 CFU/g) em o
mesmo tempo de amostragem.
O efeito do tratamento com OEP gasoso no crescimento da mistura das três cepas de
L. monocytogenes em queijo ricotta salata foi menos pronunciado em relação ao
observado em L. monocytogenes 20600 DSMZ sozinho (Fig. 2B). Mesmo neste ensaio
experimental, a concentração de OEP gasoso foi o principal fator que influenciou no
crescimento bacteriano.
Em particular, altas doses do gás OEP causou uma diminuição significativa na
contagem de cepas mistas após 15 dias de incubação (4.08 log10 CFU/g) em
comparação com a contagem T0 (5.14 log10 CFU/g).

9. Após mais 15 dias de incubação (ou seja, T30), os cientistas observaram um aumento
significativo na contagem de colônias, que atingiu 5.41 log10 UFC/g, mas essa
contagem ainda era significativamente menor do que o equivalente CP (6.07 log10
CFU/g).
Na LD, o OEP gasoso teve efeito bacteriostático no crescimento da mistura de cepas
de L. monocytogenes e após 15 dias de incubação, observou-se uma ligeira diminuição
na mistura de L. monocytogenes por CFU/g. O CFU/g tendeu a aumentar
significativamente após 30 dias de incubação, mas ainda era significativamente
diferente do CP.
6. Atividade antimicrobiana de citral gasoso contra cepas de L. monocytogenes
O efeito do citral gasoso sobre L. monocytogenes DMSZ 20600 em queijo ricotta salata
foi menor em relação ao exercido pelos gases OEP, como mostrado na Fig. 3A.

10. Figura 3: Atividade antimicrobiana de uma exposição de 3h a uma dose alta (HD) ou dose
baixa (LD) de vapor citral (1 mL ou 0,5 mL, respectivamente), realizada à temperatura
ambiente, em amostras de queijo ricotta salata experimentalmente contaminado com
aproximadamente 105
CFU/g de: (A) L. monocytogenes DSMZ 20600; ou (B) cepas mistas de
L. monocytogenes (cepas DSMZ, 20600, cepa B STAA e cepa E STAA), após 15 e 30 dias de
incubação a 5 ° C. Imagem 1, CP (Controle Positivo); Imagem 2, LD (baixa concentração);
Imagem 3, HD (alta concentração).
Em altas concentrações, o efeito no crescimento de L. monocytogenes 20600 DMSZ foi
significativo, com uma redução de cerca de 2 log10 após 15 dias de incubação (3,42
log10 CFU/g) em relação a T0 (5.29 log10 CFU/g), e caindo para 2.56 log10 CFU/g em
T30.
Ao contrário, em baixas concentrações do gás citral, as contagens viáveis foram muito
semelhantes às observadas após o tratamento com o do gás OEP em baixas
concentrações.
Altas concentrações dos gases citrais reduziram significativamente o CFU/g da mistura
de L. monocytogenes em T15, que permaneceu constante até o final do experimento

11. (T30) e foi significativamente diferente da contagem de CP (4.58 log10 CFU/g vs. 6.31
log10 CFU/g, respectivamente).
Finalmente, parece que a mistura de três cepas de L. monocytogenes proliferou mais
lentamente em queijo ricotta salata (PC) em relação a L. monocytogenes DSMZ
sozinho, obtendo uma concentração de UFC logo acima de 6 log10 UFC/g em T30.
7. Análise de microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia eletrônica
de transmissão (MET) de células de L. monocytogenes tratadas com gás OEP
O tratamento de L. monocytogenes com OEP gasoso in vitro mostrou um efeito
marcante na morfologia celular. A análise MEV mostrou que, enquanto as células não
tratadas apresentam superfícies intactas, túrgidas, lisas e estruturas fibrilares (Fig. 4A),
as células tratadas com gás OEP não apresentaram estruturas fibrilares (Fig. 4B).
Figura 4: Micrografias MEV de células de L. monocytogenes não tratadas e tratadas: (A)
células não tratadas; (B) Amostra tratada com gás OEP mostrando células deformadas. No
painel A, estruturas semelhantes a fímbrias são evidentes.

12. Além disso, células tratadas com gás OEP apresentaram modificações na morfologia
da parede celular e a presença de pequenas protuberâncias de estruturas coaguladas
– possivelmente proteínas provenientes da membrana celular e do citoplasma.
Para explorar ainda mais as modificações ultraestruturais que ocorrem nas células
tratadas com vapor, foi utilizada a microscopia eletrônica de transmissão. E enquanto
as células de L. monocytogenes mostraram uma parede celular regular e delineada e
membrana plasmática com algumas estruturas densas bem distribuídas através do
citoplasma (Fig. 5A e B), a maioria das células tratadas mostraram uma parede celular
mais fina e áreas densas brancas dentro do citoplasma.
Outras células mostraram danos internos e várias deformidades; em particular, um
espaço periplasmático alterado e zonas densas distribuídas assimetricamente por todo
o citoplasma (Fig. 5C). Finalmente, algumas células apresentaram rupturas evidentes
da parede celular e da membrana plasmática (Fig. 5D).

13. Figura 5: Micrografias MET de células de L. monocytogenes não tratadas (A, B) e células
tratadas com gás OEP (C, D). No painel D, os efeitos induzidos por OEP na parede celular e na
membrana plasmática são evidentes.
Na prática:
Os resultados destacam o potencial de aplicação do OE gasoso como uma alternativa
natural eficaz às substâncias sintéticas para melhorar a segurança microbiana do
queijo ricotta salata e, possivelmente, outros alimentos – mantendo a alta qualidade do
queijo durante o processo de fabricação e distribuição.
Por esse motivo é possível incluir algumas gotas de óleo essencial de limão siciliano da
variedade pompeia ou outro óleo essencial com perfil químico semelhante para
preservação de queijos não curados, como aponta o estudo.