Violou moleclar

1. UNICE- ENSINO SUPERIOR
IESF – INSTITUTO DE ENSINO SUPERIOR DE FORTALEZA
GRADUAÇÃO EM FÁRMACIA
POLYMERASE CHAIN REACTION – PCR
OU
REAÇÃO EM CADEIA POLIMERASE - RCP
PROF. ESP. DANIEL RODRIGUES DOS SANTOS

2.  1987 - O processo de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR,
do inglês Polymerase Chain Reaction) foi descrito por Kary
Mullis.
 1989 - A Hoffman La Roche e Perkin-Elmer Corporation
patenteou.
 1993 - K. Mullis recebeu o Prémio Nobel da Química pelo seu
trabalho.

3. DNA POLIMERASE?

4. É a obtenção de muitas cópias de uma sequência específica
de ácido nucléico, a partir de uma fita molde, ou seja,
consiste na produção de DNA, in vitro.

5. Em primeiro lugar, deve-se extrair o material
genético (DNA) da célula ou outro material a
ser estudado.

7. • DNA-POLIMERASE: A mais usada é a taq-polimerase; É a
catalisadora da extensão dos primers; Aumento na sua
concentração pode resultar na diminuição da sua
especificidade;
• SOLUÇÃO TAMPÃO: Basicamente esta solução contém íons
diversos (Na⁺, Cl⁻,K⁺ entre outros) que otimizam as condições
da reação;

8. • MgCl₂: Doador muito estável de íons Mg²⁺, que são
cofatores indispensáveis para a atividade da enzima;
• dNTP : Desequilíbrio da misturas de dNTP reduz a fidelidade
da Taq. O dNTP reduz o Mg²⁺ livre, interferindo assim com a
atividade da polimerase e diminuindo o anelamento do
primer.

9. COMO ESCOLHER OS PRIMER’S

10. • Sintetizados quimicamente;
• 15 a 25 bases ;
• Define limites alvo a amplificar;
• Serve como ponto de início para a replicação;
• Permite a cópia das 2 cadeias simultaneamente nas duas
direções (para frente e para trás);
• Banco de Dados International Nucleotide Sequence
Database (www.insdc.org)
• GenBank (NCBI, NIH) European Molecular Biology
Laborstory (EMBL) DNA DataBank of Japan (DDBJ)

11. Coloca-se o microtubo de ensaio em uma máquina
termocicladora que possui como função fazer ciclos
de temperaturas pré-estabelecidos com tempos
exatos específicos para as reações seguintes da
análise.

13. • 1- DESNATURAÇÃO: É muito importante para que a fita do
DNA molde alvo se separem; Inicialmente o termociclador
irá elevar a temperatura da mistura de 92 a 96 ºC o que irá
promover a separação da fita dupla de DNA em duas fitas
simples através da quebra das pontes de hidrogênio.
5’ 3’
3’ 5’
92C
5’ 3’
+
3’ 5’

14. • 2-ANELAMENTO: Cada fita simples do DNA que foi
desnaturado serve de molde para a síntese de novas cadeias
complementares. Para isso resfria-se a 54ºC onde os
primers se anelam as duas fitas simples, servindo de
iniciadores para a enzima polimerase.
5’ 3’
Forward primer Reverse primer
3’ 5’

15. • 3-Extensão: Aquece-se novamente o tubo a 72 º C
(temperatura ideal de funcionamento da Taq polimerase) para a
duplicação da fita. A Taq polimerase inicia, após o final do primer,
a colocar os nucleotídeos livres na fita de DNA ligando-os por
complementaridade, formando assim uma nova fita dupla.

16. • DNA primeira copia
• PCR

17. Esquema dos processos realizados numa reação de PCR.
Após a desnaturação das fitas molde, ocorre o pareamento
dos primers. A enzima, representa em verde, adicionada os
desoxinucleotideos complementamente as fitas-mãe.

18. Passos finais de uma reação de PCR. A figura mostra as
duas fitas-mães pareadas com duas fitas-filhas
complementares, sintetizadas a partir da adição dos
desoxinucleotídeos pela DNA polimerase

19. Finalizada a PCR o próximo passo é detectar a presença de
produtos amplificados; Em geral isso é realizado pela
eletroforese em gel de agarose ou acrilamida.

20. PONTOS IMPORTANTES
PARA O BOM
FUNCIONAMENTO DA PCR

21.  Concentrações de “primers” entre 0,1 e 0,5ϻM são geralmente
ótimas. Concentrações mais altas podem resultar em acúmulo
de produtos não específicos, reduzindo a concentração do
produto desejado.
 Concentrações mais baixas podem ser esgotadas previamente
ao final da reação, resultando em baixa concentração do
produto desejado.
 A temperatura de anelamento depende do comprimento e
composiçãodos primers. Uma temperatura de anelamento
baixa demais resulta em anelamento não-específico e,
portanto, amplificação não-espeífica. Enquanto, que uma
temperatura muito alta resulta numa reduzida concentração
do produto.

22.  Para o sucesso da PCR, a seqüência gênica a ser
amplificada deve estar intacta. Uma qualidade pobre
de DNA, irá frequentemente conter iniciadores que
deveriam ser desenhados para amplificar regiões curtas
dentro do molde.
 A proporção iniciador molde influencia no método PCR
onde deve ser otimizada empiricamente. Baixa
concentração de DNA é necessária para
uma PCR ótima.
 Tipicamente, menos de 0,2ϻg de DNA pode ser
suficientemente amplificado em30 ciclos. A pureza do
molde também influencia no resultado da reação.

23. APARECIMENTO DE BANDAS
INESPECÍFICAS NA PCR O
QUE FAZER?

24. • Reduza a quantidade de DNA;
• Diminuir o tempo de anelamento da reação;
• Aumente a temperatura de anelamento;
• Reduza a concentração da enzima;
• Reduza a concentração de Mg²⁺;
• Aumento do tempo de desnaturação;
• Aumento da temperatura de desnaturação;
• Reduza o tempo de extensão;
• Reveja os desenhos dos primers.

26. A REAÇÃO ESTAVA
FUNCIONANDO ANTES,
MAS AGORA NÃO
OBTENHO NENHUM
PRODUTO. O QUE
FAZER?

27. • Tenha certeza que todos os componentes estão na reação
(tampão, DNA, primers…).
• Teste um novo Master Mix ou uma nova solução de dNTP
(são sensíveis a descongelamentos consecutivos).
• Utilize um estoque novo de primers.
• Diminua sua temperatura de anelamento,se não obtiver
nenhum fragmento verifique todas os componentes.

28. • Necessidade de conhecer a sequência de DNA a
amplificar para que possam ser
sintetizados primers específicos;
• Facilidade de contaminação da amostra;
• Extensão limitada da sequência a se amplificar;
• Limitada extensão da sequência;
• Incorporação errônea de bases durante a
replicação.

29. FIM!!