1) O documento descreve técnicas de amplificação de ácidos nucleicos, incluindo a reação em cadeia da polimerase (PCR) que envolve desnaturação, hibridação e extensão. 2) A PCR em tempo real permite monitorar a amplificação em tempo real através da detecção da fluorescência dos produtos da reação. 3) Outras técnicas incluem a amplificação baseada na sequência dos ácidos nucleicos e a amplificação mediada por transcrição.

1. TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇAO DE
ÁCIDOS NUCLÉICOS
RÉKA M. CANE

2. TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇAO DE ÁCIDOS NUCLEICOS: REACÇAO EM
CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
 Repetiçao de 3 processos/ etapas:
1º Desnaturalizaçao térmica do DNA.
2º Hibridaçao dos cebadores especificos (oligonucleótidos)
com o DNA de cadeia simples.
3º Extensao enzimática do DNA.
PASSO 1:
DESNATURALIZAÇAO
PASSO 2: HIBRIDAÇAO
PASSO 3: EXTENSAO

3. MATERIAIS NECESSARIOS PARA A PCR
Oligonucleótidos
Tampao de
reacçao
Termociclador com sistema de
detecçao
 É necessario separar as zonas de preparacao das amostras, dos reactivos,
amplificaçao e detecçao.
 Devem-se fazer os controis positivo e negativo em cada ronda das reacçoes.

4. LEITURA E INTERPRETAÇAO DA PCR CONVENCIONAL
Separaçao electroforética dos fragmentos amplificados – Gel de Agarosa
1º
Tinçao com bromuro de etidio
2º
Transiluminaçao com luz ultravioleta
3º

5. PCR EM TEMPO REAL
 Termociclador associado a um fluorímetro.
 A medida que os amplicones vao sendo produzidos, emitem
fluorescencia.
 Permite quantificar, detectar mutaçoes (por discriminaçao
alélica) e caracterizar os productos da PCR.
 Métodos de deteçao:
 Sondas Fret  Hibridaçao de sondas especificas marcadas
com 2 fluorocromos (Annealing).
 Sondas Taqman  Sondas específicas com um fluorocromo
em cada extremo (Elongaçao).
CEPA SELVAGEM
HETEROZIGOTO
VANTAGEMS DA PCR EM TEMPO REAL
 Diminui o tempo de análisis;
 Reaçao monitorizada a tempo real;
 Menor risco de contaminaçao (ausencia da etapa de processamento post-PCR);
 Ciclos de amplificaçao más rápidos;
 Alta especificidade e reproduzibilidade.
HOMOZIGOTO

6. TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇAO DE ÁCIDOS NUCLEICOS NAO BASEADAS NA REACÇAO
EM CADEIA DA POLIMERASE
AMPLIFICAÇAO BASEADA NA SEQUENCIA DOS ÁCIDOS NÚCLEICOS (NASBA)
* Coordenaçao de 3 enzimas con 2 cebadores especificos para a sequencia diana.
Ex: NucliSens (HIV,CMV).
AMPLIFICAÇAO MEDIADA POR TRANSCRIPÇAO (TMA)
* Transcriptase inversa, RNA polymerase, 2 cebadores complementarios do ácido núcleico
diana;
* Extensao exponencial do RNA.
Ex: GenProbe (HIV, Mycobacterium, C. trachomatis, N. gonorrhoeae).
AMPLIFICAÇAO POR MOVIMIENTO ESTÁNDAR
* 1º Formaçao do ácido núcleico diana de cadeia simples + 2º Ampificaçao exponencial do
ácido núcleico diana.
Ex: BD Probe Tec System ( C. trachomatis, N. gonorrhoeae).

7. GENPROBER APTIMA COMBO2 assay
 Combina a técnica de amplificaçao mediada por transcripçao
(TMA) com a tecnologia de ensaio dual cinético (DKA).
 Captura selectiva - as sondas de captura hibridam com um
control interno e com as moléculas rRNA diana. O material
nao unido e os possiveis inhibidores da reaçao eliminam-se
mediante lavagem.
 Transcriptasa inversa – cria uma copia do DNA (cDNA) do
ácido núcleico selecionado.
 RNA polimerase – inicia a transcripçao, sintetiza RNA. Os
nuevos RNA servem de molde para nuevos ciclos de
amplificaçao.
 Sondas marcadas com éster de acridinio – hibridam com os
productos da amplificaçao.
 DKA – permite a deteçao simultanea do control interno y do
RNA mediante a produçao de um flash de luz e de uma
incandescencia de longa duraçao (quimioluminiscencia).
1º Preparaçao do equipamento.
-Ajuste da temperatura: *62oC; *42oC; 62oC.
-Limpeza de superficie e pipetas (lejía + agua 1:1).
-Preparar o sistema de captura diana: verificar as
garrafas de lavagem e a conexao do aspirador a
bomba de vazio.
2ºPreparaçao do reagente de constituiçao.
- Seguir instruçoes do fabricante.
- Preparar o reagente de captura diana (TCR) e o
reagente de captura diana B (TCR-B):
V(TCR) = (nº reaçoes + 5 reaçoes extra) x0,1mL
V(TCR-B) = V(TCR) mL/100
3º Captura diana.
4º Amplificaçao.
5º DKA.
6ºInterpretaçao dos resultados
- Para todas etapas: seguir instruçoes do
fabricante (varia em funçao do tipo de
amostra).