ELISA
Guia de Aula Prática
Rita Maia
Fundamentos da Técnica
• Definição:
Método que combina a especificidade de um
anticorpo com a sensibilidade de um ensaio
s...
Fundamentos da Técnica
• Componentes:
Anticorpo ou Ag ligado
Enzima ativa
Substrato
Produtos solúveis (cor)
Antigen
Se...
Fundamentos da Técnica
Enzima Substrato Cor
Fosfatase alcalina P-nitrofenil-fosfato (pNPP) Amarelo
Peroxidase ABTS Verde
P...
Tipos de ELISA
1. Direto
Tipos de ELISA
2. Indireto 3. Sanduíche
Tipos de ELISA
5. Multiplex4. Competitivo
Uso Diagnóstico
• Identificar se o animal está com a doença:
 Presença do patógeno - Ag
 Título do mesmo
• Determinar se...
Muito utilizado: Titulação
O Que é?
Titulação é um método para testar a diluição serial de uma amostra (ex. soro)
Como fun...
Como interpretar?
A maior diluição em que o anticorpo ainda consegue ser detectado é o Título de
Anticorpo
Como diferencia...
Método direto: sem título
• Utiliza-se a amostra sem diluições
• Adiciona-se os reagentes
• Faz-se a leitura
Para coletar a amostra:
-Ajusta o colume desejado
-Pressiona até atingir a primeira parada
-Libera lentamente até voltar t...
Resumo da Prática em Grupo
1. Definir grupos;
2. Ir ao laboratório de Viroses;
3. Adicionar o anticorpo primário;
4. Adici...
Prática
Protocolo da Prática
Controle (+)
Controle (-)
Cut off (CO)
Amostra
Incube por 30 minutos
37o C
Transfira 100uL
de cada co...
Protocolo da
Prática
Cubra a placa
e incube mais
30 minutos
37oC
Adiciona 100uL
Conjugado HRP
anti-IgG-humano
em cada poço...
Adicione 100uL
Stop Solution
em cada poço
Formará uma
coloração AZUL
Incube 10 min
em T.A.
Adicione 100uL
TMB em cada
poço...
Layout
•Utilize primeiro a placa re-utilizável para fazer a mistura inicial das amostras
•Só transfira para a placa de rea...
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  • Competitivo: inversamente proporcional à quantidade de sinal: quanto mais produto, menos sinal. Amostra é incubada com Ac coated na placa, depois é adicionado um Ag-labeled conhecido que vai seligar ao Ac da placa onde nao houver a amostra ligada, depois da reação, quanto mais sinal (do Ag-labeled) menos amostra esta ligada ali, e vice-versa. Quantifica por competição.
    Multiplex: vários Acs diferentes e pode usar qualquer uma das técnicas anteriores: direto, indireto, sanduiche, competitivo.
  • Método Elisa

    1. 1. ELISA Guia de Aula Prática Rita Maia
    2. 2. Fundamentos da Técnica • Definição: Método que combina a especificidade de um anticorpo com a sensibilidade de um ensaio simples enzimático. • Princípio: Reação Antígeno-Anticorpo
    3. 3. Fundamentos da Técnica • Componentes: Anticorpo ou Ag ligado Enzima ativa Substrato Produtos solúveis (cor) Antigen Serum Ab 2 Enzyme-linked Ab
    4. 4. Fundamentos da Técnica Enzima Substrato Cor Fosfatase alcalina P-nitrofenil-fosfato (pNPP) Amarelo Peroxidase ABTS Verde Peroxidase OPD Laranja Peroxidase TMB Azul Comuns: enzimas que convertem um substrato sem cor num produto de cor
    5. 5. Tipos de ELISA 1. Direto
    6. 6. Tipos de ELISA 2. Indireto 3. Sanduíche
    7. 7. Tipos de ELISA 5. Multiplex4. Competitivo
    8. 8. Uso Diagnóstico • Identificar se o animal está com a doença:  Presença do patógeno - Ag  Título do mesmo • Determinar se o animal tem Ac:  Teve a doença (IgM, IgG ou IgA)  Se está protegido:  Título de anticorpos (vacina ou exposição)
    9. 9. Muito utilizado: Titulação O Que é? Titulação é um método para testar a diluição serial de uma amostra (ex. soro) Como funciona? Determina a quantidade relativa de Ac na diluição serial de uma amostra Quais testes sorológicos podem utilizar titulação ? Immunofluorescência Aglutinação Fixação do Complemento Soro Neutralização Inibição da Hemaglutinação
    10. 10. Como interpretar? A maior diluição em que o anticorpo ainda consegue ser detectado é o Título de Anticorpo Como diferenciar doença de saúde ? Incubação Aguda Convalescente Time post-infection (weeks) Título Específico de Anticorpos Controle negativo: soro antes da exposição Reação positiva: duas vezes a absorbância do controle negativo 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64
    11. 11. Método direto: sem título • Utiliza-se a amostra sem diluições • Adiciona-se os reagentes • Faz-se a leitura
    12. 12. Para coletar a amostra: -Ajusta o colume desejado -Pressiona até atingir a primeira parada -Libera lentamente até voltar totalmente à posição inicial Para liberar a amostra: -Pressiona até passar da primeira parada e sentir a segunda parada Método: A Arte de Pipetar
    13. 13. Resumo da Prática em Grupo 1. Definir grupos; 2. Ir ao laboratório de Viroses; 3. Adicionar o anticorpo primário; 4. Adicionar anticorpo secundário; 5. Fazer leitura no leitor.
    14. 14. Prática
    15. 15. Protocolo da Prática Controle (+) Controle (-) Cut off (CO) Amostra Incube por 30 minutos 37o C Transfira 100uL de cada controle CO e amostra para cada poço Misture bem Adicione 10uL de cada amostra em seu tubo respectivo Adicione 1.000uL do diluente (serum diluent) em cada tubo Marque tubos de diluição Determine os poços da sua equipe Lembrem-se de Trocar as ponteiras Lembrem-se de Trocar as ponteiras
    16. 16. Protocolo da Prática Cubra a placa e incube mais 30 minutos 37oC Adiciona 100uL Conjugado HRP anti-IgG-humano em cada poço Lave 6 vezes com Wash Buffer Após incubação Lavagem: coloca o líquido com a Piceta e remove invertendo a placa de uma só vez. Na última vez, inverta a placa e bata con firmeza sobre papel para remover excesso de liquidos
    17. 17. Adicione 100uL Stop Solution em cada poço Formará uma coloração AZUL Incube 10 min em T.A. Adicione 100uL TMB em cada poço Lave 6 vezes com Wash Buffer Protocolo da Prática Lavagem: coloca o líquido com a Piceta e remova invertendo a placa de uma só vez. Na última vez, inverta a placa e bata con firmeza sobre papel para remover excesso de liquidos
    18. 18. Layout •Utilize primeiro a placa re-utilizável para fazer a mistura inicial das amostras •Só transfira para a placa de reação final quando for incubar •Cada grupo utilizará uma fileira da placa com 8 poços 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H

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