O documento descreve os princípios e aplicações do teste imunológico ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), incluindo seus tipos (indireto, sanduíche, competição e de captura), etapas, interpretação dos resultados e usos em medicina humana e veterinária para detecção de antígenos e anticorpos.
1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS
DEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃO
DISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045
http://www.elisa-development.com/
Trabalho realizado pela Acadêmica de Medicina Veterinária da UFBA Ludmilla
Soares Sena sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer, Claudia
Brodskin e Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.
3. • Teste utilizado para detectar a presença de antígenos (Ag) ou
anticorpos (Ac) específicos em fluidos corporais ou sobrenadantes de
cultura.
• Une a especificidade de uma ligação Ag-Ac com a sensibilidade de
uma reação enzimática, permitindo assim a detecção de quantidades
mínimas de uma substância em particular e com grande
confiabilidade.
• Uma enzima, covalentemente ligada a um Ag ou Ac, reage com um
substrato, dessa forma levando a oxidação de um cromógeno incolor,
o qual então desenvolverá coloração dependente da concentração de
Ag/Ac pesquisados.
4. • Utiliza-se uma base sólida (placa de poliestireno com 96 poços
dispostos em 12 fileiras verticais, cada uma com 8 poços) na qual
Ag/Ac irão se ligar através de interações hidrofóbicas.
• É um método tanto qualitativo quanto quantitativo.
5. o Elementos necessários para a realização:
• Ag purificado (caso deseje-se detectar ou quantificar Ac)
• Ac purificado (caso deseje-se detectar ou quantificar Ag)
• Controles (Positivo, Negativo, Ponto de Corte) – nos ensaios qualitativos
• Padrões (soluções com concentração conhecida do analito a ser dosado) – nos ensaios
quantitativos
• Amostras a serem testadas
• Placa de poliestireno
• Tampão de lavagem: utilizado para remover o Ag ou Ac livres na placa, Ag ou Ac
ligados com pouca avidez e outras moléculas interferentes
• Conjugado: Ac ou Ag ligados covalentemente a uma enzima
• Cromógeno: substância incolor que, ao ser oxidada pela reação enzimática, produz cor
• Leitora de ELISA (espectrofotômetro): converte as diferentes intensidade de cor
resultantes ao final do ensaio em valores numéricos (valores de densidade óptica - DO)
6. o Elementos necessários para a realização:
http://www.dellta.com.br/detalhes.php?prod_id=89
http://portuguese.alibaba.com/product-gs/elisa-plate-flatbottom-271555304.html
Placas de ELISA
http://www.laborlifescience.com.br/equipamentos_elisa.html
Leitoras de ELISA
http://www.analiticaweb.com.br/images/produtos/p4ae04e96c
bc7f/placa_elisa.jpg
7. o Vantagens
• Teste com alta sensibilidade (habilidade de detectar quantidades
mínimas do Ag ou Ac pesquisados (O ELISA detecta moléculas na ordem
de nanogramas) – menor risco de falsos-negativos.
• Teste com alta especificidade (característica que indica que o teste em
questão identificará somente o Ag ou Ac desejado) – menor risco de
falsos-positivos.
• Permite que várias amostras sejam testadas ao mesmo tempo.
• Realização relativamente rápida, simples e de custo baixo a médio em
comparação com outras técnicas de imunodiagnóstico.
8. oDesvantagens
• Necessidade de mão de obra especializada.
• Alguns reagentes podem degradar-se com facilidade, com exposição à
luz do sol ou a elevadas temperaturas.
• Por ser uma técnica altamente sensível e específica, é muito susceptível
a erros de pipetagem, variações nos tempos de incubação e lavagens, e
alterações nos reagentes.
10. • INDIRETO: detecta principalmente Ac
•SANDUÍCHE: detecta principalmente Ag
• COMPETIÇÃO: detecta Ag com baixo peso molecular
(monovalentes)
• CAPTURA: detecção de Acs (principalmente
IgM, evitando a ação do fator reumatóide)
11. Y
Y
Y
Y
Antígeno
Y
Conjugado
Anticorpo
Cromógeno
1) Inicialmente, o Ag é
adicionado à placa e se adere à
superfície dos poços
2) Em seguida, são realizadas
lavagens para a retirada do Ag
livre nos poços
3) A solução a ser pesquisada é
adicionada. Caso contenha Acs
específicos contra os Ags
presentes na placa, estes se
ligarão aos Ags
4) Uma nova série de lavagens
é realizada para retirar os Acs
que não se ligaram aos Ags
5) É então adicionado o
conjugado, que se liga aos Acs
6) Uma nova lavagem retira o
conjugado livre
7) O cromógeno e o substrato
são adicionados, e se o
cromógeno for oxidado pela
ação da reação
enzimática, haverá
desenvolvimento de cor
12. o Interpretação
dos resultados:
• A intensidade da cor é diretamente proporcional à concentração de Ac da
amostra pesquisada.
• Para determinar quais indivíduos são
positivos ou negativos para a doença
pesquisada, deve-se calcular um ponto
de corte (“cut-off”) para aquele ensaio.
Acima dos limites do cut-off, encontram-
Contr. Negativo →
Cut-off →
Contr. Positivo →
se os indivíduos positivos e abaixo os
negativos.
http://www.labimuno.org.br/ensino.cfm?load=aulas
• O ELISA Indireto não determina se o indivíduo ESTÁ ou não doente naquele
momento. Ele apenas afirma se aquele animal/paciente já teve ou não contato
com o agente causador da enfermidade em algum momento de sua vida.
13. o Aplicações na
medicina humana e veterinária:
• Diagnóstico sorológico de doenças infecto-contagiosas, onde a detecção de Ac
IgG, IgA ou IgE seja significativa.
• Exemplos na Medicina Humana: diagnóstico sorológico da Doença de Chagas
e da SIDA/AIDS.
• Exemplos na Medicina Veterinária: diagnóstico da Linfadenite Caseosa e da
Leishmaniose.
• OBS: Não deve-se detectar IgM por esta técnica devido à ação do fator
reumatóide. O fator reumatóide é um auto-anticorpo geralmente da classe
IgM, específico para IgG. Este fator encontra-se elevado em algumas
situações, particularmente nas doenças reumáticas. Tal anticorpo pode se ligar na
IgG específica (contra o antígeno teste), presente no soro do paciente, gerando
assim um resultado falso positivo caso se use um conjugado anti-IgM, como no
ELISA indireto. Para mensuração de IgM, deve-se utilizar o ELISA de captura.
14. Y
Y
Y
Y
Antígeno
Y
Conjugado anti-IgM
Ac IgM específico pesquisado
Y
Y
Ac IgG
Cromógeno
Fator
Reumatóide
1) O Ag específico é adicionado á
placa, e em seguida, são realizadas
lavagens para a retirada do
excesso não ligado
2) Adiciona-se a amostra do
paciente, que contém o Ac IgM
pesquisado e o Fator Reumatóide.
O Fator Reumatóide pode estar
ligado a Acs IgG específicos para o
Ag presente na placa, formando
imunocomplexos que se ligam a
este Ag
3) Adiciona-se o conjugado antiIgM
4) Adiciona-se o cromógeno e o
substrato, desenvolvendo-se cor.
Devido ao Fator Reumatóide unido
à IgG específica, tem-se um
resultado superestimado da
quantidade de IgM
pesquisada, podendo levar até a
resultados falsos-positivos
15. 1) Um Ac conhecido é
adicionado à placa e se liga à
sua superfície
Y
Antígeno
Y
Conjugado
Anticorpo
Cromógeno
2) Lavagens são feitas para
retirar os Ac livres
3) Adiciona-se a solução com
o Ag a ser pesquisado e este,
caso presente, se liga aos Ac
nos poços
4) Realiza-se lavagens para
retirar o Ag não capturado
5) Adiciona-se conjugado
específico para o Ag procurado
6) Novas lavagens retiram o
conjugado livre
7) O cromógeno e o substrato
são adicionados, e se o
cromógeno for oxidado pela
ação da reação enzimática,
haverá desenvolvimento de cor
16. o Interpretação
dos resultados:
• A intensidade da cor é diretamente
proporcional à concentração de Ag da
Curva Padrão (exemplo)
amostra pesquisada.
necessária a construção de uma curva
com os valores de densidade ótica
obtidos a partir da reação de padrões
com concentrações conhecidas do
Absorvância (450/620)
• Para este teste se tornar quantitativo, é
antígeno a ser dosado. A curva serve
como padrão de comparação para
deduzir as quantidades de antígenos nas
soluções-teste.
Concentração de IgE
http://www.shibayagi.co.jp/Prod-E/prod_akrie-211.htm
17. o Aplicações na
medicina humana e veterinária:
• Muito usado para a dosagem de hormônios, marcadores tumorais e outras
proteínas séricas, bem como para a detecção de antígenos virais e de outros
patógenos nas fezes, na urina e em secreções. Pode detectar 10-12 a 10-14g.
• Exemplos na Medicina Humana: Teste de Gravidez (teste de detecção da
gonadotropina coriônica humana (HCG) no soro).
• Exemplos na Medicina Veterinária: Triagem na indústria de alimentos
(pesquisa de patógenos e contaminantes nos alimentos).
18. Y
Antígeno
Y
Conjugado
Anticorpo
Cromógeno
1) Adição do Ac específico aos
poços da placa
2) Lavagem para retirar os Ac
livres
3) Adição da solução com o Ag
a ser pesquisado e de uma
outra solução contendo Ag
marcado (conjugado) no
mesmo poço. Os Ags
competem entre si pelo sítio
de ligação do Ac e aquele que
estiver em maior
concentração, se ligará a mais
Ac
4) Lavagem para retirar os Ag
não capturados
5) Adiciona-se o cromógeno e
o substrato. Caso o conjugado
tenha se ligado aos Ac da
placa, ocorrerá reação
enzimática e o cromógeno
será oxidado, havendo
desenvolvimento de cor
19. o Interpretação
dos resultados:
• A intensidade da cor é INVERSAMENTE proporcional à concentração de ag da
amostra pesquisada, ou seja, quanto maior a quantidade de Ag-teste, menor a
possibilidade de ligação do Ag marcado e assim, menor a intensidade de cor
emitida.
20. o Aplicações na
Medicina Humana e Veterinária:
• Dosagem de hormônios, marcadores tumorais e outras proteínas séricas.
Diagnóstico sorológico de algumas doenças.
• Exemplo na Medicina Humana: dosagem de T3, T4, testosterona,
estradiol, progesterona.
• Exemplo na Medicina Veterinária: detecção sorológica de Herpesvírus
Bovino tipo I.
21. Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Antígeno
Y
Anticorpo IgG
Y
Anticorpo IgM
Conjugado
Cromógeno
1) Adição de Ac IgG
monoclonal contra IgM aos
poços da placa
2) Lavagem para retirar os Ac
livres
3) Adição da solução com Ac
IgM específico a ser
pesquisado
4) Lavagem para retirar o Ac
não capturado
5) Adiciona-se Ag específico
marcado com uma enzima
(conjugado) para o Ac
pesquisado
6) Lavagem
7) Adição de cromógeno e de
substrato. Se o cromógeno for
oxidado pela ação da reação
enzimática, haverá
desenvolvimento de cor
22. o Interpretação dos resultados
• Intensidade da cor diretamente proporcional à concentração de Acs.
• Por ser um ELISA muito utilizado para a detecção de IgM, é capaz de
identificar infecções na fase aguda.
23. o Aplicações na Medicina Humana e Veterinária
• Principalmente usado para a detecção de anticorpos da classe IgM contra os
mais diversos antígenos (virais, bacterianos, de protozoários) em todas as
doenças em que seja importante identificar o seu recente aparecimento.
Apesar de ser mais utilizado para a detecção de IgM, o ELISA de Captura
também pode ser utilizado para a dosagem de outros Acs.
• Exemplos na Medicina Humana: diagnóstico de rubéola, toxoplasmose,
herpesvírus e citomegalia, em suas fases agudas, da gestante (complexo
TORCH).
• Exemplo na Medicina Veterinária: diagnóstico da Diarréia Bovina Viral
(DVB).