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 PIPETAS AUTOMÁTICAS
 LEITOR DE ELISA
 LAVADOR AUTOMÁTICO DE PLACAS
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CUIDADOS:
 Data de validade e estocagem dos REAGENTES
 Processamento e estocagem das AMOSTRAS
 Evitar contaminação e es...
 Realiza-se nova lavagem e a etapa de SENSIBILIZAÇÃO da
placa está cumprida.
 Incubação com as amostras (soluções teste ...
conhecidas de antígeno. A curva serve como padrão de
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lisar a membrana) e inibidores de proteases. Depois,
centrifuga-se e colhe-se o sobrenadante para análise.
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Elisa

  1. 1. Os métodos imunológicos desenvolvidos para quantificar a concentração de antígenos e anticorpos, por apresentarem grande sensibilidade e especificidade, tornaram-se técnicas padronizadas para pesquisa e aplicações clínicas. Entre esses métodos, um dos mais usados é o ELISA (Enzyme-linked immuno sorbent assay). Nesse método, uma enzima, que reage com um substrato incolor para produzir um produto colorido, é covalentemente ligada a um anticorpo específico que reconhece um antígeno alvo. Se o antígeno estiver presente, o complexo anticorpo-enzima irá ligar-se a ele e a enzima catalisará a reação. Então, a presença de produto colorido indica a presença de antígeno. Trata-se de um método eficiente pois permite detectar quantidades de proteína da ordem de nanogramas (10-9 g). No ELISA, deve-se selecionar um par de anticorpos, que podem ser monoclonais ou policlonais. O uso de anticorpos monoclonais resulta em maior especificidade. Dentre os diversos tipos de ELISA, destaca-se o ELISA SANDUÍCHE. Nesse método, o anticorpo de um antígeno particular é, inicialmente, adsorvido no well. Depois, o antígeno (soro, urina ou outra solução contendo o antígeno) é adicionado e se liga ao anticorpo. Finalmente, um segundo e diferente anticorpo ligado à enzima é adicionado. Nesse caso, a intensidade da reação é proporcional à quantidade de antígeno presente. Logo, permite mensurar até pequenas quantidades de antígeno. [After R. A. Goldsby, T. J. Kindt, B. A. Osborne, Kuby Immunology, 4th ed. (W. H. Freeman and Company, 2000), p. 162.]
  2. 2. http://www.callisto.si.usherb.ca:8080/iml302/images/elisa3.jpg Quanto ao método de revelação, pode ser direto ou indireto. No primeiro, a enzima reveladora encontra-se ligada diretamente ao segundo anticorpo, enquanto no indireto, a enzima apresenta-se ligada a um anti-anticorpo. O ELISA constitui a base do teste para infecção por HIV. Nesse teste, proteínas virais (os antígenos) adsorvem nos “poços” (wells) da placa de ELISA. Em seguida, é adicionado soro do paciente contendo anticorpos que se ligam aos antígenos. Finalmente, anticorpos ligados à enzima ligam-se aos anticorpos humanos, propiciando a reação enzimática com mudança de cor. EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS:  PLACA DE ELISA [After R. A. Goldsby, T. J. Kindt, B. A. Osborne, Kuby Immunology, 4th ed. (W. H. Freeman and Company, 2000), p. 162.]
  3. 3.  PIPETAS AUTOMÁTICAS  LEITOR DE ELISA  LAVADOR AUTOMÁTICO DE PLACAS http://www.jaelsa.com/imagenes/pipeta1.jpg Leitor de tiras ELISA http://www.rclcomercial.com.br/drake/i004.jpg http://pandora.labgeminis.com:8909/images/ 8x200_ul.jpg http://www.labgeminis.com/publicidad/la_tecnica_elisa.htm Leitor de placas ELISA http://www.labgeminis.com/publicidad/la_tecnic a_elisa.htm
  4. 4. CUIDADOS:  Data de validade e estocagem dos REAGENTES  Processamento e estocagem das AMOSTRAS  Evitar contaminação e espuma no PREPARO DE SOLUÇÕES  CALIBRAÇÃO de pipetas e demais aparelhos  LIMPEZA PROCEDIMENTO PARA ELISA SANDUÍCHE:  Coloca-se, na placa de ELISA, solução tampão contendo o primeiro anticorpo com concentração conhecida e suficiente para adsorver nos “poços” (“wells”) da placa. Em geral, a solução é saturada.  Lavam-se os “poços” com tampão de lavagem, de forma a retirar o tampão, mas deixar o anticorpo aderido à placa.  Adiciona-se solução contendo proteína de alto peso molecular, como a BSA (Albumina de Soro Bovino), com o objetivo de bloquear as áreas onde os anticorpos não aderiram na placa (sítios inespecíficos). http://www.iitri.org/ServImmunology.shtml 1O ANTICORPO 2O ANTICORPOANTÍGENO DA AMOSTRA ANTICORPO LIGADO MUDANÇA DE COR ADAPTADO DE: http://www.med4you.at/laborbefunde/techniken/enzyme/eliza.gif
  5. 5.  Realiza-se nova lavagem e a etapa de SENSIBILIZAÇÃO da placa está cumprida.  Incubação com as amostras (soluções teste com antígenos em concentração desconhecida devem ser adicionadas à placa)  Nova lavagem e o antígeno que reagiu com o anticorpo previamente aderido à placa também permanecerá aderido. Por outro lado, os antígenos não ligados serão removidos.  Incubação com segundo anticorpo, seguida de lavagem.  Incubação com terceiro anticorpo anti-espécie conjugado a uma enzima, como a peroxidase. Segue-se outra lavagem.  Adição de substrato para revelação. Trata-se de um substrato incolor que, quando ativado pela porção enzimática do ligante, produz um produto final corado. A mudança de cor pode ser lida diretamente em aparelho apropriado. Em geral, bloqueia-se a reação para evitar que o produto final fique muito escuro e atrapalhe a leitura do teste. Além de bloquear a reação, é possível adicionar um ácido que provoque mudança para uma cor cuja absorbância é melhor detectada pelo leitor de ELISA. OBSERVAÇÕES IMPORTANTES  Em geral, faz-se uma CURVA PADRÃO, preenchendo 8 “poços” de uma fileira com concentrações crescentes e http://www.positivehealth.com/permit/Articles/ Colon%20Health/abraham62.htm http://www.netria.co.uk/images/elisa2.jpg
  6. 6. conhecidas de antígeno. A curva serve como padrão de comparação para deduzir as quantidades de antígenos nas soluções-testes. O gráfico é fornecido por um programa próprio para a leitura de ELISA.  Um outro controle feito é o TESTE BRANCO, que consiste na adição somente do tampão com o objetivo de avaliar se houve contaminação durante o experimento.  O teste deve ser feito em DUPLICATA ou TRIPLICATA, servindo de controle para os erros de manuseio. A média dos resultados deve ser avaliada e se houver diferença significativa, o experimento deve ser repetido.  PROCESSAMENTO DA AMOSTRA: se a amostra for sangue, deve-se centrifugar, colher o plasma ou soro, diluir e analisar. Células em cultura devem ser trituradas, o tampão deve ter pH adequado, substância detergente(para http://www.shibayagi.co.jp/Prod-E/prod_akrie-211.htm EXEMPLO DE CURVA PADRÃO
  7. 7. lisar a membrana) e inibidores de proteases. Depois, centrifuga-se e colhe-se o sobrenadante para análise.

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