Ap12 Imunoquimioluminescência

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Aula prática: Imunoquimioluminescência

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Ap12 Imunoquimioluminescência

  1. 1. Trabalho realizado pelos acadêmicos de Medicina da UFBA Adriana Campos, Nivaldo Cardozo Filho, Sabrina Oliveira e Silvana Asfora, sob orientação dos Professores Roberto Meyer, Ivana Nascimento, Robert Schaer, Cláudia Brodskyn, Songelí Freire e Denise Lemaire, do Laboratório de Imunologia do Instituto de Ciências da Saúde da UFBA. Atualizado em setembro de 2003 Aula 12 Nesta aula serão abordados a imunoquimioluminescência , a imunofluorometria , além de um resumo dos principais aspectos do radioimunoensaio .
  2. 2. Imunoquimioluminescência
  3. 3. -Exames feitos por quimioluminescência são basicamente automatizados. -Quantificam Ag ou Ac presentes no soro. São muito usados para a dosagem de hormônios, marcadores tumorais e diversas outras proteínas séricas. -Vários soros podem ser testados e diferentes moléculas po- dem ser quantificadas de uma só vez. -A técnica se baseia na ligação Ag – Ac. Como no ELISA, um dos dois reagentes é conjugado com uma substância que quan- do ativada, emite luz visível. Então, a luz emitida é proporcio- nal à concentração do reagente pesquisado. -Os tipos mais utilizados são: competição e sanduíche.
  4. 4. Fase sólida em que uma microesfera de poliestireno é revestida com Ac monoclonal contra o Ag específico Adição de soro do paciente O conjunto é incubado com agitação intermitente Quimioluminescência (como exemplo, um tipo sanduíche)
  5. 5. Lavagem para retirada de Ag não fixado: Adição de Ac monoclonal, anti-Ag pesquisado, conjugado à enzima . Lavagem para retirada de Ac conjugado à enzima, não fixado O conjunto é incubado
  6. 6. Adição de substrato da enzima O substrato quimioluminescente sofre hidrólise na presença da enzima, produzindo substâncias instáveis que culminam com emissão de luz Incubação O exemplo acima é o que acontece com o substrato luminescente AMPPD. Alternativamente a substância luminescente pode ser desestabilizada por uma súbita mudança do pH e da concentração do meio (éster de acridina) ou ainda um elemento, como por exemplo o rutênio, dissociado do Ag ou do Ac por uma descarga elétrica no final da reação, culminando com a emis- são de luz. A imunoluminescência pode atingir uma sensibilidade de 10 -15 a 10 -16 g.
  7. 7. Os imunoensaios de quimioluminescência são realizados em aparelhos automatizados, onde todo o processo é guiado por computadores. São apresentados abaixo quatro desses equipa- mentos, usados no Laboratório de Imunologia do ICS-UFBA: “ Elecsys 1010”da “Roche” “ Access”, da “Sanofi-Winthrop” “ Immulite”, da “DPC” “ACS 180”, da “Ciba-Corning”
  8. 8. Imunofluorimetria
  9. 9. -Este método é muito utilizado para dosagens de proteínas séricas, hormônios, marcadores tumorais, anticorpos específicos para alérgenos etc. -O teste é basicamente automatizado. -O resultado baseia-se na fluorescência emitida, mensurada pelo fluorômetro. -A fluorescência emitida é intensa, porém pouco duradoura. -Utiliza-se Ac ou Ag conjugado com um fluorocromo. - Fluorocromos como fluoresceína e rodamina podem ser utilizados, entretanto lantanídeos como o európio são os mais usados. -Os tipos mais utilizados são: competição e sanduíche. - Pode detectar 10 -12 a 10 -16 g.
  10. 10. + Fase Sólida contendo Ac monoclonal contra Ag + Padrão, controle e amostra Ac monoclonal marcado com Eu, contra um outro epítopo do Ag Incubação + Solução de amplificação: dissocia os ions európio do Ac marcado na solução, e com eles forma estruturas fluorescentes + Os ensaios do tipo apresentado a seguir, se baseiam na poten- cialização da emissão de luz vi- sível, a partir da dissociação de lantanídeos. Ag - Eu - Eu - Eu Eu Fluorimetria exemplo: sanduíche, usando o európio
  11. 11. Como referido anteriormente, as técnicas imunofluorimétricas são realizadas quase sempre em equipamentos automatizados. A seguir é apresentado o fluorômetro pertencente ao Laboratório de Imunologia do ICS – UFBA. Sistema automático de imunoensaios, por fluorimetria, marca “ Wallac”, modelo “Autodelfia”.
  12. 12. Um resumo sobre radioimunoensaio
  13. 13. Uma outra técnica para imunodosagem e imunodiagnóstico é o radioimunoensaio (RIA). Esta técnica foi a primeira a ser desen- volvida para dosagem de hormônios e outras substâncias pre- sentes em pequenas concentrações em fluidos biológicos e tem como base a ligação Ag – Ac. Apesar de ainda usada, está sendo substituída pela imuno- fluorimetria, ELISA e imunoluminescência, tendo em vista que envolve material radioativo. O princípio e as modalidades são os mesmos dos outros ensaios acima mencionados – a diferença está na substância indicadora de reação, que neste caso é um isótopo radioativo e em geral se utiliza o 125 I. Trata-se de um ensaio de grande reprodutibilidade, especificida- de e sensibilidade (em torno de 10 -12 g), entretanto, tem como desvatagens a manipulação de isótopo radioativo ( 125 I é emis- sor de radiação gama), a validade curta do referido reagente ra- dioativo (o 125 I tem meia vida de 58 dias) e a demora da execu- ção do teste, já que a leitura final de cada amostra deve levar 1 minuto (“counts per minute”).

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