Este estudo investigou os efeitos do timol, um componente do óleo essencial de tomilho, na inibição da formação e manutenção de biofilmes da bactéria Gardnerella vaginalis. Os resultados mostraram que o timol inibiu significativamente a formação de biofilmes em concentrações de 1 a 1/8 da concentração inibitória mínima e reduziu biofilmes maduros em concentrações de 1 a 1/4 da concentração inibitória mínima. Microscopia confirmou que maiores concentrações de

1. [Gardnerella vaginalis 003]
Óleo essencial: Sigma, Chemical CO, St Louis, MO, USA
Composto: Timol
Título: Inhibitory activity of thymol on native and mature Gardnerella vaginalis biofilms: in vitro
study
“Atividade inibidora do timol em biofilmes nativos e maduros de Gardnerella vaginalis: estudo in
vitro”
Autor: Pier Carlo Braga, Monica Dal Sasso, Maria Culici, Alessandra Spallino
Journal: Arzneimittelforschung
Vol (Issue): 60 (11)
Ano: 2010
DOI: 10.1055/s-0031-1296346
TAGs: Vagina; trato urogenital; colo do útero; uretra; períneo; microbiota; menstruação;
componentes urinários; hormônios; relações sexuais; espermatozoides; diafragmas; doenças
bacterianas; fúngicas; parto prematuro; doenças inflamatórias pélvicas; doenças pós-aborto;
vaginose bacteriana; Gardnerella vaginalis; biofilme; biofilme vaginal aderente; fluidos luminais;
agentes antimicrobianos; óleo de tomilho; timol; células vaginais; ginecologia natural; saúde da
mulher; in vitro.
Sobre o artigo:
A vagina humana faz parte do trato urogenital, que consiste na vagina, colo do útero, uretra e
períneo. Sua microbiota flutua porque é influenciada pela menstruação, componentes urinários,
hormônios, relações sexuais, espermatozoides, diafragmas e outros dispositivos intrauterinos,
além de outros fatores.
A interrupção da microbiota vaginal natural leva a uma série de resultados adversos à saúde,
incluindo doenças bacterianas, fúngicas, virais e sexualmente transmissíveis, risco aumentado
de parto prematuro, doenças inflamatórias pélvicas e doenças pós-aborto.
A vaginose bacteriana (VB) é o diagnóstico mais frequente feito em mulheres com sintomas do
trato genital inferior e mesmo que vários tipos de bactérias tenham sido encontrados
(Atopobium vaginae, Prevotella spp., Leptotrichia amnionite, Mobiluncus spp. e Mycoplasma

2. hominis), a Gardnerella vaginalis foi isolada em até 95% dos casos e é o microrganismo mais
típico e amplamente estudado na VB.
Evidências recentes sugerem que as bactérias envolvidas em até 65% das infecções adotam
um biofilme, ao invés do modo planctônico de crescimento. Biofilme vaginal aderente é definido
como uma comunidade estruturada de bactérias intimamente ligadas umas às outras e à
superfície epitelial vaginal e, assim como grupos bacterianos específicos, as bactérias atingem
concentrações muito mais altas do que nos fluidos luminais.
Biofilmes foram recentemente observados em 90% dos indivíduos com VB e apenas 10% dos
indivíduos sem, com Gardnerella vaginalis sendo a espécie predominante. Embora uma ampla
gama de agentes antimicrobianos esteja disponível atualmente, as opções de tratamento para
controlar a VB ainda são limitadas, além disso, o número de recidivas está aumentando e
requer tratamentos alternativos.
O recente interesse crescente no estudo de materiais vegetais como fonte de novas
substâncias antimicrobianas levou a descobertas que mostram uma série de óleos essenciais e
seus componentes podendo ser usados para tratar infecções.
Nesse contexto, o óleo obtido de plantas do gênero Thymus, que pertence à família das
Labiatae (ou Lamiaceae), foi creditado com uma ampla gama de propriedades farmacológicas,
incluindo efeitos antimicrobianos.
O óleo de tomilho contém o componente timol como principal, conhecido por ter efeitos
antimicrobianos consideráveis sobre vários microrganismos, já demonstrado que é eficaz
contra a adesão de Gardnerella vaginalis, Escherichia coli e Staphylococcus aureus às células
vaginais humanas.
Portanto, o objetivo deste estudo foi investigar se o timol também pode interferir com biofilmes
recém-formados e maduros da bactéria anaeróbia Gardnerella vaginalis.
Os efeitos de diferentes concentrações de timol foram testados em uma cepa de Gardnerella
vaginalis e em duas outras cepas de G. vaginalis isoladas de VB humana.
Quantidades apropriadas de timol foram diluídas em etanol (concentração final 0,4%) e
adicionadas ao meio de cultura esterilizado para determinar sua concentração mínima inibitória
(MIC). Após incubação por 24h, a CIM foi registrada como a concentração mais baixa de timol
que inibiu completamente o crescimento visível do organismo.
Os biofilmes de G. vaginalis foram formados em placas de microtítulo adicionando várias
concentrações duplamente diluídas em série de timol variando de 1 a 1/16 CIM, a fim de
investigar a presença de atividade inibitória nas etapas iniciais da formação de biofilme.

3. A formação de biofilme de G. vaginalis na presença ou ausência de várias concentrações de
timol foi quantificada espectrofotometricamente, além disso, a densidade óptica foi expressa
como porcentagens em comparação com o grupo de tratamento controle, sem timol. E, por fim,
os efeitos do timol também foram inspecionados visualmente por meio de microscopia de
contraste de interferência Nomarski.
Resultados:
Os valores da concentração inibitória mínima (CIM) para o timol foram 125 µg/mL para a cepa
bacteriana e 175 µg/mL para os dois isolados clínicos – obtidos de infecções humanas.
Portanto, com a média de 158 µg/mL na concentração inibitória mínima, os autores perceberam
que os valores são da mesma ordem de magnitude daqueles encontrados por outros autores,
que variaram de 100 µg/mL a 250 µg/mL.
O gráfico 1 (figura abaixo) resume os efeitos do timol na formação do biofilme de G. vaginalis,
onde a concentração inibitória inicial (1 CIM) induziu a maior inibição e os valores retornaram
gradualmente à linha de base conforme foi se subdividindo até 1/16 da CIM.
Com isso, podemos dizer que a inibição estatisticamente mais significativa da formação de
biofilme foi observada de 1 MIC a 1/8 CIM (32% a 11%), e esses achados foram confirmados
visualmente por meio de microscopia de contraste de interferência de Nomanski.
Explicando o gráfico 1: Este gráfico mostra o efeito do timol na formação de biofilme de G. vaginalis
determinado por medições de densidade óptica em espectrofotômetro.Podemos observar que os
pesquisadores utilizaram a concentração inibitória mínima necessária para erradicar 50% da formação
de biofilme da bactéria e subdividiram a dosagem para encontrar a inibição estatisticamente mais
relevante. Portanto, enquanto a CIM (ou MIC, em inglês) induziu a maior inibição os outros valores foram
diminuindo gradualmente à linha de base (1/6 CIM). Com isso, podemos presumir que a inibição

4. estatisticamente significativa na inibição do biofilme foi observada de 1 MIC a 1/8 MIC, com redução
percentual de 32% a 11%.
A Figura 1 mostra um exemplo da atividade do timol em diferentes concentrações visualizadas
por meio da microscopia de contraste de interferência de Nomarski. Esses efeitos
morfoestruturais (mudanças na morfologia e estrutura dos biofilmes) foram acompanhados por
observações de microscopia de fluorescência da viabilidade bacteriana, que também
mostraram uma relação clara dependente da dose empregada (Fig. 2).
A figura 1 (à esquerda) são micrografias obtidas a partir da microscopia de Nomarski, das
quais, a imagem (A) corresponde à formação do biofilme anterior à incorporação do timol; e as
imagens de (B) até (F) corresponde à resposta dos biofilmes às várias concentrações inibitórias
mínimas subdividas em 1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, respectivamente. Podemos observar, assim como
no gráfico 1, que a maior concentração foi responsável pela maior inibição (no caso, a imagem
B, a qual tem o CIM maior, demonstra as menores formações de biofilme).
A figura 2 (à direita) são micrografias obtidas a partir da microscopia de fluorescência da
viabilidade bacteriana de G. vaginalis; sendo a imagem (A) correspondente ao biofilme antes
da incubação do timol; e as imagens de (B) à (F) são as respostas dos biofilmes às
concentrações de timol após incubação (1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, respectivamente).
O gráfico 2 resume os efeitos do timol no biofilme de G. vaginalis maduro. Nessa situação, o
efeito do timol foi significativo de 1 a 1/4 MIC, e a redução percentual variou de 26% a 13%.

5. Explicando o gráfico 2: Este gráfico mostra o efeito do timol no biofilme maduro de G. vaginalis
determinado por medições de densidade óptica em espectrofotômetro. Nesta situação, o efeito do timol
foi significativo de 1 a 1/4 CIM (MIC, em inglês), e a redução percentual variou de 26% a 13%.
Os efeitos do timol foram novamente visualizados por microscopia de contraste de interferência
de Nomarski (Fig. 3) e microscopia de fluorescência (Fig. 4), avaliando a capacidade das
concentrações inibitórias mínimas em biofilmes maduros.

6. A figura 3 (à esquerda) são micrografias obtidas a partir da microscopia de Nomarski, das
quais, a imagem (A) corresponde ao biofilme maduro anterior à incorporação do timol; e as
imagens de (B) até (F) corresponde à resposta dos biofilmes às várias concentrações inibitórias
mínimas subdividas em 1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, respectivamente. Podemos observar, assim como
no gráfico 2, que a maior concentração foi responsável pela maior inibição (no caso, a imagem
B, a qual tem o CIM maior, demonstra as maiores inibições dos biofilme maduros).
A figura 4 (à direita) são micrografias obtidas a partir da microscopia de fluorescência da
viabilidade do biofilme maduro de G. vaginalis; sendo a imagem (A) correspondente ao biofilme
antes da incubação do timol; e as imagens de (B) à (F) são as respostas dos biofilmes às
concentrações de timol após incubação (1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, respectivamente).
Na Prática:
Neste estudo os pesquisadores indicam o timol como um agente antimicrobiano responsável
por inibir a formação de biofilme da bactéria G. vaginalis, assim como a inibição do biofilme
maduro. Como os biofilmes são fenômenos multifatoriais, os múltiplos mecanismos do timol
podem atuar em diferentes etapas da gênese e evolução do biofilme. Não é ótimo?