1) O documento descreve um estudo sobre o mecanismo de ação antibacteriana de um óleo essencial de citrus em Escherichia coli enterotoxigênica e Lactobacillus rhamnosus. 2) A exposição sequencial ao óleo essencial reduziu significativamente a viabilidade da E. coli, enquanto teve um efeito menor em L. rhamnosus. 3) O óleo essencial aumentou a permeabilidade e danificou a integridade da membrana celular da E. coli, mas

1. [Limão Siciliano 012]
Óleo essencial: Citrus sinensis
Composto: Limoneno, óxido de cis-limoneno, óxido de trans-limoneno, trans-carveol,
carvona, trans-p-mentha-2,8-dien-1-ol, mirceno, cis-p-mentha-2,8-dien-1-ol e
cis-carveol.
Título: In vitro mechanism of antibacterial action of a citrus essential oil on an
enterotoxigenic Escherichia coli and Lactobacillus rhamnosus
“Mecanismo in vitro de ação antibacteriana de um óleo essencial de citrus em
Escherichia coli enterotoxigênica e Lactobacillus rhamnosus”
Autor: Carmen M. S. Ambrosio, Carmen J. Contreras-Castillo, Eduardo M. da Gloria.
Journal: Applied Microbiology
Vol/Issue: 129 (3)
Ano: 2020
DOI: 10.1111/JAM.14660
TAGs: Óleos cítricos; Citrus sinensis; limoneno; diarréia; antimicrobiano; Escherichia
coli; Lactobacillus; in vitro; antibióticos; colibacilose entérica pós-desmame; microbiota
intestinal; infecção; infecção bacteriana; lise; intestino; morte celular; mirceno; limão;
veterinária; trans-carveol; carvona; mirceno; flora intestinal.
Sobre o artigo:
A infecção por Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC), também chamada de
colibacilose entérica pós-desmame, é a doença mais comum que afeta a saúde dos
suínos no início da vida.
No período de desmame, a microbiota intestinal não é desenvolvida, e as mudanças
repentinas na dieta e no ambiente são fatores-chave para tornar os leitões altamente
suscetíveis à infecção ETEC, o que leva a um estado de diarreia nesses animais.

2. Os principais fatores de virulência dos ETECs são as adesinas, que permitem que os
as bactérias adiram a receptores no epitélio do intestino delgado e as enterotoxinas
que elas produzem, que aumentam a secreção de fluidos e eletrólitos das células
epiteliais do intestino delgado.
Como resultado da infecção ETEC, os leitões frequentemente diminuem o ganho de
peso e podem sofrer uma morte súbita, o que produz perdas significativas para o setor
de criação de suínos.
Por isso, desde a década de 1950, a administração de antibióticos se tornou uma
prática normal. Porém, além de seu uso terapêutico, os antibióticos também têm sido
usados como agentes promotores de crescimento e, portanto, têm sido continuamente
adicionados à ração de suínos para melhorar o crescimento.
Hoje em dia, é bem conhecido que existe uma relação entre o crescente surgimento e
disseminação de bactérias resistentes a antibióticos com o uso excessivo de
antibióticos como agentes promotores de crescimento em animais de fazenda, que se
tornou uma ameaça à saúde pública.
Um estudo revelou que existe uma alta correlação entre o uso de vários antibióticos e a
prevalência de resistência a eles em bactérias comensais do intestino de animais de
fazenda. Posteriormente, outros estudos relataram evidências importantes de
transferência de resistência à antibióticos de animais de fazenda para humanos.
Verificou-se que os animais e os trabalhadores rurais, como os criadores de porcos,
habitualmente abrigam uma alta porcentagem de bactérias resistentes no intestino,
provavelmente, como consequência do contato direto com esses antibióticos.
Da mesma forma, o consumo de produtos alimentares de origem animal (fermentados,
minimamente processados ou alimentos crus) de animais de fazenda alimentados com
antibióticos pode representar outra forma direta ou indireta de transferência de
bactérias resistentes e seus genes para humanos, como cepas resistentes a E. coli.
Frente a esta ameaça e para manter a produtividade do setor de suinocultura devido à
proibição do uso de antibióticos como promotores de crescimento desde 2006 pelo

3. Regulamento da União Européia (UE, 2003), buscar alternativas para substituir ou
reduzir os o uso de antibióticos tornou-se uma necessidade real.
Nesse sentido, os óleos essenciais surgiram como alternativa promissora aos
antibióticos sintéticos por causa de suas propriedades antimicrobianas bem
conhecidas.
A aplicação de OEs cítricos, um dos tipos de OEs mais produzidos e comercializados,
poderia se tornar financeiramente viável devido à grande oferta desses óleos no
mercado global.
Por outro lado, os lactobacilos são habitantes normais e as bactérias mais abundantes
no intestino do porco, que desempenham um papel importante na saúde intestinal de
suínos, pois são capazes de combater a colonização de patógenos por meio de
exclusão competitiva, produção de compostos antibacterianos e regulando a imunidade
da mucosa intestinal, aumentando os níveis de anticorpos.
No entanto, quando antibióticos ou OEs são administrados a porcos, eles também
podem atingir essas bactérias intestinais benéficas e afetar seu crescimento e funções.
Contudo, tem sido relatado que os OEs cítricos apresentam uma atividade
antibacteriana seletiva, causando menores efeitos na cinética de crescimento de
Lactobacillus spp. do que ETECs.
Assim, é importante desvendar o mecanismo de ação antibacteriana dos OEs cítricos
sobre os lactobacilos, bem como sobre as ETECs, tendo em vista as informações
limitadas a respeito.
Nesse sentido, o presente estudo investigou o mecanismo de ação in vitro de um OE
cítrico comercial, terpenos de laranja brasileiras (TLB), em Escherichia coli
enterotoxigênica (EEC) isolada e em Lactobacillus rhamnosus de intestinos de suínos.
Resultados:
1. Mecanismo antibacteriano

4. 1.1. Redução da viabilidade celular após a exposição sequencial (SE) ao OE
O efeito da exposição sequencial ao TLB sobre a viabilidade celular bacteriana foi
avaliado in vitro a fim de simular a exposição periódica que as bactérias intestinais
sofreriam cada vez que os suínos fossem alimentados com dietas contendo o OE.
A comparação da exposição sequencial e da exposição única ao TLB em E. coli e L.
rhamnosus usando concentrações mínimas subinibitórias (sub-CIM) é mostrada na
Figura 1.
Figura 1: Efeito da exposição sequencial ao TLB em E. coli e L. rhamnosus com CIM / 4 (a, b) e
CIM / 2 (c, d) em contraste com uma única exposição. Exposição única a TLB (azul), exposição
sequencial a TLB (laranja), controle de exposição única (cinza) e controle de exposição
sequencial (amarelo).

5. Os resultados de exposição única mostraram apenas um efeito bacteriostático em E.
coli dentro de 6 horas de tratamento em CIM / 2 ou CIM / 4, e uma perda deste efeito
foi observada posteriormente (Fig. 1A e 1C).
Quando E. coli foi exposta sequencialmente a TLB, uma redução drástica de sua
viabilidade foi observada em contraste com uma única exposição. Na verdade, CIM / 4
e CIM / 2 diminuíram a população de E. coli em aproximadamente 2,9 log e 4,5 log,
respectivamente, no final do ensaio (9h).
Além disso, um efeito dependente da dose no ensaio de exposição sequencial foi
encontrado de forma que CIM/2 causou maior redução na viabilidade de E. coli do que
CIM/4 da segunda exposição. CIM/4 causou apenas uma redução de
aproximadamente 1,3 log após a segunda exposição (3-6 h).
Por outro lado, a CIM/2 já reduziu a população inicial de E. coli em aproximadamente
2,1 log após a segunda exposição (3-6 h) e em aproximadamente 3 log após a terceira
exposição (6-9 h).
Em relação à viabilidade de L. rhamnosus, a exposição sequencial ao TLB provocou
redução um pouco maior em relação à exposição única (fig. 1B e 1D).
No final do ensaio (9 h), CIM/4 e CIM/2 reduziram a população de L. rhamnosus em
aproximadamente 1,1 log e 1,7 log, respectivamente. Assim, o efeito de exposição
sequencial foi menor neste organismo do que em E. coli.
Conforme observado nas figuras 1B e 1D, também houve um efeito dependente da
dose na redução de viabilidade de L. rhamnosus, de uma forma que CIM / 2 causou
uma redução ligeiramente maior do que CIM / 4.
Por exemplo, após a segunda exposição, CIM/4 e CIM/2 reduziram aproximadamente
0,6 log da população inicial de L. rhamnosus e a população não diminuiu após
exposições subsequentes por CIM/4, mas CIM/2 causou uma redução adicional de
aproximadamente 0,8 log após a terceira exposição (6-9 h).

6. Portanto, a exposição sequencial ao TLB foi mais eficiente na redução da viabilidade
bacteriana em comparação a uma única exposição. Além disso, a exposição
sequencial teve um efeito maior em E. coli em comparação com L. rhamnosus.
Estes resultados sugerem que provavelmente a aplicação de sub-CIMs na alimentação
animal poderia ser adequada para diminuir bactérias patogênicas sem efeitos
perceptíveis nas bactérias benéficas no intestino de suínos.
1.2. Permeabilidade da membrana celular
A condutividade elétrica relativa foi avaliada para expressar as mudanças de
permeabilidade das membranas celulares de E. coli e L. rhamnosus como um efeito do
tratamento com TLB (Fig. 2).
Figura 2: Efeitos do TLB na permeabilidade da membrana celular de E. coli (a) e L. rhamnosus
(b): Controle (azul), CIM / 2 (vermelho), CIM (amarelo) e 2x CIM (verde).
Em primeiro lugar, foi observado um ligeiro aumento da condutividade elétrica relativa
no tratamento controle de ambas as bactérias, provavelmente, associado à lise normal
e morte das bactérias.
No geral, os resultados revelaram que a condutividade elétrica para E. coli foi maior em
comparação com L. rhamnosus.
Além disso, a condutividade elétrica aumentou ao longo do tempo de exposição ao óleo
TLB e houve um aumento dependente da dose significativa da condutividade elétrica

7. para E. coli. Assim, maior condutividade elétrica relativa foi encontrada na maior
concentração de TLB.
É digno de nota que quando E. coli foi exposta a CIM/2 e a CIM inteira após 6h,
nenhum aumento adicional da condutividade elétrica foi observado. No entanto, 2 ×
CIM aumentou a condutividade elétrica com o passar do tempo.
Em relação a L. rhamnosus, não houve efeito significativo na condutividade elétrica em
resposta às concentrações de TLB. No entanto, TLB aumentou a condutividade elétrica
em relação ao controle e, além disso, houve diminuição da condutividade elétrica até
6h de tratamento.
Este efeito provavelmente está relacionado à recuperação da viabilidade celular da
população de L. rhamnosus. Portanto, o óleo TLB afetou a permeabilidade da
membrana de ambas as bactérias, mas provocou maior efeito em E. coli do que em L.
rhamnosus nas concentrações testadas e com o aumento do tempo de tratamento.
Ou seja, o TLB foi capaz de produzir maior lise celular, seguido de maior vazamento de
componentes intracelulares, como eletrólitos (Na +, K +, Ca 2+ e outros) e,
consequentemente, maior morte de células de E. coli do que das células de L.
rhamnosus.
1.3. Integridade da membrana celular
A integridade da membrana celular em resposta ao tratamento com óleo TLB foi
determinada medindo a libertação de constituintes celulares, açúcares redutores e
proteínas, no sobrenadante de E. coli e L. rhamnosus.
45 mililitros de TLB em diferentes concentrações (CIM / 2, CIM, 2 × CIM) foram
adicionados às suspensões de células bacterianas, agitadas e incubadas a 35 °C por 6
h.
Os resultados revelaram que a liberação de açúcares redutores e proteínas
aumentaram significativamente com o aumento da concentração de TLB. No entanto, o

8. óleo causou uma liberação significativamente maior de açúcares redutores para E. coli
em comparação com L. rhamnosus.
Para E. coli, o TLB aumentou significativamente a liberação de açúcares redutores em
3.9, 2.4 e 1.6 vezes a 2 × CIM, CIM e CIM / 2, respectivamente. Para L. rhamnosus, o
TLB aumentou a liberação de açúcares redutores em 2.4 e 1.2 vezes a 2 × CIM e CIM,
respectivamente.
Em relação à liberação de proteínas, não foi observada diferença significativa entre E.
coli e L. rhamnosus. No entanto, em comparação com o controle, a liberação de
proteínas aumentou significativamente em 7.1, 3.2 e 1.8 vezes a 2 × CIM, CIM e CIM /
2 em E. coli, respectivamente.
Em relação a L. rhamnosus, o TLB aumentou a liberação de proteínas em 3.8, 2.0 e 1.2
vezes a 2 × CIM, CIM e CIM / 2, respectivamente. Portanto, esses resultados mostram
danos irreversíveis da membrana citoplasmática em resposta ao tratamento com óleo
TLB.
1.4. Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
E. coli e L. rhamnosus foram tratadas com TLB em CIM / 2, CIM e 2 × CIM por 3 h e 6
h, em seguida, alterações morfológicas e físicas foram observadas por MEV, como
mostra a figura 3.
As imagens ilustraram um maior efeito destrutivo do óleo TLB em E. coli em
comparação com as células de L. rhamnosus.
Em comparação com o controle, as células de E. coli tratadas com TLB, apresentaram
alterações morfológicas, como deformação, enrugamento e murchamento,
encolhimento, ondulação, fixação a outras células, quebra e colapso da membrana
(Fig. 3 do lado esquerdo), o que poderia ter causado o vazamento de constituintes
celulares e material genético.
Essas mudanças foram mais evidentes com o aumento das concentrações de BOT e
duração do tratamento.

9. Figura 3: Microfotografias eletrônicas de varredura de E. coli e L. rhamnosus não tratadas
(controle) e tratadas com diferentes concentrações de BOT (CIM / 2, CIM e 2 × CIM) durante 3
e 6 h.
Em relação a L. rhamnosus, nenhuma alteração morfológica notável foi observada em
comparação com o controle. No entanto, as células de L. rhamnosus estavam
ligeiramente e/ou completamente enrugadas, e, em alguns casos, as células foram
perfuradas, picadas e quebradas quando a concentração de TLB mais alta (2 × CIM) foi
utilizada.
Portanto, observações de MEV mostraram que o TLB pode causar efeitos mais graves
perceptíveis no envelope celular (parede celular e membrana citoplasmática) de E. coli
em comparação com L. rhamnosus.
1.5. Composição química do TLB

10. Os resultados mostraram que limoneno (79%) foi o principal composto presente no
óleo, seguido por compostos menores, como óxido de cis-limoneno, óxido de limoneno
trans, carveol trans, carvona, trans- p-menta-2,8-dien-1-ol, mirceno, cis-p-menta-2,8
dien-1-ol e cis-carveol, entre outros.
Na prática:
Esse estudo fornece informações sobre o mecanismo de ação antibacteriano exibido
por um OE cítrico, como uma alternativa natural a efeitos pré-bióticos utilizados no
setor de produção de suínos para combater patógenos intestinais.
Além disso, a utilização do OE para este fim não apresenta efeitos tóxicos em curtos,
médios e longos prazos, conforme o ensaio de viabilidade celular, e como medida
preventiva de doenças decorrente do desequilíbrio da flora intestinal, diminuindo
inflamações intestinais e sistêmicas.
Portanto, o OE cítrico pode ser adicionado à dieta a fim de evitar e tratar infecções
bacterianas e preservar as bactérias benéficas responsáveis pela regulação do
intestino.
O caso desse artigo foi em suínos, extrapolando e confirmando o que já se conhece no
uso tradicional de cítricos por humanos. Portanto, pode ser uma boa indicação nos
protocolos para casos de infecção por Escherichia coli, disbioses, inflamações, alergias
e desequilíbrios da flora intestinal.