Molecular 3

1. Aplicação de marcadores moleculares na
agricultura
Prof. Adjunta Adriana Dantas
Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia
UERGS, Bento Gonçalves, RS

2. DOGMA CENTRAL
DNA armazena
a informação
RNA transfere
a informação
Proteína executa
a função
DNA armazena
a informação
RNA transfere
a informação
Proteína executa
a função
genes ambiente FENÓTIPO

3. MARCADORES ⇒ MARCAS ⇒
GENES?
MARCADORES
Morfológicos Bioquímicos
Marcadores moleculares
DNA RNA

4. Ferramentas da Biologia Molecular
Enzima de restriçãoEnzima de restriçãoCAS
COLAR
CAS
COLARCAS
COLARCAS
COLARCAS
COLAR
CAS
COLAR
CAS
COLAR
CAS
COLAR
DNA ligase
CAS
COLAR
CAS
COLARCAS
COLARCAS
COLARCAS
COLAR
CAS
COLAR
CAS
COLAR
CAS
COLAR
DNA ligase
PCR
Termociclador
PCR
TermocicladorEletroforese

5. Ferramentas da Biologia Molecular
Enzima de restriçãoEnzima de restriçãoCAS
COLAR
CAS
COLARCAS
COLARCAS
COLARCAS
COLAR
CAS
COLAR
CAS
COLAR
CAS
COLAR
DNA ligase
CAS
COLAR
CAS
COLARCAS
COLARCAS
COLARCAS
COLAR
CAS
COLAR
CAS
COLAR
CAS
COLAR
DNA ligase
PCR
Termociclador
PCR
TermocicladorEletroforese

6. GENOMA
ENZIMA DE RESTRIÇÃO
fragmentos do genoma
Enzimas de restrição

7. M ic r o r g a n is m o E n z im a S e q u ê n c ia A l v o
E c o R IE s c h e r i c h i a c o l i
B a c i l lu s a m y l o l i q u e f a c i e n s H
H a e m o p h i l u s a e g y p t i u s
H a e m o p h i l u s a e g y p t i u s
H a e m o p h i l u s a e g y p t i u s
P r o v i d e n c i a s t u a r t i i
S t r e p t o c o c c u s a l b u s G
T h e r m u s a q u a t i c u s
S e r r a t i a m a r c e s c e n s
B r e v i b a c t e r i u m a l b i d i u m
B a c i l lu s g l o b i g i i
B a m H I
B g l I I
P s t I
B a l I
S m a I
H a e I I I
T a q I
S a l I
H i n d I I I
H a e I I
G A A T T C
C T T A A G
G G A T C C
C C T A G G
A G A T C T
T C T A G A
P G C G C P i
P i C G C G P
u
y u
A A G C T T
T T C G A A
C T G C A G
G A C G T C
G T C G A C
C A G C T G
T G G C C A
A C C G G T
A G G C C T
T C C G G A
C C C G G G
G G G C C C
T C G A
A G C T
Tabela 1. Algumas endonuclease de restrição: origem e sítios de clivagem. A seta indica
o local de clivagem. Pu e Pi referem-se, respectivamente, a qualquer purina e pirimidina.

8. Clivam o DNA somente em determinadas seqüências de
nucleotídeos, normalmente curtas, 4 – 8 pares de bases.
Cada enzima reconhece um sítio de clivagem específico!!!
A clivagem do DNA –cortam o DNA em sítios
específicos
DNA na célula - moléculas muito grandes
Endonucleases de restrição ou enzimas de restrição

9. a ) C liv a g e m n o e ix o d e s im e t r ia
M o lé c u la s c o m e x tr e m id a d e s a b r u p t a s M o lé c u la s c o m e x tr e m id a d e s c o e s iv a s
b ) C liv a g e m s im é t r ic a m e n te s it u a d a a o
r e d o r d o e ix o d e s im e tr ia
. . . T C G A . . .
. . . A G C T . . .
3 ’
5 ’ 3 ’
5 ’
+
. . . G A A T T C . . .
. . . C T T A A G . . .
+
3 ’
5 ’ 3 ’
5 ’
Figura 1. Dois tipos de clivagem feitas por enzimas de restrição. As setas indicam os
sítios de clivagem. As linhas pontilhadas representam o centro de simetria da
sequência.

10. A separação dos fragmentos da
molécula de DNA em gel de
eletroforese
Características do DNA
Separação por tamanho

11. Ferramentas da Biologia Molecular
Enzima de restriçãoEnzima de restriçãoCAS
COLAR
CAS
COLARCAS
COLARCAS
COLARCAS
COLAR
CAS
COLAR
CAS
COLAR
CAS
COLAR
DNA ligase
CAS
COLAR
CAS
COLARCAS
COLARCAS
COLARCAS
COLAR
CAS
COLAR
CAS
COLAR
CAS
COLAR
DNA ligase
PCR
Termociclador
PCR
TermocicladorEletroforese

12. CAS
COLAR
CAS
COLAR
DNA ligase
Liga o cDNA
em vetores
apropriados

13. DNA vetor
Fragmento de DNA a
ser clonado
Ligação catalisada
pela DNA ligase
DNA recombinante
Transformação
DNA recombinante
Cromossomo
bacteriano

14. Plasmídeo
de
E.coli
DNA
DNA ligase
Plasmídeo híbrido
Enzima Enzima
GCA T
T ACG
TGCA TGCA
ACGT ACGT
TGCA
ACGT
TG
CA TG
CA
AC
GT AC
GT
Construção de uma molécula de DNA híbrida a partir de fragmentos de
diferentes organismos obtidos com o uso de enzima de restrição.

15. R e s i s t ê n c i a a
a m p ic ilin a
P s t l
E c o R I C la I
H in d I I I
B a m H I
S a lI
R e s i s t ê n c i a
a t e t r a c i c l in a
O r ig e m d a r e p l ic a ç ã o
d o p la s m í d e o
A
B
R
A m p
R R
R
T c
R
T c
R
T c
p B R 3 2 2
p B R 3 2 2
r e c i r c u la c iz a d o
S í t io
H IB a m
B a m H I
D N A lig a s e
S í t io H IB a m
D N A E x ó g e n o
B a m H I
T r a n s f o r m a ç ã o d e E . c o li
P la s m í d e o h i b r i d o c o n t e n d o
D N A E x ó g e n o
T r a n s f o r m a n t e s r e s is t e n t e s
a a m p ic il in a e t e t r a c ic lin a
T r a n s f o r m a n t e s r e s is t e n t e s
a a m p ic ilin a m a s s e n s í v e l
a t e t r a c i c lin a
p B R 3 2 2
A m p A m p
Estrutura do plasmídeo
pBR322, um típico vetor
de clonagem. A seta indica
a direção da replicação do
DNA a partir da sua
origem (A). Método da
inativação insercional para
isolar plasmídeos contendo
DNA exógeno.
A insersão do DNA
exógeno no plasmídeo
pBR322 causa inativação
da resistência à
tetraciclina, permitindo o
isolamento de
transformantes contendo o
fragmento de DNA clonado
(B).

16. CARTUCHO DE CLONAGEM - Polylinker
Ligação com várias
enzimas diferentes,
vários sítios de
clonagem

17. Ferramentas da Biologia Molecular
Enzima de restriçãoEnzima de restriçãoCAS
COLAR
CAS
COLARCAS
COLARCAS
COLARCAS
COLAR
CAS
COLAR
CAS
COLAR
CAS
COLAR
DNA ligase
CAS
COLAR
CAS
COLARCAS
COLARCAS
COLARCAS
COLAR
CAS
COLAR
CAS
COLAR
CAS
COLAR
DNA ligase
PCR
Termociclador
PCR
TermocicladorEletroforese

18. Eletroforese (Michaelis, 1909)
+
—
Géis
Amido
Agarose
Acrilamida
Soluções-tampões
O sentido e a velocidade de migração
é determinado pelo tamanho e carga
das moléculas

19. O princípio básico envolvido na obtenção e
detecção de cada classe de marcador
bioquímico ou de DNA reside no uso de
eletroforese.
O termo eletroforese foi criado por Michaelis
em 1909, para descrever migração de
colóides sob a influência de um campo
elétrico.
Seu princípio é simples: moléculas de carga
negativa migram para o pólo positivo, e
moléculas com carga positiva migram para o
pólo negativo.
A eletroforese visa à separação
de moléculas em função de suas
cargas elétricas, de seus pesos
moleculares e de suas conformações,
em suportes porosos (géis) e soluções-
tampões (estabilizam o pH do meio e
permitem o fluxo de corrente elétrica).

20. AGAROSE

21. Carregando o gel com as
amostras

24. Revelando gel de agarose em U.V. – brometo de
etídeo

25. Gel acrilamida

29. Exemplo, de caso resolvido pelo gel
vertical de acrilamida corado com nitrato
de prata
Sangue retirado de chapéu e jeans
S = suspeito
V- vítima
Análise DNA forense

30.  isoenzimas
 RAPD
 MICROSSATÉLITES - SSR
 AFLP
 RFLP-PCR
 cDNA+AFLP
 ESTs
 SNPs
 Marcadores específicos (SCARs, OGMs,
etc. )
Tipos de marcadores genéticos

31. Eletroforese de isoenzimas
* Isoenzimas - diferentes formas moleculares (variantes)
de uma mesma enzima, apresentando função idêntica ou
similar, presente num mesmo indivíduo (Markert & Moller,
1959).
Gel de Araucaria angustifolia
6PGDH -CM
MANTOVANI, 2003
Co-dominância

32. Isoenzimas
Fosfoglucomutase (PGM)
monomérica
alelo 1
alelo 2
alelo 3
Fosfoglucomutase (PGM)
monomérica
alelo 1
alelo 2
alelo 3
Fosfoglucomutase (PGM)
monomérica
alelo 1
alelo 2
alelo 3
MANTOVANI, 2003
Resultado da presença de mais de um gene codificando cada uma das
enzimas

33. Figura 1. Zimograma de PGM de couve. Início na parte inferior, ânodo no topo.1 = Ribeirão Pires 2620
com bandas na região A e B: B, E, G, H; 2 = 1811 C, G; 3 = Roxa B, C, G, H; 4 = São Roque A, C, E, G,
H; 5 = Gigante 915 C, D, F, G, H; 6 = 916 C, G, H; 7 = Crespa Piracicaba A, E, G, H; 8 = Ribeirão Pires
2446 C, G, H; 9 = Crespa Capão Bonito C, E, G; 10 = Tupi B, G, H; 11 = Jundiaí C, F, I; 12 = Mococa C,
E, I; 13 = São José C, G, H; 14 = Roxa Monte Alegre A, C, F, I; 15 = Verde-Escura A, C, E, F,

34. Figura 2. Zimograma de PRX de couve. Início na parte inferior, ânodo no topo. 1 = Ribeirão Pires 2620 com
bandas na região A: B1 Região B com banda monomórfica; 2 = 1811 B1; 3 = Roxa B1; 4 = São Roque A1 e
B1; 5 = Gigante 915 A1; 6 = 916 B1; 7 = Crespa Piracicaba B1; 8 = Ribeirão Pires 2446 B1; 9 = Crespa Capão
Bonito A1 e B1; 10 = Tupi B1; 11 = Jundiaí B1; 12 = Mococa B1; 13 = São José B1; 14 = Roxa Monte Alegre
B1; 15 = Verde-Escura A1.

35. Aplicações

37. Análise da variabilidade genética

38. Reação de polimerase em cadeia (PCR)
– princípio e aplicação da técnica
Replicação do DNA
Técnica usada para amplificar uma região específica de DNA em visando
produzir quantidade de DNA suficiente

39. PCRDesnatura
94 o
C
Temperatura
100
0
50
Tempo
5’3’
3’5’

40. PCRDesnatura
94 o
C
Temperatura
100
0
50
Tempo
3’5’
5’3’
Calor

41. PCRDesnatura
94 o
C
Anela
Primers
50 o
C
Extende
72 o
CTemperatura
100
0
50
Tempo
3’5’
5’3’
5’
5’
Desnatura
94 o
C

42. PCRDesnatura
94 o
C
Desnatura
94 o
C
Anela
Primers
50 o
C
Extende
72 o
CTemperatura
100
0
50
Tempo
30x
3’5’
5’3’
Calor
Calor
5’
5’
5’

43. PCRDesnatura
94 o
C
Desnatura
94 o
C
Anela
Primers
50 o
C
Extende
72 o
CTemperatura
100
0
50
Tempo
30x
3’5’
5’3’
5’
5’
5’
5’
5’
5’

44. PCR
Temperatura
100
0
50
Tempo
Desnatura
94 o
C
Desnatura
94 o
C
Anela
Primers
50 o
C
Extende
72 o
C
30x
3’5’
5’3’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
Calor
Calor

45. PCRDesnatura
94 o
C
Desnatura
94 o
C
Anela
Primers
50 o
C
Extende
72 o
CTemperatura
100
0
50
Tempo
30x
3’5’
5’3’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’

46. Fragmento de
tamanho
definido
PCRDesnatura
94 o
C
Denatura
94 o
C
Anela
Primers
50 o
C
Extenção
72 o
CTemperatura
100
0
50
Tempo
30x
3’5’
5’3’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’

47. DNA dobra a cada ciclo
0
Ciclos
Número de ciclos
3
8
2
4
1
2
4
16
5
32
6
64

48. ATCTTGTATTCCGGCC CCTTACCGGTATACTA
TAGAACATAAGGCCGG5´
5´
5´-TAGAACATAAGGCCTA-3´
GGAATGGCCATATGAT
3´- CCTTACCGGTATACTA -5´
ATCTTGTATTCCGGAT CCTTACCGGTATACTA
TAGAACATAAGGCCTA GGAATGGCCATATGAT5´
5´
5´-TAGAACATAAGGCCTA-3
SIM
NÃO
ATCTTGTATTCCGGAT CCTTACCGGTATACTA
TAGAACATAAGGCCTA GGAATGGCCATATGAT5´
5´
ATCTTGTATTCCGGCC CCTTACCGGTATACTA
TAGAACATAAGGCCGG GGAATGGCCATATGAT5´
5´
3´- CCTTACCGGTATACTA -5´

49. Como
funciona
MESMO??
Do que
precisa???
O que
imita????
Reação de
PCR

51. Extração de DNA (Doyle e Doyle, 1987)
Amostra
Sol. extratora
pellet
1.5
1.0
0.5
0.1
1.5
1.0
0.5
0.1
1.5
1.0
0.5
0.1
1.5
1.0
0.5
Adição de CIA
1.5
1.0
0.5
Adição de CIA
1.5
1.0
0.5
Adição de CIA
1.5
1.0
0.5
0.1
Adição de etanol
1.5
1.0
0.5
0.1
Adição de etanol
Centrifugação
RNAse

52. Quantificação de DNA
20 50 100
Quantificação DNA (gel agarose 0,8%)

53. • Logo após Kary Mullis ter descoberto a Polymerase Cadeia
Reação (PCR) ele percebeu que primers curtos ligariam a
vários locais em um genoma e assim poderiam produzir
fragmentos múltiplos
• Williams et al. (1990) desenvolveu Random Amplified
Polymorphic DNA (RAPD) - uma técnica que utiliza 10
primers de base muito curto para gerar fragmentos de DNAs
• Fragmentos de RAPD podem ser separados e usado como
marcadores genéticos ou um tipo de impressão digital
Constatações

54. RAPDs
(Random Amplified Polymorphic DNA)
A
A B
B

55. RAPD
DNA
Primer se liga a muitos locais no DNA
Só quando primer locais que liga em
direção oposta – amplificação

56. RAPD
DNA
Primers encontram-se na mesma direção,
amplificação NÃO acontecerá

57. RAPD
DNA
> 2,000 bases

58. DNA
Primers são separados em pouca distância,
fragmento É AMPLIFICADO
100 - 1,500 bases
RAPD
Dominante

60. A1A1 A1A2 A2A2
Marcadores “dominantes”

61. Ind. L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
0
1
0
0
1
0
0
0
1
0
1
0
0
1
1
0
1
1
0
1
0
0
1
1
0
1
1
0
1
0
1
0
1
1
0
0
0
1
0
1
1
1
1
0
1
1
1
0
0
1
0
1
0
1
1
0
0
1
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10
L2
L1
L3
L5
L6
L4
L7
L8
Marcadores “dominantes”

62. A1A1 A1A2 A2A2
Marcadores “co-dominantes”

63. O problema da “dominância”
1
2
01 02 03
1/1 1/2 2/2
1
01 02 03
1/? 1/? 2/2
1 1 0
1
2
01 02 03
1/1 1/2 2/2
1
01 02 03
1/? 1/? 2/2
1 1 0

64. Ind. L1
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
1/3
3/4
2/3
3/3
1/3
1/1
1/3
1/4
3/3
1/2
1
2
3
4
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10
Marcadores “co-dominantes”

65. OQUE É IMPORTANTE?
QUAIS AS MONOMÓRFICAS?
QUAIS AS POLIMÓRFICAS?
QUAIS AS SEGREGANTES?

66.  deve ser capaz de diferenciar progenitores
 deve ser reproduzido com precisão na progênie
Do ponto de vista molecular, um marcador genético (ou loco marcador)
serve para identificar um local ou uma região de um cromossomo.
Um marcador genético ideal deve apresentar uma série de atributos:
alto nível de polimorfismo
estabilidade em diferentes ambientes
detectar grande número de locos não ligados
herança simples
Marcador genético é uma característica que é capaz de detectar
diferenças entre dois ou mais indivíduos ou organismos.

67. RAPDs
(Randomly Amplified Polymorphic DNA)
Amplificação de um segmento de DNA delimitado
por dois iniciadores (ou primers, ou
oligonucleotídeos), comumente com 10 pares de
bases, que são complementares a dois sítios de
nucleotídeos, um em cada fita do DNA,
posicionados inversamente a uma distância
geralmente não superior a 4kb.

68. Marcador molecularMarcador molecular
Todo e qualquer fenótipo molecular proveniente de um
gene expresso, (isoenzimas, proteinas, RNAm)
ou de um segmento específico de DNA (regiões
expressas ou não do genoma).

69. Transposons
Sequências de inserçãoSatélites
Microssatélites
Minissatélites
Genoma
Repetições em
tandem
Repetições
dispersas
Onde moram os
marcadores???
Introns
Fragmentos de
genes
RAPDs
AFLPs
outros
Genes e sequências
relacionadas
DNA extragênico
DNA repetitivoDNA codificante DNA não
codificante
DNA repetitivo

70. GGCTATCAAAGACCTGAAGAAGCCCAGTATAACCTTAGGAAAAGCTCCTGATTTGAATAA
GCATACAAATCAATTNTATCTGGCATGAATGCAGCCAAACTCGACCCTGATGATGTATGC
CTTATCTGGCTGCCGCGATGCAGTTCTTTGAGGGATCATGTCCTGAGGACTGGACTAGCT
GGAATCCTGATAGCTCGGAAGGGAGACAAGATCACTCCGGATTCTCTTGTGGACATAAG
ACGTACTGATGTGGAAGGGAATTGGGCTCTAACAGGGGGCATGGAGTTGACAAGGGACC
TACTGTTTCAGAGCATGCATCTCTCTCTCTTCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC
CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC
CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCGACCCTACTGTTTC
ATGTGCGCTAACTGGAGTACCATACCAAATTTCAGATTCCTGGCTGGGGCTATCAAAGAC
GAAGAAGCCCAGTATAACCTTAGGAAAAGCTCCTGATTTGAATAAAGCATACAAATCAA
NTATCTGGCATGAATGCAGCCAAACTCGACCCTGATGATGTATGCTCTTATCTGGCTGC
GCGATGCAGTTCTTTGAGGGATCATGTCCTGAGGACTGGACTAGCTATGGAATCCTGATA
GCTCGGAAGGGAGACAAGATCACTCCGGATTCTCTTGTGGACATAAGACGTACTGATGTG
GAAGGGAATTGGGCTCTAACAGGGGGCATGGAGTTGACAAGGGACCCTACTGTTTCAGA
CATGCATCTCTGGTTGGCCTTCTCTTGAGTTTATATAGGTTGAGCAAAATCTCCGGGCAG
TACCGGCAATTACAAGACAAACATCGCGGATACGAATAGAGCAGATTTTTGAGACAGCC
CTTTGCAAAAATCGTAGAACATCATACTTTGATGACGACCCACAAAATGTGCGCTAACT
GAGTACCATACCAAATTTCAGATTCCTGGCTGGGGCTATCAAAGACCTGAAGAAGCCCAG
TAACCTTAGGAAAAGCTCCTGATTTGAATAAAGCATACAAATCAATTNTATCTGGCATGA
ATGCAGCCAAACTCGACCCTGATGATGTATGCTCTTATCTGGCTGCCGCGATGCAGTTCT
GAGGGATCATGTC CTGAACTGTAGACTAGCTATGGAATCCTGATAGCTCGGAAGGGAG
CAAGATCACTCCGGATTCTCTTGTGGACATAAGACGTACTGATGTGGAAGGGAATTGGGC
CTAACAGGGGGCATGGAGTTGACAAGGGACCCTACTGTTTCAGAGCATGCATCTCTGGTT
GGCCTTCTCTTGAGTTTATATAGGTTGAGCAAAATCTCCGGGCAGAATACCGGCAATTAC
GACAAACATCGCGGATACGAATAGAGCAGATTTTTGAGACAGCCCCCTTTGCAAAAATC
AGAACATCATACTTTGATGACGACCCACAAAATGTGCGCTAACTGGAGTACCATACCAAA
?
ACTGTTTCAGAGCATGC
CTCTCTCTCGACCCTACTGTTTC
CTGAGGACTG
CTGAGGACTG
CTGAGGACTG

71. Microssatélites

72. Consistem de pequenas seqüências (“sequence
motif”) com 1 a 4 nucleotídeos de comprimento,
repetidas em tandem.
Mononucleotídeos
TGCATTGAAAAAAAAAAAAAAACTGGATC
Dinucleotídeos
TGCATTGTATATATATATATATACTGGATC
Trinucleotídeos
TGCATTGTGATGATGATGATGACTGGATC
Tetranucleotídeos
TGCATTGTGACTGACTGACTGACCTGGATC

73. Características
M
homozigoto
heterozigoto
M
homozigoto
heterozigoto
Marcador co-dominante
Marcador multialélico

75. Detecção de locos SSR
CACACA
GTGTGT
CACACA
GTGTGT
(CA)3
(CA)3
CACACA
GTGTGT
CACACACACA
GTGTGTGTGT
(CA)3
(CA)5
CACACACACA
GTGTGTGTGT
CACACACACA
GTGTGTGTGT
(CA)5
(CA)5
Amostra 1 Amostra 3Amostra 2

76. 5´
5´ 3´GTGTGTGTGT
CACACACACA
GTGT
3´
Taq
iniciador reverse
iniciador forward
P2
GTGTGT5´ 3´
3´ CACACA 5´
P2
P1
P1
GTGTGTGTGT5´ 3´
3´ CACACACACA 5´
F1
F1
5´ 3´
3´
GTGTGTGTGT
CACACACACA 5´
5´ 3´
3´
GTGTGT
CACACA 5´
Na recombinação dos alelos

77. Microsatélites
• SSR – Simple Sequence Repeats
– Pequenas sequências (“sequence motif”) com 1 a 4
nucleotídeos repetidos em tandem - Amplificados via
PCR
– Classe de marcadores moleculares mais polimórficos
SinonimiasSinonimias
SSR (Simple Sequence Repeats);SSR (Simple Sequence Repeats);
STMS (Sequence Tagged Microsatellites);STMS (Sequence Tagged Microsatellites);
SSLP (Single Sequence Length Polymorphisms);SSLP (Single Sequence Length Polymorphisms);
Onde são encontrados ???
Mamíferos: (CA)n ( 50.000 a 100.000 vezes no genoma)
Plantas: (AT)n
Mitocôndrias
MICROSSATÉLITES

78. Aplicações dos Microssatélites
Genetic Characterization of Active
Bank of Germoplasm of Pineapple
Guava (Acca Sellowiana) by
transfer of markers Microsatellites
of Eucalyptus spp
Karine Louise dos Santos1
, Leocir José
Welter1
, Adriana Cibele de Mesquita
Dantas1
, Jean Pierre Ducroquet2
,
Rubens Onofre Nodari1
1Laboratório de Fisiologia do Desenvolvimento
e Genética Vegetal, CCA/UFSC, Florianópolis,
SC, Brasil
2 Estação Experimental de São Joaquim,
Epagri, São Joaquim, SC, Brasil

79. Modelos para explicar os processos mutacionais
envolvidos na formação das repetições
•Escorregões da DNA polimerase
•Crossing over desigual
Como os microsatélites são formados ?

80. Fita nascente
Fita molde
Replicação
+1 repeat -1 repeat
Slippage
Misalignment

81. Se você escolheu os microssatélites como
marcador molecular para o seu estudo
a primeira coisa a fazer é verificar se já
existem microsatélites para a sua espécie
no GenBank.
Se não, existem você terá que desenvolve-los !

82. SEQUENCIAMENTO
animação

83. Microsatélites em sequências

85. DNA cromossômico
gene
Restrição
com endonuclease
(1 ou mais)
Separação por eletroforese
PCR-RFLP
animação

86. Alelo S-Rnases – marcador específico

87. Superfície
estigmática
Auto-incompatibilidade Gametofítica
Estilete
CELSO L.DE ALBUQUERQUE JUNIOR (2004)

88. Compatibilidade Gametofítica
CELSO L.DE ALBUQUERQUE JUNIOR (2004)

90. Análise das marcas específicas

92. AFLP (Amplified Fragment Length
Polymorphism)
Zabeau (1993), Vos et al. (1995)
O ensaio combina a especificidade, resolução e poder de
amostragem da digestão de enzimas de restrição com a
velocidade e praticidade de detecção do polimorfismo via PCR
Co-amplificação específica de um grande número de fragmentos
de restrição
Tipicamente 40-100 fragmentos são amplificados e detectados
em gel de poliacrilamida
Esta característica também é chamada de “índice de multiplex
do ensaio AFLP ”

94. AATTCA --------GTTA
TTAAGT---------CAAT
Pré-amplificaçãoPré-amplificação
EcoREcoR II primerprimer E-E-A
MseMse II primerprimer M -M - CC
5´------GAATTC --------TTAA-----3´
3´------CTTAAG---------AATT-----5´
AATTC --------T
G---------AAT
AATTC --------TTA
TTAAG---------AAT
Ligação de adaptadoresLigação de adaptadores
MseMse I adaptadorI adaptadorEcoREcoR II adaptadoradaptador TATTA
A
5´------GAATTC --------TTAA-----3´
3´------CTTAAG---------AATT-----5´
MseMse IIEcoREcoR II
Digestão do DNADigestão do DNA
MseMse II primerprimer M -M - CAC
AATTCAACA -----------GTGGTTA
TTAAGTTGT------------CACCAAT
EcoREcoR II primerprimer E-E- ACA
AmplificaçãoAmplificação

95. Vantagem é indiscutivel
-Grande número de fragmentos
-Número de marcadores simultâneos analisados
-Facilidade e rapidez com que é realizado,
-Alta resolução e repetitivo
Desvantagem
-Discriminar o heterozigoto dos homozigotos.
AFLP

96. S C M
Progênie F1 (Santa Rosa x Chatard)
Marcas segregantes

97. Excelente = Saturar mapas genéticos
840 marcadores
475 AFLPs
235 RAPDs
129 SSRs

98. SCARs (Sequence characterized amplified
RAPD)
Desenvolvimento de um SCARDesenvolvimento de um SCAR
1) identificação de um iniciador que confere
polimorfismo a dois bulks de DNA com fenótipos
contrastantes,
2) o isolamento e a clonagem do fragmento
amplificado em um vetor (plasmideo),
3) sequenciamento do fragmento isolado,
4) desenho dos iniciadores de tamanho maior que
os decâmeros
5) teste final (Paran e Michelmore, 1993).

99. Bulk resistentes Bulk suscetíveis
Padrão de banda dos Bulks
1
2
3
4
5
P1
(Resistente)
P2
(Suscetível)
Seleção de indivíduos F1 expressando
o carater de resistência
Seleção de indivíduos F1 expressando
o carater de suscetibilidade
Extração de DNA Extração de DNA
Mistura equitativa de DNA Mistura equitativa de DNA
Análise de RAPD dos
indivíduos e confirmação
entre o marcador
detectado nos bulks e a
expressão do carater
1
2
3
4
5
DNA de indivíduos da
população que são resistentes
(todos possuem a banda 3)
DNA de indivíduos da
população que são suscetíveis
(nenhum possui a banda)

101. Atributos Isoenzimas
Proteínas
de sementes RFLPs RAPDs Microssatélites AFLPs
Nível de
Polimorfismo
baixo alto baixo-alto baixo-alto muito alto muito alto
Estabilidade
ambiental
moderada alta alta alta alta alta
Número de locos moderado (<50) baixo (<10) alto alto alto alto
Expressão genética co-dominate co-dominante co-dominante dominante co-dominante dominante
Número de alelos por
loco
2-5 multialélico multialélico 2 multialélico 2
Distribuição no
genoma
regiões de cópia
única
regiões de cópia
única
várias ao acaso ao acaso ao acaso
Acessibilidade
tecnológica
muito alta muito alta média muito alta muito baixa média
Aplicabilidade no
melhoramento
rápido,
baixo custo
rápido,
baixo custo
lento,
custo médio
rápido, baixo
custo
lento, custo alto rápido, custo
baixo
Identificação de
genótipos
baixa baixa alta muito alta muito alta muito alta
Avaliação de
germoplasma
média baixa alta alta alta muito alta
Mapeamento
genético
baixa muito baixa alta alta muito alta alta
Mapeamento de
regiões específicas
baixa inadequado média muito alta média muito alta
Mapeamento
comparativo
baixa inadequado muito alta baixa alta baixa
Genética de
Autógamas
baixa baixa média alta muito alta muito alta
Genética de
Alógamas
média baixa média alta muito alta muito alta
Análise Filogenética média baixa muito alta média alta média
Adaptado de Gepts (1993) e Ferreira & Grattapaglia (1995).

102. Abordagem Estratégias
Diversidade genética Alozimas
Filogenia
Fluxo gênico
Análise de paternidade
RAPD
AFLP
SSR
Limitações
Financeira
Biblioteca
genômica
Amostragem
Mapeamento genético

104. RGAs (Resistance gene
homologues)
P-loop
RNBS-A
Não TIR
RNBS-A
TIR
Kinase-2
W/D
GLPL
RNBS-D
Não TIR
RNBS-D
TIR
N-terminal C-terminal
Motivos exclusivos TIR
Motivos exclusivos não TIR
Motivos TIR e não TIR
Primers Sense Motivos Sequencia 5’- 3”
39F1 P-loop (n-terminal): TCATCAAGGACGAGCTGARWBNATGMA
P1a P-Loop GGIATGCCIGGIIIIGGIAARACIAC
P3a GLPL AIITYIRIIR YIAGIGGYAA ICC
LM638 P-loop GGI GGI GTI GGI AAI ACI AC
1F P-loop-GKTT GGCGGGGTGGGCAARACNACNHT
P1c P-loop-GKTT non TIR
Arabidopsis GGICGICCIGGIIIIGGIAARACIAC
3F2 kinase GAGGTACTTCCTGGTGCTGGAYGAYRTBTG
2F nbs-2 AACGGCTGCAGGATCATGRTBACHACHMG
OLE 1121 P-loop GGWATGGEGGWRTHGGWAARACHAC
Primers antisense Motivos Sequencia 5’- 3”
P1b P-loop GGIATGGGIGGIIIIGGIAARACIAC
P3d GLPL AIITYIRIIR YYAAIGGIAG ICC
RNBS-D GGR AAI ARI SHR CAR TAI VIR AAR C
1R1 P-loop CGTGCTGGGCCAGGGTNGTYTTNCC
P3b GLPL – non TIR Arabidopsis AIITYIRIIRYIAGIGGIAGICC
13R1 GLPL – C-terminal CGGCCAAGTCGTGCAYVAKRTCRTGCA
11R1 GLPl – C-terminal TCAGCTTGCCGATCCACTYDGGSAGBYT
OLE 122 GLPLAL ARNWYYTTVARDGCVARWGGVARWCC
Primers Sense Motivos Sequencia 5’- 3”
39F1 P-loop (n-terminal): TCATCAAGGACGAGCTGARWBNATGMA
P1a P-Loop GGIATGCCIGGIIIIGGIAARACIAC
P3a GLPL AIITYIRIIR YIAGIGGYAA ICC
LM638 P-loop GGI GGI GTI GGI AAI ACI AC
1F P-loop-GKTT GGCGGGGTGGGCAARACNACNHT
P1c P-loop-GKTT non TIR
Arabidopsis GGICGICCIGGIIIIGGIAARACIAC
3F2 kinase GAGGTACTTCCTGGTGCTGGAYGAYRTBTG
2F nbs-2 AACGGCTGCAGGATCATGRTBACHACHMG
OLE 1121 P-loop GGWATGGEGGWRTHGGWAARACHAC
Primers antisense Motivos Sequencia 5’- 3”
P1b P-loop GGIATGGGIGGIIIIGGIAARACIAC
P3d GLPL AIITYIRIIR YYAAIGGIAG ICC
RNBS-D GGR AAI ARI SHR CAR TAI VIR AAR C
1R1 P-loop CGTGCTGGGCCAGGGTNGTYTTNCC
P3b GLPL – non TIR Arabidopsis AIITYIRIIRYIAGIGGIAGICC
13R1 GLPL – C-terminal CGGCCAAGTCGTGCAYVAKRTCRTGCA
11R1 GLPl – C-terminal TCAGCTTGCCGATCCACTYDGGSAGBYT
OLE 122 GLPLAL ARNWYYTTVARDGCVARWGGVARWCC

105. M 39F1/1R1
F G Br Bs A
2F/13R1
F G Br Bs A
RGAs polimórficos

106. Sequenciamento e alinhamento dos motifs

107. Aplicações

109. Genes diferencialmente
expressos
Biblioteca de frruto suscetívelBiblioteca de fruto resistente
Genes exclusivos de uma forma
Genes comuns
Determinando o perfil de expressão gênica e
identificando genes diferencialmente expressos

110. • Determinação da função de um gene
• Caracterização de um estádio de
desenvolvimento ou fisiológico
• Caracterização de elementos regulatórios
Por que?

111. Técnicas disponíveis
• Seleção diferencial e hibridização subtrativa (Sambrook et al., 1989)
• cDNA-AFLP (Bachem et al.,1996)
• Differential Display Reverse Transcription PCR - (DDRT-PCR)
(Liang and Pardee., 1992)
• RFLP-coupled differential display (RC4D) (Fischer et al., 1995)
• Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) (Velculescu et al., 1995)
• Macroarrays (Chen et al., 1998)
• Microarrays (Schena et al., 1995)

112. ESTs (Expression Sequences
Tags)
AAAAAAAAA TTTTTTTTT
RT
PCR
Clonagem
Seqüenciamento
Extração RNAm + Oligo (dT)
cDNA

113. cDNA“tester“com adaptador 1 R cDNA“tester“com adaptador 2 RcDNA“Driver”
(em excesso)
1ª Hibridização
a
RNA mensageiro
Subtração
Ligação dos
adaptadores
cDNA
Digestão comRsaI
a, b, c, d + e
2ª Hibridização: mistura de amostras,
adição de “Driver” desnaturado eanelamento
Preenchimento dos terminais
d
b
c
a
d
b
c
e
Adição de “primers”
Amplificação por PCR
a e d - nenhuma amplificação
b- b’ - nenhuma amplificação
c - amplificação linear
e -amplificação exponenciale
5’
5’
3’
3’
Construção de bibliotecas Subtrativas
Tester
RNA tecido A
Driver
RNA tecido B
cDNA
Digestão com Dpn II
Ligação ao oligo A Ligação ao oligo B
Hibridização com excesso de Driver
PCR com a utilização de iniciadores complementares ao oligo A
Amplificação seletiva dos cDNAs derivados do Tester
Clonagem em vetores e montagem da biblioteca

114. (a) (b)(a) (b)
Estacas enraizadas dos porta-enxertos: (a) Marubakaido (tolerante) e (b) M9 (sensível) em
Al3+
I dentificaI dentificaçãção dos genes induzidos pelo alumo dos genes induzidos pelo alum íínio emnio em áápicepice
radicular de portaradicular de porta--enxerto de macieiraenxerto de macieira
DANTAS, ACM1; STOLF, EC1; GUI MARÃES, CT2; CARNEI RO, N2; PURCI NO, AA2
1 Recursos genéticos Vegetais, CCA, Universidade Federal de Santa Catarina – Florianópolis – SC.
2 Núcleo de Biologia Aplicada, Embrapa Milho e Sorgo – Sete Lagoas – MG
acmdantas@cca.ufsc.br
Clone Sequenciamento Sequences producing significant
alignments:
e value
C5 A10 hypothetical protein [Erwinia amylovora]. 3e-13
C5 A10 putative reverse transcriptase [Cicer
arietinum]
3e-13
F6 B10 formate dehydrogenase beta-subunit
[Methanococcus voltae]..
1e-10
C8 C10 Catalase 8e-11
C9 D10 class III chitinase [Sphenostylis stenocarpa]. 7e-06
D8 E10 Catalase 3e-11
G8 F10 Structural Analysis Of The Spiroplasma Virus 3e-40
E10 H10 IntI [Citrobacter freundii] 2e-13
Clone Sequenciamento Sequences producing significant
alignments:
e value
C5 A10 hypothetical protein [Erwinia amylovora]. 3e-13
C5 A10 putative reverse transcriptase [Cicer
arietinum]
3e-13
F6 B10 formate dehydrogenase beta-subunit
[Methanococcus voltae]..
1e-10
C8 C10 Catalase 8e-11
C9 D10 class III chitinase [Sphenostylis stenocarpa]. 7e-06
D8 E10 Catalase 3e-11
G8 F10 Structural Analysis Of The Spiroplasma Virus 3e-40
E10 H10 IntI [Citrobacter freundii] 2e-13

115. cDNA-AFLP

116. cDNA-AFLP
Vantagens:
• Alta reprodutibilidade;
• Poucos falso positivos;
• Necessita de pequenas quantidades
iniciais de RNA.
Desvantagens:
• O cDNA precisa conter o sítio de
restrição da enzima utilizada.

117. DDRT-PCR
(Differential Display Reverse Transcription PCR)

119. SNPs
(Single nucleotide polymorphisms)
5’ leader Coding sequence
(exons)
3’ end Poly-A
Seqüênciamento 5’Seqüênciamento 5’
Seqüênciamento 3’Seqüênciamento 3’
Polimorfismo de um único nucleotídeo
I.G. Gut, Automation in genotyping single nucleotide
polymorphisms. Hum. Mutat. 17 (2001) 475–492.

120. detectar a variação de seqüência na janela de um
alinhamento de ESTs de um mesmo gene, parcialmente
sobrepostas
SNPs - Princípio
Variações mais frequentes no genoma: 1 substituição a cada 31
pb não codificadora e a cada 124 pb em regiões codificadoras

121. Detecção e validação de SNPs

122. Princípio da genotipagem
TTACGCATAACCTATCGAATTCCATCGCATCGA1. PCR amplificação
2. Restrição do produto PCR com a enzima adequada (ex: EcoRI, GAATTC)
TAACCTATCGAATTCCATCG
C
SNP site
TAACCTATCGACTTCCATCG
Se ‘A’ está presente ocorre
a restrição
Se ‘C’ está presente, não ocorre
a restrição
-
+
N R -
+
N R

123. Análise Molecular de OGMs

124. Identificação Molecular
Análise de DNA
- PCR
- Southern Blot
- Real Time PCR
- Arranjos
Análise de Proteína
Baseadas em imunologia
- ELISA
- Western blot
- Proteoma

125. 4. Hibridização da membrana
com a sonda específica
Retirada da
membrana
com o DNA
Hibridização
da membrana
com sonda
radioativa
Solução de
transferência
Esponja
Gel
Membrana de Nylon
Papel para
Absorção
3. Transferência do DNA para a
membrana de nylon (Blotting)
2. Eletroforese DNA em Gel
de Agarose
5. Revelação do autoradiograma
Retirada das hibridizações
não específicas
1. Digestão do DNA com
enzimas de restrição
Southern Blot

126. Análise Molecular
Digestão com EcoRI e hibridação
com sonda específica para
sarcotoxin IA
PCR
Southern blot

127. Análise do fenótipo
Sintoma aos 25 dias após
inoculação (104
CFU/ml)
stx-5Controle
Western blot

128. Real Time PCR
Resultados após amplificação
Análise da Expressão de Genes

129. Arranjos de DNA
Aumento do número de
genes
chips de DNA
diferentes seqüências para
detectar genes expressos ou
introduzidos em plantas

130. Biblioteca
Estoque de bactéria
em glicerol (96 ou 384-well )
Amplificaç ão de PCR
Diretamente do estoque
Usando iniciadores SP6-T7
em placas 96-well
Mantagem em placas
384-well
Gotas em matrizes
Sobre lâminas de
vidro
Impressão do chip DNA

132. Proteoma
Levantamento quantitativo de proteínas/peptídeos em uma
amostra para identificar mudanças de interesse
Proteoma Genoma
Proteínas e peptídeos
Dinâmico
Células e tecido específicos
DNA
Estático
Orgão específico

133. Separação e preparo de amostraSeparação e preparo de amostra
Digestão - tripsina
Peptídeo
Separação