Tecnicas em analises geneticas
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O documento descreve as etapas do processo de análise genética de DNA, incluindo a extração do DNA a partir de amostras de sangue, a amplificação do DNA usando reação em cadeia da polimerase (PCR), e a análise dos fragmentos de DNA resultantes por eletroforese em gel de agarose.
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- 1. FRANCIELE FERNANDES TÉCNICAS DE ANÁLISES GENÉTICAS
- 2. DNA
- 3. 1º PASSO- LISE DAS HÉMACIAS SANGUE COLETADO TRANSFERIDO PARA UM TUBO DE ENSAIO ADEQUADO ADICIONADO UMA SOLUÇÃO CAPAZ DE PROVOCAR UMA LISE SELETIVA, SOMENTE DAS HEMÁCIAS
- 4. 1º PASSO- LISE DAS HÉMACIAS SOLUÇÃO TAMPÃO- AGENTE TRITON X100 É UM DETERGENTE RESPONSAVEL PELA LISE DAS MEMBRANAS, PERMITINDO O ROMPIMENTO DAS HEMACIAS CENTRIFUGADO APÓS CENTRIFUGADO O SOBRENADANTE- RESTOS DE HÉMACIAS RESIDUOS NO FUNDO DO TUBO- SÃO OS LEUCOCITOS INTEGROS
- 5. 2º PASSO- LISE DOS LEUCÓCITOS ADICIONA A SOLUÇÃO TAMPÃO DE LISE 2 AGITA RIGOROSAMENTE DURANTE 10SEGUNDOS EM UM EQUIPAMENTO APROPRIADO TEMPERATURA AMBIENTE PERMANECERÁ EM REPOUSO POR ALGUMAS HORAS EM BANHO MARIA A 55 GRAUS
- 6. 3º PASSO- PRECIPITAÇÃO DAS PROTEÍNAS APÓS A INCUBAÇÃO, RETIRA OS TUBOS DO BANHO MARIA E TRANSFERE O SOBRENADANTE CONTENDO O DNA LIVRE PARA UM TUBO LIMPO ADICIONA-SE NESSA MISTURA ACETATO DE AMONIO SATURADO (C2H7NO2), CUJO O BJETIVO É PRECIPITAR AS PROTEINAS. EM SEGUIDA A HOMOGEINIZAÇÃO. LEVA O TUBO PARA UMA CENTRIFUGA, PARA HAVER A SEPARAÇÃO DO RESIDO RESULTANTE DE PROTEINA PRECIPTADO E O DNA (AO QUAL PERMANECE NO SOBRENADANTE)
- 7. 4º PASSO- PRECIPITAÇÃO DO DNA O SOBRENADANTE CONTENDO O DNA É REMOVIDO PARA UM TUBO LIMPO, ADICIONANDO O ALCOOL ISOPROPANOL. O DNA É PRECIPITADO E COM ISSO ELE É NOVAMENTE CENTRIFUGADO PARA PODER SER ISOLADO DA SOLUÇÃO. DESPREZA O SOBRENADANTE E SENDO LAVADO COM ETANOL 70%. É RETIRADO O ALCOOL DO TUBO E O DNA É COLOCADO EM TEMPERATURA AMBIENTE PARA SECAR E ADICIONADO A SOLUÇÃO TRIS EDTA, E PODENDO ASSIM SER ARMAZENADA EM FREEZER A -20ºC.
- 8. 2ª ETAPA- REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE MIX PARA A AMPLIFICAÇÃO TAQ POLIMERASE, PRIMERS, DNA MOLDE NUCLEOTÍDEOS (BLOCOS QUE COMPÕEM O DNA). PREPARAÇÃO DO MIX TERMOCICLADOR NO TERMOCICLADOR OCORREM 3 CICLOS DESNATURAÇÃO ANELAMENTO EXTENSÃO
- 9. 2ª ETAPA- REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE TERMOCICLADOR
- 10. 2ª ETAPA- REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
- 11. 3ª ETAPA- ELETROFOSE DE GEL DE AGAROSE CUBA DE ELETROFORESE
- 12. 3ª ETAPA- ELETROFOSE DE GEL DE AGAROSE QUAL FRAGMENTO DE DNA VAI GANHAR A "CORRIDA" PARA O POLO POSITIVO?
- 13. 4ª ETAPA- POLIMORFISMO DOS FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO-RFLP QUANDO UMA REGIÃO DO ESTUDO APRESENTA ALTERAÇÃO DE APENAS UMA BASE DO DNA. ESSA ANÁLISE PODE SE DAR POR UMA METODOLOGIA DENOMINADA POLIMORFISMO DOS FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO TAMPÃO DA ENZIMA ENZIMA DE RESTRIÇÃO PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO
- 14. 4ª ETAPA- POLIMORFISMO DOS FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO-RFLP ENZIMA DE RESTRIÇÃO NECESSITA DE UM TEMPERATURA ADEQUADA PARA REAGIR 37º C 65º C ENZIMA DE RESTRIÇÃO SÃO ISOLADAS DE MICROORGANISMOS, POR ISSO É NECESSARIA A INCUBAÇÃO
- 15. 4ª ETAPA- POLIMORFISMO DOS FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO-RFLP ELETROFORESE EM GEL DE POLICRIAMIDA ENTÃO AS ANÁLISES DE RFLP BASEIAM EM TAMANHO DE FRAGMENTOS GERADOS POR AMOSTRAS DE DNA APÓS CLIVAGEM COM ENZIMAS DE RESTRIÇÃO E SÃO COMPARADAS ENTRE NÚMERO E TAMANHO DE FRAGMENTOS QUE SURGEM APÓS A DIGESTÃO DO DNA.
- 17. GIRE A TELA
- 18. GIRE A TELA
- 21. 1º PASSO- EXTRAÇÃO DO DNA COLETA DE MATERIAL BIOLOGICO COLETA DE CELULAS DA BOCHECHA ATRAVES DO SWAB PASSA DE 5 A 10 VEZES EM UM LADO E NO OUTRO ESPERAR O SWAB SECAR EXTRAÇÃO ADICIONA O SWAB EM UM EPPENDORF ADICIONA UMA SOLUÇÃO DE NAOH AQUECER POR 20/30 MIN EM UM TERMOBLOCO APÓS AQUECER É ADICIONADO UMA SOLUÇÃO TAMPÃO PCR- REAÇÃO DA CADEIA DA POLIMERASE EM UMA CAPELA COM LUZ ULTRAVIOLETA A PCR TEM DUAS CARACTERISTICAS IMPORTANTES 1ª ELA PERMITE DELIMITAR A REGIÃO DO DNA QUE TENHA INTERESSE 2ª AMPLIFICA-LA MILHARES E MILHARES DE VEZES E ANALISAR PELA ELETROFORESE. PRIMEIRO PASSO É DESCONGELAR OS REAGENTES QUE SERÃO UTILIZADOS CONSISTEM DE UM TAMPÃO COM PH, H2O, INICIADORES (SÃO FRAGMENTOS DE DNA DE 15 A 20 MIL NUCLEOTIDEOS)QUE SÃO USADOS PARA DELIMITAR REGIÕES AO QUAL IRÁ AMPLIFICAR; DNTP’S (DESOXIRRIBONUCLEOTÍDEOS FOSFATADOS) SÃO OS BLOQUINHOS QUE VÃO SER UTILIZADOS NA COPIA DA REGIAO DE INTERESSE PELA EMZIMA TAQ POLIMERASE
- 22. 1º PASSO- EXTRAÇÃO DO DNA PCR- REAÇÃO DA CADEIA DA POLIMERASE EM UMA CAPELA COM LUZ ULTRAVIOLETA A PCR TEM DUAS CARACTERISTICAS IMPORTANTES 1ª ELA PERMITE DELIMITAR A REGIÃO DO DNA QUE TENHA INTERESSE 2ª AMPLIFICA-LA MILHARES E MILHARES DE VEZES E ANALISAR PELA ELETROFORESE. PRIMEIRO PASSO É DESCONGELAR OS REAGENTES QUE SERÃO UTILIZADOS CONSISTEM DE UM TAMPÃO COM PH, H2O, INICIADORES (SÃO FRAGMENTOS DE DNA DE 15 A 20 MIL NUCLEOTIDEOS)QUE SÃO USADOS PARA DELIMITAR REGIÕES AO QUAL IRÁ AMPLIFICAR; DNTP’S (DESOXIRRIBONUCLEOTÍDEOS FOSFATADOS) SÃO OS BLOQUINHOS QUE VÃO SER UTILIZADOS NA COPIA DA REGIAO DE INTERESSE PELA EMZIMA TAQ POLIMERASE PREPARAÇÃO DO MIX DE REAGENTES AO QAUL O VOLUME É CALCULADO DE ACORDO COM O NUMERO DE AMOSTRAS ADICIONAR O MIX DE PCR EM UM ENPPENDORF E POSTERIORMENTE ADICIONA-SE O DNA TRANSFERIR OS ENPPENDORF PARA UM TERMOCICLADOR (É UM EQUIPAMENTO QUE AUTOMATIZA O PROCESSO DE AMPLIFICAÇÃO DE UMA SEQUÊNCIA ESPECÍFICA DE DNA A PARTIR DE UMA PEQUENA AMOSTRA.)
- 23. 1º PASSO- EXTRAÇÃO DO DNA TECNICA DE SEPARAÇÃO DOS FRAGMENTOS PELA ELETROFORESE.
Notas do Editor
- É A MOLÉCULA BIOLÓGICA RESPONSÁVEL PELA TRANSMISSÃO DOS CARACTERES HEREDITARIOS ESTÁ PRESENTE EM TODAS AS CELULAS DO ORGANISMO
- NESSA REAÇÃO QUEM IRA PROMOVER A SEPARAÇÃO DA DUPLA FITA É A TEMPERATURA Os ingredientes são reunidos em um tubo, juntamente com cofatores de que a enzima precisa, e passam por repetidos ciclos de aquecimento e resfriamento que permitem que o DNA seja sintetizado. TERMOCICLADOR É UM EQUIPAMENTO QUE AUTOMATIZA O PROCESSO DE AMPLIFICAÇÃO DE UMA SEQUÊNCIA ESPECÍFICA DE DNA A PARTIR DE UMA PEQUENA AMOSTRA
- Desnaturação (96 °C): Aquece fortemente a reação para separar, ou desnaturar, as fitas de DNA. Isso proporciona um molde de fita simples para a próxima etapa. Anelamento (55ºC): Resfria a reação para que os primers possam se ligar às suas sequências complementares no DNA molde de fita simples. Extensão (72 °C): Eleva a temperatura da reação para que a Taq polimerase estenda os primers, sintetizando novas fitas de DNA.
- Este ciclo se repete 25 - 35 vezes em uma reação típica de PCR, que geralmente ocorre em 2 - 4 horas, dependendo do comprimento da região de DNA a ser copiada.
- A eletroforese em gel é uma técnica usada para separar fragmentos de DNA de acordo com seu tamanho. As amostras de DNA são carregadas nos poços (cavidades) localizados numa das extremidades de um gel, e uma corrente elétrica é aplicada para fazê-las avançar pelo gel. Os fragmentos DNA estão carregados negativamente, então movem-se na direção do eletrodo positivo. Já que todos os fragmentos de DNA têm a mesma quantidade de carga por massa, os fragmentos menores atravessam o gel mais rapidamente do que os maiores. Quando um gel é pigmentado com um corante que se liga ao DNA, os fragmentos de DNA podem ser vistos como bandas, cada uma representando um grupo de fragmentos de DNA de mesmo tamanho. AGAROSE é aquecida em um tampão (água com alguns sais) e deixada para esfriar, forma um gel sólido ligeiramente mole. Antes das amostras de DNA serem adicionadas, o gel deve ser colocado em uma caixa de gel. Uma extremidade da caixa é ligada a um eletrodo positivo, enquanto a outra extremidade é ligada a um eletrodo negativo. O corpo principal da caixa, onde o gel é colocado, é preenchido com uma solução tampão contendo sal que pode conduzir corrente. Embora você não seja capaz de ver na imagem acima (graças a minhas incríveis habilidades artísticas), o tampão preenche a caixa de gel até o nível em que ele mal chega a cobrir o gel. A extremidade do gel com os poços está voltada para o eletrodo negativo. A extremidade sem poços (para a qual os fragmentos de DNA vão migrar) está voltada para o eletrodo positivo.
- Um poço é reservado para uma escada de DNA, um padrão de referência que contém fragmentos de DNA de comprimentos conhecidos. A seguir, a caixa é ligada e a corrente começa a fluir através do gel. As moléculas de DNA têm carga negativa devido aos grupos fosfato em seus esqueletos de açúcar-fosfato, assim elas começam a se mover através da matriz de gel, para o polo positivo. Quando a energia é ligada e a corrente passa através do gel, diz-se que o gel está correndo. Pedaços curtos de DNA vão viajar através dos poros da matriz de gel mais rapidamente que os mais longos. Após o gel ter corrido por algum tempo, os pedaços mais curtos de DNA vão estar mais próximos do polo positivo do gel, enquanto os mais longos vão permanecer próximos aos poços. Pedaços muitos curtos de DNA podem correr diretamente para a extremidade do gel se forem deixados por períodos suficientemente longos (algo de que me senti definitivamente culpado!).
- As análises de PCR-RFLP baseiam em tamanho de fragmentos gerados por amostras de DNA após clivagem com enzimas de restrição e são comparadas entre número e tamanho de fragmentos que surgem após a digestão do DNA O polimorfismo genético é definido como as diferenças genéticas herdadas entre indivíduos dentro sobre 1% da população normal. A técnica do RFLP explora estas diferenças em seqüências do DNA para reconhecer e estudar a variação intraspecies e interspecies. ENZIMA DE RESTRIÇÃO QUE SERA RESPONSAVEL PELA DESCRIMINAÇÃO DOS ALELOS NESSA SOLUÇÃO ADICIONA-SE OS GENES AMPLIFICADOS Tecnica feita para diferenciar alelos polimórficos do gene humano, amplificado no PCR. Digestão por endonuclease, que são enzimas capazes de quebrar sequencias especificas do dna. POR ESSA ENZIMA SER ESPECIFICA, ELA É CAPAZ DE RECONHECER UM ALELO, POREM QUANDO ELE SOFRE MUTAÇÃO, A ALTERAÇÃO DE PAR DE BASE, ESSE RECONHECIMENTO JÁ NÃO OCORRE MAIS
- A ENZIMA É RESPONSAVEL POR DESCRIMINAR OS ALELOS A E B, PERMITINDO CATEGORIZAR OS INDIVIDUOS EM HOMOZIGOTO A, HOMOZIGOTO B E HETEROZIGOTO
- Os fragmentos da limitação produzidos durante a fragmentação do ADN são analisados usando a electroforese do gel. Os fragmentos são negativamente - cobrado e podem facilmente ser separados pela electroforese, que separa as moléculas baseadas em seus tamanho e carga. As amostras fragmentadas do ADN são colocadas na câmara que contem o gel electrophoretic e dois eléctrodos. Quando um campo elétrico é aplicado, os fragmentos migram para o eléctrodo positivo. Os fragmentos menores movem-se mais rapidamente através do gel que sae do maiores atrás e as amostras do ADN são separadas assim em faixas distintas no gel. Visualização das faixas O gel é tratado com as tinturas luminescentes a fim fazer as faixas do ADN visíveis. A DIFERENÇA É QUE A POLICRILAMIDA POSSIBILITA A DIFERENCIAÇÃO DE FRAGMENTOS DE TAMANHOS BEM PROXIMOS