O documento descreve o processo de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), incluindo seu histórico, objetivo, etapas e aplicações. A técnica amplifica seletivamente sequências de DNA in vitro através de ciclos de desnaturação, anelamento e extensão controlados por temperatura. Isto permite a produção de muitas cópias de um fragmento de DNA específico.

1. TRABALHO DE BIOLOGIA 4º BIMESTRE
ENGENHARIA GENÉTICA
TEMA: REAÇÃO EM CADEIA DA
POLIMERASE (PCR)
Flora Bello Milanez, 10054
Guilia Russon, 10056
Larissa Brabo, 100--
Leticia Gonçalves de Mattei,10064
Maiara Emer, 10066
Marina Morais Tófili, 10069
Sabrina Ultremare, 10077

2. HISTÓRICO
• 1983 - O processo de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR,
do inglês Polymerase Chain Reaction) foi descrito por Kary
Mullis;
• 1989 - A Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation
patenteou este processo;
• 1993 - K. Mullis recebeu o Prémio Nobel da Química pelo seu
trabalho.

3. O QUE É A REAÇÃO EM CADEIA DE
POLIMERASE?
A técnica de biologia
molecular por PCR
promove, in vitro, a
duplicação de cadeias de
DNA, envolvendo
nucleotídeos, sequências
iniciadoras (primers) e
enzimas polimerases
(enzima que catalisam a
reação de polimerização de
ácidos nucléicos a partir
dos seus monômeros).

4. OBJETIVO DA PCR
É a obtenção de muitas cópias de uma
sequência específica de ácido nucléico, a
partir de uma fita molde, ou seja, consiste na
produção de DNA, in vitro.

5. COMO É FEITO?
A reação de polimerização em cadeia é realizada
pelos seguintes passos:
 Em primeiro lugar, deve-se extrair o material
genético (DNA) da célula ou outro material a ser
estudado como, por exemplo, vestígios de crimes.

6. COMO É FEITO?
 Após esta extração, o DNA é colocado em
microtubo de ensaio juntamente com a
enzima taq polimerase, nucleotídeos, os
primers complementares a sequência de
DNA, Mg ²+ e solução tampão.

7. COMO É FEITO?
 Coloca-se o micro tubo de ensaio em uma
máquina termocicladora que possui como
função fazer ciclos de temperaturas pré-
estabelecidos com tempos exatos específicos
para as reações seguintes da análise.

8. COMO É FEITO?
No termociclador ocorrerá um ciclo com 3 etapas:
desnaturação, anelamento e extensão. Isso
acontecerá repetidas vezes com alternância de
temperaturas a cada ciclo como descreve o gráfico
abaixo:

9. ETAPAS DO
CICLO
1. Desnaturação
2. Anelamento
3. Extensão

10. Desnaturação:
Inicialmente o termociclador irá elevar a temperatura da
mistura de 90 a 95 ºC o que irá promover a separação
da fita dupla de DNA em duas fitas simples através da
quebra das pontes de hidrogênio.
Muitas vezes a temperatura de desnaturação é
determinada empiricamente e depende de alguns
fatores como a quantidade de guanina e citosina (GC)
do fragmento DNA alvo ou de interesse.

11. Anelamento:
Cada fita simples do DNA que foi desnaturado
serve de molde para a síntese de novas
cadeias complementares. Para isso resfria-se a
54ºC onde os primers se anelam as duas fitas
simples, servindo de iniciadores para a enzima
polimerase.

12. SEQUENCIAMENTO DE DNA PELO
MÉTODO DE SANGER:
Antes de entendermos o processo de
sequenciamento de DNA, é importante
relembrarmos a estrutura dessa molécula:

13. Extensão:
Aquece-se novamente o tubo a 72ºC (temperatura
ideal de funcionamento da Taq polimerase) para a
duplicação da fita. A Taq polimerase inicia, após o
final do primer, a colocar os nucleotídeos livres na
fita de DNA ligando-os por complementaridade,
formando assim uma nova fita dupla.

14. Estas 3 etapas acontecem repetidas vezes até a
formação de milhares de novas fitas de DNA. Ou
seja, após cada ciclo descrito a cima, o número de
fragmentos se duplica: de 1 forma-se 2, e então
novamente 4, 8, 16, 32, 64, 128... de tal forma que
pode ser definida matematicamente por:
N= No x 2n
N = número de moléculas amplificadas
No = número de moléculas iniciais
n = número de ciclos de amplificação

16. ANIMAÇÕES : ETAPAS DO CICLO

18. COMO É FEITO?
 A leitura dos resultados através do método de eletroforese
em gel de agarose:

19. COMO É FEITO?
 Após a eletroforese em
gel, os fragmentos de
DNA normalmente são
corados com brometo
de etídeo, que possui
afinidade pelo DNA e
fluorece (torna-se
visível) em contato com
a luz ultravioleta
(procedimento realizado
em câmera escura).

20. VANTAGENS DA TÉCNICA:
Não é necessário isolar o DNA que se
pretende amplificar;
Capacidade de amplificar uma sequência
precisa de DNA;
 Rápida;
De baixo custo;
 Segura.

21. LIMITAÇÕES:
 Necessidade de conhecer a sequência de DNA a
amplificar para que possam ser
sintetizados primers específicos;
 Facilidade de contaminação da amostra;
 Extensão limitada da sequência a se amplificar;
 Limitada extensão da sequência;
 Incorporação errônea de bases durante a
replicação;
 Substâncias que conhecidamente inibem a reação,
como é o caso da hemoglobina.

22. CURIOSIDADE:
O grande problema inicial foi a desnaturação
seguida da enzima polimerase, que, obtida
de Escherichia coli, não suportava a temperatura
para abertura das fitas de ácidos nucléicos. Assim,
a cada ciclo, uma nova quantidade de enzima
deveria ser adicionada.
Em 1988, contudo, Randall Saiki e colaboradores
substituíram a polimerase de E. coli pela já
conhecida Taq polimerase, polimerase da
bactéria Thermus aquaticus, que vive em águas
quentes de gêiseres e vulcões submersos, e
possui um ponto de crescimento ótimo entre 70 e
75ºC.

23. PRINCIPAS USOS DA PCR

25. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
• Anthony J.F. Griffiths, Jeffrey H. Miller, David T. Suzuki, Richard C. Lewontin, William M. Gelbart, “An
introduction to genetic analysis”, 7th edition Freeman, 1999;
• Attila G, Yalin S, Tuli A, Yalin E, Aksoy K. (1999); “Prenatal diagnosis of sickle cell anemia in twin
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Biochemistry; Disponível em:<www.pubmed.com > Acesso em: 30 set.2012;
• BIOMEDICINA PADRÃO - Disponível em:
<http://www.biomedicinapadrao.com/2011/10/reacao-em-cadeia-da-polimerase-pcr.html> Acesso em: 30
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• GOOGLE IMAGENS - Disponível em:
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26. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
• GOOGLE IMAGENS - Disponível em:
< http://www.google.com/imgres?q=PCR+gif&um=1&hl=pt-
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• H. Serap Kalkanoglu et al, “Evaluation of a fetus at risk for dihydropteridine reductase deficiency by direct
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• EBAH - Disponível em:
<http://www.ebah.com.br/content/ABAAAAJoQAB/pcr> Acesso em: 30 set.2012;
• PCR- Disponível em:
<http://pt.scribd.com/doc/15362706/Reacao-em-cadeia-da-polimerase-PCR> Acesso em: 30 set.2012;
• PORTAL EDUCAÇÃO – Disponível em: <http://www.portaleducacao.com.br/farmacia/artigos/8577/tecnica-
de-biologia-molecular-pcr-reacao-em-cadeia-da-polimerase#ixzz27yZCuuJ9> Acesso em: 30 set.2012;
• SÓ BIOLOGIA - Disponível em:
<http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Biotecnologia/PCR.php> Acesso em: 30 set.2012;