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Técnicas Básicas de Biologia
         Molecular
       Diamar Costa-Pinto
           FIOCRUZ
Visão da Apresentação
 PCR
 Bibliotecas genômica e de expressão
 Fragmentação - digestão
 Separação - eletroforese
 Clonagem molecular
 Sequênciamento
 Southern, Northern e Western blotting


                                         By Diamar
Diagnóstico do século 21
- Podemos fazer análises genômicas,
pois a maioria dos cromossomo já estão
mapeados.
- O projeto genoma tem sido uma
grande ferramenta para unir genomas e
laboratório clínico.




    Mapas Genéticos, Citológicos e
              Físicos


EST – Sequências expressas marcadas.
cDNA curtos que ligam mapas físicos a
genéticos
RFLP- Polimorfismo dos comprimentos
dos fragmentos de restrição

                                         By Diamar
Procurar um gene dentro de um genoma
humano é comparável a procurar uma pessoa
sem sobrenome em uma casa sem endereço
em uma rua desconhecida em uma cidade não
identificada de um país estrangeiro.


                            Solange Farah




                                        By Diamar
Enzimas de Restrição

1953 – a eficiência de replicação de um
bacteriófago dependia da célula hospedeira
Verificou-se, então, a presença de nucleases
Bactéria restringe o crescimento do fago e
protege o seu DNA metilando-o (modificando)
Fenômeno chamado restrição/modificação
Advento das endonucleases de restrição
Sítio é normalmente uma palíndrome



                                               By Diamar
Enzimas de Restrição
                (continuação)


Palíndrome:
              ARARA
              ARARA


              OMO
              OMO


               ANA
               ANA
                                By Diamar
Enzimas de Restrição
                  (continuação)


Reconhecem seqüências de 4 a 8 pares de
bases
Cortes com extremidades abruptas ou coesivas
Primeira letra maiúscula é gênero e as duas
outras minúsculas são espécies
 1073 – foram usadas para clonagem molecular
Pode-se recombinar DNA humano com qualquer
outra espécie
Fragmentos separados por eletroforese


                                           By Diamar
Enzimas de Restrição
          (continuação)




                          By Diamar
By Diamar
Vídeo de Enzima de
     Restrição




                     By Diamar
Eletroforese

Já conhecida desde 1930
Difundida em 1950-1960
Movimentação de moléculas submetidas a
campo elétrico
Usa um substrato: papel, agarose,
poliacrilamida
Separa proteínas por cargas e peso molecular
Separa ácido nucléicos por peso molecular



                                               By Diamar
Eletroforese




       Fonte de eletroforese
                                              Vertical
-                    +
                                     Visualização do gel de agarose

                                 -
    Horizontal


                                +                            By Diamar
Eletroforese




               By Diamar
Vídeo de Eletroforese




                        By Diamar
Clonagem Molecular

Consiste no isolamento e propagação de
moléculas de DNA idênticas

Primeiro: inserto + vetor = rDNA

Segundo: rDNA + célula hospedeira =
transformação




                                         By Diamar
By Diamar
Engenharia Genética (1970): o DNA recombinante permite isolar um
gene específico, com uma característica desejada, e transfere este
                   gene para outro organismo vivo


Célula humana                           Bactéria


                      DNA

                                           Plasmídeo


                                                        Transformação

                                                DNA da bactéria
     Digestão        Enzima de restrição
                     Tesoura genética
                                                       rDNA
                                     Clonagem

                                                   DNA da célula humana


                                                                     By Diamar
O DNA recombinante

Não se limita a organismos de uma mesma espécie



A compatibilidade sexual torna-se irrelevante


Permite modificações em uma única geração, o que
antes levaria dezenas ou centenas de gerações



                                                By Diamar
Vídeo de Clonagem
    Molecular




                    By Diamar
Vetor

São moléculas de transporte
Moléculas de DNA
Diversos tipos: plasmídeos, cosmídeos, fagos,
vírus, YACs, etc.
Diferenças de tamanho de inserto
Podem ter comportar linear e/ou circular




                                                By Diamar
Vetor
                         (continuação)

Vetores de expressão procarióticos
  Promotores fortes
  Sítios de ligação a ribossomos
  Sítios de clonagem

Vetores de expressão eucarióticos
  Origem de replicação eucariótica
  Região de controle de transcrição e tradução,
  poliadenilação de mRNA, capping
  Sinais especiais para processamento e secreção
                                                   By Diamar
Vetor
                          (continuação)


Características gerais

  Região promotora
  Sítio Múltiplo de Clonagem - Polylinker
  Gene de resistência a antibióticos
  Origem de replicação
  Gene repórter




                                            By Diamar
Vetor
                      (continuação)


PLASMÍDEOS:

Penetra naturalmente nas bactérias
Fita dupla
Circular
Extracromossômico
Resistência a antibióticos
Vetores shuttle
Insertos até 4000 pb
pUC 18, pUC 19

                                      By Diamar
Vetor
                        (continuação)

FAGOS
Vírus de bactérias
Fago λ é o mais utilizado
Fita dupla linear
Recirculariza durante a infecção na bactéria
Aceita até 20 mil pb




                                               By Diamar
Vetor
                     (continuação)

COSMÍDEOS
Pequeno tamanho 4 a 6 Kb
Engenherado: empacota rDNA no capsídeo do
fago para infectar bactéria
Possuem seqüências cos
Aceitam insertos de até 50 mil pb




                                            By Diamar
COSMÍDEOS




            By Diamar
Vetor
                                    (continuação)

         YACs (Yeast Artificial Chromosome)
          Células hospedeiras as leveduras
          Comportam-se como cromossomos
          Aceitam 400 mil pb
          Possuem seqüências de DNA específicas de
          levedura: telômero, centrômero e origem de
          replicação

ARS: Seqüência de replicação autônoma
CEN: Seqüências centroméricas



                                                       By Diamar
Engenharia Genética – Produção em série




        - Hormônio de crescimento
        - Insulina humana
        - Vacina da Hepatite B
        - Hormônio sexuais
                                      By Diamar
Sequenciamento

 Frederick Sanger (1977), Inglaterra
 Segundo Prêmio Nobel
 Síntese de DNA in vitro por término
 didesoxi
 Mapa físico dos genes e dos
 cromossomos

                                       By Diamar
Sequenciamento
            (continuação)



 Hood: Semi-automatizado (1986)
 Venter: Genoma de bactéria usando
 ddNTPs fluorescentes automatizados,
 robóticas e PCR (1995)
 Perkins-Elmer Corp: Comercializado o
 Sequenciamento totalmente automatizado
 (1999)
                                     By Diamar
Considerações
P                                                   P


    P                                   A                P                               A
                                        C
        P                                                         P                      C
            C5                BN        G                             C5           BN    G
            C4    C1                    T                             C4    C1           T
                                        U
             Ribose                                                    Pentose
            C3     C2                                                 C3     C2

        OH          OH                                            OH          OH

             NTP                                                      ddNTP (Didesoxinucleotídeo)
                                                                       dNTP
                                   O - Necessário
                                    para ligação
    Ácido ribonucleico              fosfodiéster
                                                        Ácido desoxirribonucleico
                         5’                                  3’
                                   Polimerização


                                                                                             By Diamar
Estuda a integridade da sequência de um DNA
                                          molde. Analisa diferentes tamanhos de
                                          fragmentos formados a partir de um primer e da
                                          inserção randômica de dNTPs (polimeriza) e

Sequenciamento                            ddNTPs (para a reação) em gel de poliacrilamida.


   A       C       G        T
                                          DNA molde

                                 Primer
                                     DNA polimerase



   T      G        C       A
                                           Fragmento 1
 ddNTP    dNTP    dNTP    dNTP


                  C        A
                                           Fragmento 2
                 ddNTP    dNTP



           G          C     A
                                           Fragmento 3
         ddNTP     dNTP   dNTP




                                                                                    By Diamar
Sequenciamento automatizado
Vídeo do Sequenciamento
        (Cycseqpc)




                          By Diamar
Southern Blotting
 E. M. Southern (1975)
 Fragmentos de DNA são separados em gel de
 agarose
 Transferidos para membranas por ação capilar
 DNA é desnaturado antes ou durante a
 transferência
 Sonda radioativa de DNA hibrida com o DNA na
 membrana
 Detecta polimorfismo de DNA ou mutação
                                            By Diamar
Southern blot
                Descrição:
                - Digestão do DNA em teste com enzimas
                de restrição;
                - Resolução dos fragmentos com
                eletroforese em gel de agarose;
                - Transferência do DNA para membrana de
                nylon;
                - Hibridação com uma sonda de DNA ou
                RNA marcada com radioatividade ou
                quimioluminescentes


                Aplicação: Alterações em um único
                nucleotídeos; detecção de inserções, deleções
                e rearranjos; ordenamento de fragmentos do
                DNA em um mapa físico; fragmentos de
                cromossomo.


                Com o advento da PCR seu uso tornou-se
                limitado.




                                                   By Diamar
Southern blot




                           46, XY.Síndrome da insensibilidade
                           androgênica. Vagina em fundo de
                           saco, sem útero ou tubas uterinas.
                           1:20.000. Testículos no abdome ou     Exemplo da especificidade das
                           canal inguinal (confundidos com                 sondas.
Sonda de cDNA para o
                           hérnias, na infância). Defeito
gene humano ligado ao X
                           molecular:    varia   de    deleção
de receptor de andrógeno
                           completa do gene a mutações de
hibridando no genoma
                           ponto nos domínios de ligação de
digerido do paciente.
                           andrógenos ou ligação ao DNA da
                           proteína receptora de andrógeno.
                                                                                        By Diamar
Vídeo de Southern blot
    (DNA _DetectivePC)
Northern blotting
 Corrida de RNA totais ou mRNA em gel de
 agarose
 RNAs devem ser desnaturados (formaldeído)
 Sensibilidade a RNAses
 Transferência para membrana por ação capilar
 Sondas de RNA ou DNA para hibridar



                                                By Diamar
Northern blotting
             (Continuação)



 Úteis em estudo de expressão gênica
 Estudo de diferentes tecidos
 Estuda o padrão temporal de expressão
 de genes durante o crescimento do
 indivíduo



                                         By Diamar
Northern blotting


                                                      Marcadores
                                                        rRNA




RNAs totais de raízes (R), folhas (L) e flores (F).
    A – sonda de α-tubulina – hibrida todos
    B - sonda de α1- tubulina – hibrida só flores
    C - sonda de α3- tubulina – hibrida todos
                                                             By Diamar
Western blotting
 Corrida de proteínas em gel de poliacrilamida
 Separação e caracterização de proteínas
 Uso de SDS (sódio dodecil sulfato) para
 desnaturação
 Transferência para membrana por força elétrica




                                              By Diamar
Western blotting
                (continuação)



 Proteína alvo é identificada por anticorpo mono
 ou policlonal
 Revelação do sistema com anticorpo secundário
 fluorescente ou radioativo
 Informa o tamanho e a quantidade das proteínas




                                              By Diamar
Western blotting




                   By Diamar
Western blotting
                   Análise de proteínas por anticorpos específicos após
                      eletroforese e transferência para membrana.




                                                                By Diamar
Vídeo Immunoblotting
     (3EIMMBLOT)
RFLPs
Polimorfismo dos comprimentos dos
     fragmentos de restrição

Uso de enzimas de restrição
Produção de fragmentos de DNA de tamanho
adequados para serem utilizados
 As Enzimas de restrição são: previsíveis, pouco
frequentes e clivam fragmentos sítio-específicos de
DNA
Aplicação: compara alelos normais e afetados para
cada mutação estudada.
Mapa de Restrição




                    By Diamar
PCR - RFLP




             By Diamar
RFLPs
Polimorfismo dos comprimentos dos
     fragmentos de restrição




       Um caso de erro inato do metabolismo:
      G-6-P-D (glicose-6-fosfato-desidrogenase)
                                                  By Diamar
RFLP de Planta

                  DNAs genômico de
                 Arabidopis é digerido
                     com EcoRI.
                  Southern blotting
                  com sonda azul e
                       verde.
                   F1 é heterogênio
                 possui fragmentos de
                 ambos os genitores.
                   F1 autopoliniza:
                    1:2:1 Ecotipo
                    diferentes: C-
                    Colombia, N-
                 Niederzenzes e H –
                    Heterozigoto.
Oligonucleotídeo alelo-
    específico (ASO)



                                                Descrição:
                                                - Hibridação preferencial de sonda
                                                marcada para testar DNA com composição
                                                de bases complenmentar única.


                                                Aplicação:
                                                - Alelos de composição conhecida.




Mutação é conhecida. Revela uma única
alteração de base. Distingue hetero ou
homozigotos para a sequência. A análise é
restrita a mutação familiar conhecida ou para
distúrbios genéticos com nº finito de
mutações diferentes. Ex: beta-talassemia.
                                                                                    By Diamar
FISH
Hibridação in situ com fluorescência

  Detecta DNA localizados dentro de cromossomos
  Usa lâminas de microscopia
  Cromossomos estão em metáfase, anáfase e
  interfase
  Usa sondas de DNA específicas




                                              By Diamar
FISH
               (Hibridação in situ com fluorescência)




            Prader-Willi: Imprinting genômico deleção no
                     cromossomo 15 paterno.




By Diamar
By Diamar
                            FISH
            (Hibridação in situ com fluorescência)

                  Relação evolutiva
                 entre cromossomos.
                    DNA de gibão
                    Hylobates lar
                  sondado com DNA
                      Humano.
                    Setas indicam
                  cromossomo 8 do
                       gibão.




                      Cromossomo
                    humano 4 hibrida
                    com cromossomo
                  (laranja) do macaco
                     verde africano.


                                        Evolução cromossômica em mamíferos
SSCP
                        Single-strand conformational polymorphism

              Polimorfismo Conformacional da Fita Simples

  Método baseado na
mobilidade eletroforética.
                                                                    Protocolo Básico

    Gel não desnaturante.                                              PCR do gene alvo.

   Sensível para                                                       DNA desnaturado.
tamanho e forma da fita
                                                                       (eletroforese)
simples.
                                                                       Mobilidade diferente
   Detecta a mudança                                                da normal indica
de uma base.                                                        mutação.




                                                                                    By Diamar
SSCP
       Single-strand conformational polymorphism

Polimorfismo Conformacional da Fita Simples


               Heterozigoto
                                             Fragmentos até
                                          200 pb – 90% de
                                          sensibilidade.
                                             Fragmentos
                                          maiores que 400 pb
                                          - 80% de
                                          sensibilidade.
                                            (digestão )
Microarray – Chip de DNA –
   Microarranjos de DNA
Southern blotting em lâmina
Chips de genes
Pode conter mais de 10.000 sondas oligonucleotídicas




                                                       By Diamar
Microarray – Chip de DNA –
  Microarranjos de DNA
Microdisposição de oligo ou de sondas
  - Microssíntese de oligos in situ (no chip)
  - Distribuição de sondas oligonucleotídicas pré
     fabricadas
  - Distribuição de fragmentos de DNA ou cDNA
Hibridação com mRNA ou cDNA fluorescentes
Leitura por scanners
                                                    By Diamar
Microarray
                  Microarranjos de DNA – Chips de DNA

   É uma técnica que emprega arranjos (arrays),
que contêm um grande número de genes
roboticamente distribuídos de forma ordenada em
uma placa de vidro.
  Pode comparar a expressão de um grande
número de gene, simultaneamente.
  Existem lâminas de 400.000 pontos.
São feitas com ponteiras de titâneo.




                                                        By Diamar
Microarray – Chip de DNA –
    Microarranjos de DNA

 Detecção de mutações gênicas e de polimorfismos
  Detecção de Expressão gênica em diferentes tecidos
sob condições normais e anormais
 Sequenciamento do DNA e genotipagem
Microarray – Chip de DNA –
          Microarranjos de DNA
    Contras                           Utilização

Técnica cara                    - Mapear mutações

Sensibilidade é reduzida        - Oncogenes

Lâminas não são reutilizadas    - Expressão das vias
                                  metabólicas

Repetir várias vezes           - Regiões regulatórias
                                 de genes de levedura

Grande quantidade de           - Expressão de genes
mRNA (2 a 5 µg)                  anônimos

                               - Analisar 10.000 amostras
                                 em 12 horas
Microarray – Chip de DNA – Microarranjos de DNA



                                       Descrição:
                                       - Hibridação do DNA em
                                       teste com disposições
                                       ordenadas de nucleotídeos
                                       em chip de silicone.




                                       Aplicação:
                                       - Detecção de DNA em
                                       teste com composição
                                       conhecida.




                                                     By Diamar
Referências Bibliográficas:
 MARSHALL, A., and HODGSON, J. 1998. DNA chips: array
 of possibilities. Nature Biotechnology, 16:27-31.
 MULLINS, K. B. 1990. The unusual origin of polymerase
 chain reaction. Sci. Amer. 262(4): 56-65.
 SANGER, F., Nickelen, S. And Coulson, A. R. 1977. DNA
 sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl.
 Acad. Sci. U.S. 74:5463-5467.
 SOUTHERN, E.M. 1975. Detection os specific sequences
 among DNA fragments separated by gel eletrophoresis. J.
 Mol. Biol. 98:503-517.



                                                             By Diamar
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Técnicas básicas de biologia molecular

  • 1. Técnicas Básicas de Biologia Molecular Diamar Costa-Pinto FIOCRUZ
  • 2. Visão da Apresentação PCR Bibliotecas genômica e de expressão Fragmentação - digestão Separação - eletroforese Clonagem molecular Sequênciamento Southern, Northern e Western blotting By Diamar
  • 3. Diagnóstico do século 21 - Podemos fazer análises genômicas, pois a maioria dos cromossomo já estão mapeados. - O projeto genoma tem sido uma grande ferramenta para unir genomas e laboratório clínico. Mapas Genéticos, Citológicos e Físicos EST – Sequências expressas marcadas. cDNA curtos que ligam mapas físicos a genéticos RFLP- Polimorfismo dos comprimentos dos fragmentos de restrição By Diamar
  • 4. Procurar um gene dentro de um genoma humano é comparável a procurar uma pessoa sem sobrenome em uma casa sem endereço em uma rua desconhecida em uma cidade não identificada de um país estrangeiro. Solange Farah By Diamar
  • 5. Enzimas de Restrição 1953 – a eficiência de replicação de um bacteriófago dependia da célula hospedeira Verificou-se, então, a presença de nucleases Bactéria restringe o crescimento do fago e protege o seu DNA metilando-o (modificando) Fenômeno chamado restrição/modificação Advento das endonucleases de restrição Sítio é normalmente uma palíndrome By Diamar
  • 6. Enzimas de Restrição (continuação) Palíndrome: ARARA ARARA OMO OMO ANA ANA By Diamar
  • 7. Enzimas de Restrição (continuação) Reconhecem seqüências de 4 a 8 pares de bases Cortes com extremidades abruptas ou coesivas Primeira letra maiúscula é gênero e as duas outras minúsculas são espécies 1073 – foram usadas para clonagem molecular Pode-se recombinar DNA humano com qualquer outra espécie Fragmentos separados por eletroforese By Diamar
  • 8. Enzimas de Restrição (continuação) By Diamar
  • 10. Vídeo de Enzima de Restrição By Diamar
  • 11. Eletroforese Já conhecida desde 1930 Difundida em 1950-1960 Movimentação de moléculas submetidas a campo elétrico Usa um substrato: papel, agarose, poliacrilamida Separa proteínas por cargas e peso molecular Separa ácido nucléicos por peso molecular By Diamar
  • 12. Eletroforese Fonte de eletroforese Vertical - + Visualização do gel de agarose - Horizontal + By Diamar
  • 13. Eletroforese By Diamar
  • 15. Clonagem Molecular Consiste no isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas Primeiro: inserto + vetor = rDNA Segundo: rDNA + célula hospedeira = transformação By Diamar
  • 17. Engenharia Genética (1970): o DNA recombinante permite isolar um gene específico, com uma característica desejada, e transfere este gene para outro organismo vivo Célula humana Bactéria DNA Plasmídeo Transformação DNA da bactéria Digestão Enzima de restrição Tesoura genética rDNA Clonagem DNA da célula humana By Diamar
  • 18. O DNA recombinante Não se limita a organismos de uma mesma espécie A compatibilidade sexual torna-se irrelevante Permite modificações em uma única geração, o que antes levaria dezenas ou centenas de gerações By Diamar
  • 19. Vídeo de Clonagem Molecular By Diamar
  • 20. Vetor São moléculas de transporte Moléculas de DNA Diversos tipos: plasmídeos, cosmídeos, fagos, vírus, YACs, etc. Diferenças de tamanho de inserto Podem ter comportar linear e/ou circular By Diamar
  • 21. Vetor (continuação) Vetores de expressão procarióticos Promotores fortes Sítios de ligação a ribossomos Sítios de clonagem Vetores de expressão eucarióticos Origem de replicação eucariótica Região de controle de transcrição e tradução, poliadenilação de mRNA, capping Sinais especiais para processamento e secreção By Diamar
  • 22. Vetor (continuação) Características gerais Região promotora Sítio Múltiplo de Clonagem - Polylinker Gene de resistência a antibióticos Origem de replicação Gene repórter By Diamar
  • 23. Vetor (continuação) PLASMÍDEOS: Penetra naturalmente nas bactérias Fita dupla Circular Extracromossômico Resistência a antibióticos Vetores shuttle Insertos até 4000 pb pUC 18, pUC 19 By Diamar
  • 24. Vetor (continuação) FAGOS Vírus de bactérias Fago λ é o mais utilizado Fita dupla linear Recirculariza durante a infecção na bactéria Aceita até 20 mil pb By Diamar
  • 25. Vetor (continuação) COSMÍDEOS Pequeno tamanho 4 a 6 Kb Engenherado: empacota rDNA no capsídeo do fago para infectar bactéria Possuem seqüências cos Aceitam insertos de até 50 mil pb By Diamar
  • 26. COSMÍDEOS By Diamar
  • 27. Vetor (continuação) YACs (Yeast Artificial Chromosome) Células hospedeiras as leveduras Comportam-se como cromossomos Aceitam 400 mil pb Possuem seqüências de DNA específicas de levedura: telômero, centrômero e origem de replicação ARS: Seqüência de replicação autônoma CEN: Seqüências centroméricas By Diamar
  • 28. Engenharia Genética – Produção em série - Hormônio de crescimento - Insulina humana - Vacina da Hepatite B - Hormônio sexuais By Diamar
  • 29. Sequenciamento Frederick Sanger (1977), Inglaterra Segundo Prêmio Nobel Síntese de DNA in vitro por término didesoxi Mapa físico dos genes e dos cromossomos By Diamar
  • 30. Sequenciamento (continuação) Hood: Semi-automatizado (1986) Venter: Genoma de bactéria usando ddNTPs fluorescentes automatizados, robóticas e PCR (1995) Perkins-Elmer Corp: Comercializado o Sequenciamento totalmente automatizado (1999) By Diamar
  • 31. Considerações P P P A P A C P P C C5 BN G C5 BN G C4 C1 T C4 C1 T U Ribose Pentose C3 C2 C3 C2 OH OH OH OH NTP ddNTP (Didesoxinucleotídeo) dNTP O - Necessário para ligação Ácido ribonucleico fosfodiéster Ácido desoxirribonucleico 5’ 3’ Polimerização By Diamar
  • 32. Estuda a integridade da sequência de um DNA molde. Analisa diferentes tamanhos de fragmentos formados a partir de um primer e da inserção randômica de dNTPs (polimeriza) e Sequenciamento ddNTPs (para a reação) em gel de poliacrilamida. A C G T DNA molde Primer DNA polimerase T G C A Fragmento 1 ddNTP dNTP dNTP dNTP C A Fragmento 2 ddNTP dNTP G C A Fragmento 3 ddNTP dNTP dNTP By Diamar
  • 34. Vídeo do Sequenciamento (Cycseqpc) By Diamar
  • 35. Southern Blotting E. M. Southern (1975) Fragmentos de DNA são separados em gel de agarose Transferidos para membranas por ação capilar DNA é desnaturado antes ou durante a transferência Sonda radioativa de DNA hibrida com o DNA na membrana Detecta polimorfismo de DNA ou mutação By Diamar
  • 36. Southern blot Descrição: - Digestão do DNA em teste com enzimas de restrição; - Resolução dos fragmentos com eletroforese em gel de agarose; - Transferência do DNA para membrana de nylon; - Hibridação com uma sonda de DNA ou RNA marcada com radioatividade ou quimioluminescentes Aplicação: Alterações em um único nucleotídeos; detecção de inserções, deleções e rearranjos; ordenamento de fragmentos do DNA em um mapa físico; fragmentos de cromossomo. Com o advento da PCR seu uso tornou-se limitado. By Diamar
  • 37. Southern blot 46, XY.Síndrome da insensibilidade androgênica. Vagina em fundo de saco, sem útero ou tubas uterinas. 1:20.000. Testículos no abdome ou Exemplo da especificidade das canal inguinal (confundidos com sondas. Sonda de cDNA para o hérnias, na infância). Defeito gene humano ligado ao X molecular: varia de deleção de receptor de andrógeno completa do gene a mutações de hibridando no genoma ponto nos domínios de ligação de digerido do paciente. andrógenos ou ligação ao DNA da proteína receptora de andrógeno. By Diamar
  • 38. Vídeo de Southern blot (DNA _DetectivePC)
  • 39. Northern blotting Corrida de RNA totais ou mRNA em gel de agarose RNAs devem ser desnaturados (formaldeído) Sensibilidade a RNAses Transferência para membrana por ação capilar Sondas de RNA ou DNA para hibridar By Diamar
  • 40. Northern blotting (Continuação) Úteis em estudo de expressão gênica Estudo de diferentes tecidos Estuda o padrão temporal de expressão de genes durante o crescimento do indivíduo By Diamar
  • 41. Northern blotting Marcadores rRNA RNAs totais de raízes (R), folhas (L) e flores (F). A – sonda de α-tubulina – hibrida todos B - sonda de α1- tubulina – hibrida só flores C - sonda de α3- tubulina – hibrida todos By Diamar
  • 42. Western blotting Corrida de proteínas em gel de poliacrilamida Separação e caracterização de proteínas Uso de SDS (sódio dodecil sulfato) para desnaturação Transferência para membrana por força elétrica By Diamar
  • 43. Western blotting (continuação) Proteína alvo é identificada por anticorpo mono ou policlonal Revelação do sistema com anticorpo secundário fluorescente ou radioativo Informa o tamanho e a quantidade das proteínas By Diamar
  • 44. Western blotting By Diamar
  • 45. Western blotting Análise de proteínas por anticorpos específicos após eletroforese e transferência para membrana. By Diamar
  • 46. Vídeo Immunoblotting (3EIMMBLOT)
  • 47. RFLPs Polimorfismo dos comprimentos dos fragmentos de restrição Uso de enzimas de restrição Produção de fragmentos de DNA de tamanho adequados para serem utilizados As Enzimas de restrição são: previsíveis, pouco frequentes e clivam fragmentos sítio-específicos de DNA Aplicação: compara alelos normais e afetados para cada mutação estudada.
  • 48. Mapa de Restrição By Diamar
  • 49. PCR - RFLP By Diamar
  • 50. RFLPs Polimorfismo dos comprimentos dos fragmentos de restrição Um caso de erro inato do metabolismo: G-6-P-D (glicose-6-fosfato-desidrogenase) By Diamar
  • 51. RFLP de Planta DNAs genômico de Arabidopis é digerido com EcoRI. Southern blotting com sonda azul e verde. F1 é heterogênio possui fragmentos de ambos os genitores. F1 autopoliniza: 1:2:1 Ecotipo diferentes: C- Colombia, N- Niederzenzes e H – Heterozigoto.
  • 52. Oligonucleotídeo alelo- específico (ASO) Descrição: - Hibridação preferencial de sonda marcada para testar DNA com composição de bases complenmentar única. Aplicação: - Alelos de composição conhecida. Mutação é conhecida. Revela uma única alteração de base. Distingue hetero ou homozigotos para a sequência. A análise é restrita a mutação familiar conhecida ou para distúrbios genéticos com nº finito de mutações diferentes. Ex: beta-talassemia. By Diamar
  • 53. FISH Hibridação in situ com fluorescência Detecta DNA localizados dentro de cromossomos Usa lâminas de microscopia Cromossomos estão em metáfase, anáfase e interfase Usa sondas de DNA específicas By Diamar
  • 54. FISH (Hibridação in situ com fluorescência) Prader-Willi: Imprinting genômico deleção no cromossomo 15 paterno. By Diamar
  • 55. By Diamar FISH (Hibridação in situ com fluorescência) Relação evolutiva entre cromossomos. DNA de gibão Hylobates lar sondado com DNA Humano. Setas indicam cromossomo 8 do gibão. Cromossomo humano 4 hibrida com cromossomo (laranja) do macaco verde africano. Evolução cromossômica em mamíferos
  • 56. SSCP Single-strand conformational polymorphism Polimorfismo Conformacional da Fita Simples Método baseado na mobilidade eletroforética. Protocolo Básico Gel não desnaturante. PCR do gene alvo. Sensível para DNA desnaturado. tamanho e forma da fita (eletroforese) simples. Mobilidade diferente Detecta a mudança da normal indica de uma base. mutação. By Diamar
  • 57. SSCP Single-strand conformational polymorphism Polimorfismo Conformacional da Fita Simples Heterozigoto Fragmentos até 200 pb – 90% de sensibilidade. Fragmentos maiores que 400 pb - 80% de sensibilidade. (digestão )
  • 58. Microarray – Chip de DNA – Microarranjos de DNA Southern blotting em lâmina Chips de genes Pode conter mais de 10.000 sondas oligonucleotídicas By Diamar
  • 59. Microarray – Chip de DNA – Microarranjos de DNA Microdisposição de oligo ou de sondas - Microssíntese de oligos in situ (no chip) - Distribuição de sondas oligonucleotídicas pré fabricadas - Distribuição de fragmentos de DNA ou cDNA Hibridação com mRNA ou cDNA fluorescentes Leitura por scanners By Diamar
  • 60. Microarray Microarranjos de DNA – Chips de DNA É uma técnica que emprega arranjos (arrays), que contêm um grande número de genes roboticamente distribuídos de forma ordenada em uma placa de vidro. Pode comparar a expressão de um grande número de gene, simultaneamente. Existem lâminas de 400.000 pontos. São feitas com ponteiras de titâneo. By Diamar
  • 61. Microarray – Chip de DNA – Microarranjos de DNA Detecção de mutações gênicas e de polimorfismos Detecção de Expressão gênica em diferentes tecidos sob condições normais e anormais Sequenciamento do DNA e genotipagem
  • 62. Microarray – Chip de DNA – Microarranjos de DNA Contras Utilização Técnica cara - Mapear mutações Sensibilidade é reduzida - Oncogenes Lâminas não são reutilizadas - Expressão das vias metabólicas Repetir várias vezes - Regiões regulatórias de genes de levedura Grande quantidade de - Expressão de genes mRNA (2 a 5 µg) anônimos - Analisar 10.000 amostras em 12 horas
  • 63.
  • 64. Microarray – Chip de DNA – Microarranjos de DNA Descrição: - Hibridação do DNA em teste com disposições ordenadas de nucleotídeos em chip de silicone. Aplicação: - Detecção de DNA em teste com composição conhecida. By Diamar
  • 65. Referências Bibliográficas: MARSHALL, A., and HODGSON, J. 1998. DNA chips: array of possibilities. Nature Biotechnology, 16:27-31. MULLINS, K. B. 1990. The unusual origin of polymerase chain reaction. Sci. Amer. 262(4): 56-65. SANGER, F., Nickelen, S. And Coulson, A. R. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 74:5463-5467. SOUTHERN, E.M. 1975. Detection os specific sequences among DNA fragments separated by gel eletrophoresis. J. Mol. Biol. 98:503-517. By Diamar
  • 66. Obrigada! By Diamar