Apresentação sobre Distrofia Muscular Miotônica

2. Distrofia Muscular Miotônica
FABRÍCIO MACIEL
MEDICINA

3. Aspectos Clínicos
 Doenças com repetições de bases
 3,4,5 e até 6
 X-Frágil (5’ UTR) – inibição da expressão gênica
 DMM1 (3’ UTR) – expressão de RNA tóxico com ganho de função
 Doença de Huntington (Região Codificante) – expressão de proteína tóxica
 Autossômica Dominante
 Fadiga muscular progressiva, arritmias cardíacas, resistência à
insulina e distúrbios neuropsiquiátricos.
 Miotonia, caracterizada por excitabilidade acima do normal dos
músculos, causando rigidez no paciente.
(Harper, 2001)

4.  Classificada em dois tipos distintos: sendo o tipo 1 o mais comum
com uma taxa de prevalência de 1 para 20,000, e o tipo 2 que
cursa com uma clínica mais favorável.
(Bird et al., 1999)
 O tipo 1 é a segunda causa mais comum de distrofia muscular,
precedida apenas pela distrofia muscular de Duchenne. Em
adultos é a maior causa, com uma incidência de 1 para cada
8500.
(Day and Ranum, 2005)
 Sofrem antecipação: o fenômeno do aumento de severidade
fenotípica e diminuição da idade de manifestação nas gerações
seguintes – na DM1 de 25 a 30 anos por geração. O trinucleotídeo
expandido é instável e tende a se expandir em gerações
sucessivas.
(Pratter, A., 2015; C.J. Howeller., 1989)

5.  A severidade da doença e a idade de aparecimento dos sintomas
na DM1 estão relacionadas ao tamanho da expansão:
 Indivíduos normais têm de 5 a 34 repetições.
 Os sintomas costumam aparecer em pacientes com 50+
 As formas mais severas se manifestam em pacientes com 1000+
(Brook et al., 1992; Day and Ranum, 2005; Cho and Tapscott, 2007)
 De acordo com a idade de acometimento:
 Congenital (ao nascimento);
 Childhood (1-10),
 Early Adult (11-20),
 Adult (entre 21-40),
 Mild (depois dos 40 anos)
 A idade de acometimento é inversamente relacionada ao número
de expansões e diretamente relacionada à severidade dos
sintomas.
(Koch et al., 1991)

6.  A forma de acometimento em idade adulta (Adult Onset) é a mais
prevalente, aparecendo na 2ª ou 3ª década de vida, e é a forma
clínica típica da DM1. Os sintomas incluem degeneração muscular
levando a fraqueza e cansaço dos músculos faciais, do pescoço, e dos
músculos distais dos membros (mãos e pés).
 A expectativa de vida é reduzida, e costumam falecer de pneumonia e
arritmias cardíaca.
 A forma congênita (congenital) é a mais severa, sendo caracterizada
por hipotonia, respiratory distress no nascimento, assim como déficit
motor e cognitivo.
 O progresso dos sintomas cardíacos da doença pode levar à repentina
e imprevista morte, portanto é importante identificar esse subgrupo e
tratar adequadamente
(Khalighi e Kodali, 2015)

7. Aspectos Genéticos
 A DM1 resulta da expansão de um segmento de trinucleotídeos
(CTG) repetidos na 3’-UTR do gene DMPK, gene localizado em
19q13.3
(Brook et al.,1992; Caskey et al., 1992)
 A DM2 é causada pela expansão de um tetranucleotídeo (CCTG)
no primeiro íntron do gene ZNF9/CNBP, no 3q21.
(Liquori CL., 2001)
 As expansões de
CUG no mRNA
inibiam a tradução
da proteína DMPK,
 Ratos knockout
para DMPK não
foram afetados.
 Outra hipótese era que
presença das expansões
pudessem afetar a expressão de
genes adjacentes, como o SIX5,
 Entretanto ratos knockout para
Six5 não exibiram nenhuma
patologia muscular
(Jansen et al., 1996; Berul et al., 1999) (Klesert et al., 2000)

8.  Somente em 1997, descobriu-se que o mRNA mutado formava hairpin
loops estáveis que se agregavam na célula e que tinham afinidade
com proteínas reguladoras, causando sequestro e desregulação de
vários processos.
(Davis et al., 1997; Napierala and Krzyzosiak, 1997)
 A superexpressão da repetições de CUG em ratos provaram a
hipótese de que o RNA tóxico era a base da fisiopatologia da doença
provocando miotonia, miopatia, acumulação de RNA tóxico e
sequestro de reguladoras, características encontradas em vários
paciente.
Hairpin Loops
MBNL
PKC
micRNA
CELF

10.  Ambas as proteínas desreguladas no processo são necessárias para a regulação do
splicing normal dos produtos de vários genes, incluindo alguns como CLCN1, BIN1, IR,
PKM e TNNT2, explicando grande parte dos achados semiológicos nos pacientes.
 CLCN1
O splicing da transcrição do gene codificador dos canais de cloro (CLCN1) é dependente das proteínas
MBNL e CELF  splicing do gene inclui exóns contendo códons de parada  inviabilidade e
degradação dos RNAs  miotonia
(Lueck et al., 2007)
 IR
O splicing do RNA para os receptores de insulina também é regulado pelas proteínas envolvidas na
fisiopatologia da DMM. A CELF exclui do splicing o exon 11, produzindo um receptor com baixa atividade
quando comparado ao receptor produzido com a inclusão do exon (MBNL)  Resistência Insulínica
(Kellerer et al., 1992)
 BIN 1
Tem mecanismo semelhante à IR, a função da proteína é organizar os microtubulos e as miofibrilas
durante a contração  Cansaço
(Fugier et al., 2011).
 TNNT1
O gene para troponina T também passa por splicing coordenado pelas proteínas MBNL e,
principalmente CELF. Os mecanismos ainda não foram bem entendidos, mas a forma da
troponina presente em DM1 é mais sensível ao cálcio. arritmias.
(McAuliffe et al.,1990; Godt et al., 1993)
 Essa descoberta tornou a DMM a primeira doença que envolve o ganho de função
de RNA tóxico em sua patologia.

11. Diagnóstico
 Miotonia e Fraqueza dos músculos faciais e temporais são as
primeiras características a se manifestarem na DM. Degeneração
de músculos distais dos membros (pés e mãos) são outros
importantes achados.
 Exames como a Eletromiografia também são utilizados, tendo um
achado característicos da doença “mergulho do bombardeiro”.
 Eletrocardiogramas devem ser realizado frequentemente, para
avaliação do estado cardiológico.
 PCR e Southern Blot são utilizados na identificação das mutações e
na extensão das repetições.

12. Terapias
 O sequestro de MBNL corresponde a 80% dos missplicing e
consequentemente das apresentações fenotípicas  super-
expressar MBNL1 através de infecção viral pode ser uma via de
ataque.
(Kanadia et al., 2006; Chamberlain and Ranum, 2012)
 Reduzir os níveis de CELF é outra forma de combater os sintomas,
principalmente os musculares  inibindo a via da PKC, e reduzindo
a fosforilação de CELF. Ratos knockout para CELF tiveram ainda
taxa de sobrevivência maiores.
(Wang et al., 2009)
 Atacar diretamente o RNA toxico pode ser feito de duas maneiras:
degradando-o ou cobrindo os hairpinloopings com moléculas que
impeçam a ligação e consequente sequestro de MBNL.
(Furling et al., 2003)

14. Premature senescence in primary muscle
cultures of myotonic dystrophy type 2 is not
associated with p16 induction.
L.V. Renna, R. Cardani, A. Botta, G. Rossi, B. Fossati, E. Costa, G. Meola

15. Introdução
 Ainda não existe explicação para a atrofia e hipertrofia (em menor grau)
observado nos pacientes de DM, ou para as características histopatológicas da
doença, que incluem aumento do número de núcleos centrais e a presença de
fibras com nuclear clumps.
 Músculos de pacientes com DM tem várias similaridades com o músculo de
pacientes sadios com idade superior, assim como a fraqueza muscular e atrofia
com capacidade regenerativa baixa.
 A capacidade regenerativa está relacionada com as células satélites, que em
situação de injúria se ativam, proliferam e se fundem em miotubos para
regenerar o músculo.
 A diminuição da capacidade proliferativa dessas células está relacionada na
DM1 com diminuição progressiva dos telômeros em cada divisão celular ou por
vias adicionais, como a via de stress p16, que também induz a senescência
prematura em mioblastos.

16. Objetivos
 Elucidar se os mioblastos derivados de células satélites, obtidos de
músculo esquelético de pacientes com DM2 também exibem
senescência prematura como acontece na DM1.
 Se as alterações no potencial de proliferação dessas células pode
contribuir para algumas das características clínicas e
histopatológica observados em DM2.
 Que mecanismos estão envolvidos na perda da capacidade
proliferativa da DM2

17. Métodos
 Biópsias do bíceps braquial de humanos portadores de DM1 (n=3) e DM2 (n=4) foram
feitas em condições estéreis.
 Foram utilizados controles agematched (n=4) sem nenhum sinal de doença
neuromuscular.
 Os diagnósticos de DM2 foram feitos por fluorescência in situ em secções de músculos
usando um (CAGG) probe, para verificar a presença de inclusões ribonucleares.
(Cardani et al.)
 A genotipagem de DM1 e DM2 foi feita em DNA extraído de leucócitos do sangue
periférico.
 Foram realizados testes de: Histopatologia e Imunohistoquímica, Cultura celular,
Capacidade proliferativa e Senescência, Capacidade Diferenciativa, Western Blot,
Imunofluorescência, Análise do comprimento de telômeros.

18. Resultados
 Todos os pacientes avaliados no estudo mostraram aumento da
atrofia da fibra muscular, em particular um aumento da atrofia dos
dois tipos de fibra em pacientes com DM1 e aumento de atrofia da
fibra do tipo 2 em pacientes com DM2.

19.  A capacidade proliferativa de mioblastos DM1 e DM2 estava
reduzida em 50% e 36%, respectivamente, quando comparada aos
controles. Foi observado também que os mioblastos doentes
tinham menos divisões que os controles.

20.  Para avaliar os mecanismos que afetam a capacidade proliferativa
dessas células, avaliaram-se biomarcadores usualmente
reconhecidos em células senescentes (b galactosidase).
 No início do experimento não foram detectados nenhuma célula
com atividade da bgal, entretanto, no final, o número de células
senescentes e portanto positivas para bgal aumentou
consideravelmente.

21.  A expressão da proteína p16 foi analisada no começo e no final do
experimento para verificar se o mecanismo estava envolvido na
DM2 também.
 Como era esperado, nos mioblasto com DM1 notou-se grande
expressão da proteína, entretanto os níveis de p16 na DM2 foram
similares aos do controle.