Analise de hibridização

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Analise de hibridização

  1. 1. Análise de Hibridização Caio Fagundes João Moreira
  2. 2. Breve histórico • A idéia de imobilizar e hibridizar moléculas em um suporte sólido foi primeiro proposta por Denhardt (1966), conduzindo ao desenvolvimento de metodologias de identificação de seqüências no DNA genômico e de clonagem. • O passo seguinte foi dado por Southern (1975), quando demonstrou como poderia ser feita a transferência de DNA do gel para membranas;
  3. 3. • Segundo Dyson (1991), desde as descobertas de Denhardt e Southern as técnicas de hibridização em membranas tornaram-se gradativamente sofisticadas, principalmente devido a melhor compreensão acerca dos fatores que influenciam a taxa de hibridização e estabilidade dos híbridos.
  4. 4. Hibridização de ácidos nucléicos • É o pareamento complementar de bases entre os ácidos nucléicos de fita simples, gerando um produto dupla fita. • Pode ser: – DNA/DNA – RNA/RNA – DNA/RNA
  5. 5. Hibridização de ácidos nucléicos Como se mantem unidas as fitas? • Pontes de hidrogênio entre as bases; • Interações hidrofóbicas entre as bases adjacentes de uma mesma fita.
  6. 6. Fatores que afetam a estabilidade dos híbridos • • • • • • Número de pares GC v/s pares AT; Grau de complementariedade; Tamanho das fitas (número de pares de bases) ; Concentração de sal na solução; Temperatura; Concentração de formamida (para híbridos de RNA).
  7. 7. Fatores que afetam a estabilidade dos híbridos • Número de pares GC v/s pares AT: – Maior número de ligações de H entre as fitas → maior estabilidade dos híbridos. • 3 ligações de H entre G e C • 2 ligações de H entre A e T
  8. 8. Fatores que afetam a estabilidade dos híbridos • Grau de complementariedade: – Menor complementariedade de bases: → menos ligações de H formadas; → menor estabilidade.
  9. 9. Fatores que afetam a estabilidade dos híbridos • Tamanho das fitas: – Maior tamanho (cDNAs >200pb): → mais ligações de H; → maior estabilidade do híbrido. – Menor tamanho (oligos <50pb): → Maior especificidade; → Menor probalidade de hibridização cruzada.
  10. 10. Fatores que afetam a estabilidade dos híbridos • Concentração de sal na solução: ∀ ↑ [sal] → ↑ estabilidade do híbrido – Cátions monovalentes (Na+) ou divalentes (Mg++) – As cargas negativas dos grupos fosfato repelem umas às outras. – Os íons positivos da solução reduzem a repulsão eletrostática entre as fitas.
  11. 11. Fatores que afetam a estabilidade dos híbridos • Temperatura: – Maior T → aumenta a energia cinética das fitas e desestabiliza a estructura dos ácidos nucléicos. → as fitas se separan.
  12. 12. Fatores que afetam a estabilidade dos híbridos • pH: ↑ [OH- ] ↑ ionização dos grupos fosfato, favorecendo a repulsão eletrostática entre as fitas. • Concentração de formamida: – Provavelmente forma ligações de H com os ácidos nucléicos; – Desestabiliza a formação de híbridos.
  13. 13. O efeito combinado destes fatores pode ser expresso em uma equação para o cálculo da Tm • O que é Tm? Tm = temperatura de melting ou temperatura de separação das fitas. A Tm é uma medida de estabilidade dos híbridos, definida como a temperatura na qual 50% dos híbridos se encontram formados e 50% permanecen dissociados. 50% 5’ - - - - - - - - - - -3’ 3’ - - - - - - - - - - 5’ 5’ - ----5’ ----3’ - -50% -3’
  14. 14. Para DNA:DNA Tm = 81,5 ºC + 16,6log[Na] + 41(%G+C) - 0,63(%formamida) - (500/L) Para DNA:RNA Tm = 79,8 ºC + 18,5log[Na] + 58,4(%G+C) + 11,8(%G+C)2 - 0,5(%formamida) - (820/L) Para oligonucleotidos em 1 M Na+ Tm (oC) = 4 (G+C) + 2 (A+T)
  15. 15. Dot/Slot Blot • Desenvolvido primeiramente por Kafatos et al em 1979. • Usado na determinação da abundância relativa de uma seqüência alvo em uma série de amostras de DNA • Aplicada em análise genômica de espécies relacionadas • Zoo Blot: blots contendo DNA de uma variedade de espécies relacionadas.
  16. 16. Dot/Slot Blot • Técnica de imobilização de DNA não fracionado em uma membrana de nitrocelulose ou de nylon. Posteriormente a análise de hibridização pode ser feita. • Dot ou Slot: Diferenças na geometria do blot
  17. 17. Dot/Slot Blot • Dot/Slot blotting de DNA em membranas não carregadas de nitrocelulose e nylon: – Aprelho de sucção e um manifold – Materiais: • • • • • • • • • SSC 6x e 20x DNA a ser analizado Solução de desnaturação: 1.5M NaCl/0.5M NaOH Solução de neutralização: 1M NaCl/0.5M tris.Cl pH 7,0 Membrana Folhas de papel de filtro Manifold Plástico transparente a luz UV Fonte UV
  18. 18. Dot/Slot Blot • Embeber a membrana e o filtro de papel em SSC 6x por 10 min. • Posicionar a membrana sobre o filtro no manifold. Observar se há bolhas de ar. • Diluir DNA com água e SSC 20x p/ um volume de 400ul. Desnaturar o DNA em banho de água a 100 ºC por 10 min. • Ligar o aparelho de sucção ao manifold, adicionar 500ul de SSC 20x e permitir filtragem (5 min). • Centrifugar amostras de DNA e aplicar aos poços. • Filtrar.
  19. 19. Dot/Slot Blot • Após filtragem, colocar membrana sobre um papel de filtro embebido em solução de desnaturação por 10 minutos. • Levar membrana a um papel embebido em solução de neutralização por 5 minutos. • Embrulhar a membrana no plástico transperente a UV e posicioná-la com o DNA voltado para baixo na fonte de UV pelo tempo indicado. • Secar a membrana.
  20. 20. Análise de Hibridização • DNA de fita simples e RNA de sequencias definidas podem parear com um segundo DNA ou RNA com uma seqüência complementar, com a estabilidade do híbrido dependendo do grau de pareamento de bases. • Experimentalmente usa-se uma sonda marcada e um DNA alvo imobilizado em uma membrana. É um método bastante sensível.
  21. 21. Análise de Hibridização • • • • • Imobilização; Adição das sondas na solução de hibridização; Lavagem: grau de complementaridade; Sondas: 100 a 1000 bp marcados radioativamente; Diversos protocolos: Southern e Dot
  22. 22. Análise de hibridização de DNA com sonda de DNA marcada • • • • Bloqueio de sítios não específicos Incubação com a sonda. Lavagem. Materiais: – Sonda – Solução de pre-hibridização/hibridização – 2x SSC/0,1% SDS, 0,2x SSC/0,1% SDS, 0,1x SSC/0,1% SDS, 2x e 6x SSC – Incubadora – Tubo de hibridização – Reagentes para marcação de DNA e autoradiografia
  23. 23. Análise de hibridização de DNA com sonda de DNA marcada • Marcação da sonda de DNA (nick translation ou random priming) a atividade especifica de 1x108 dpm/ug; • Molhar a membrana com o DNA em 6x SSC; • Incubar membrana no tubo de hibridização com APH (1ml para 10cm2) por 3 hr a 68 ºC; • Desnaturar sonda a 100 ºC por 10 min; • Repor a APH contendo a sonda no tubo e incubar overnight a 68 ºC; • Lavar a membrana (SSC/SDS - ciclos de 10 min); • Fazer autoradiografia.
  24. 24. Análise de hibridização de DNA com sonda de RNA marcada • Construção de sondas de RNA (RNA pol:SP6, T3 ou T7) para o DNA template; Para marcação radioativa adicionar NTPs radioativos. • Molhar a membrana com o DNA em 6x SSC; • Incubar membrana no tubo de hibridização com FPH (1ml para 10cm2) por 3 hr a 42 ºC; • Trocar o FPH, adicionar a sonda no tubo e incubar overnight a 42 ºC, sob agitação; • Lavar a membrana (SSC/SDS - ciclos de 10 min).
  25. 25. • Repor a solução de lavagem e adicionar igual volume de 2x SSC (25µg/ml RNase A + 10U/ml RNase T1) e incubar 30 min; • Realizar a autoradiografia. • Para remover as sondas da membrana hibridizada basta realizar um tratamento com 0,4 M de NaOH à 45 ºC, ou com 0,1% de SDS. Assim a membrana poderá ser novamente hibridizada.
  26. 26. Random priming: Nick translation: ds DNA DESNATURACION ALINEAMIENTO DE PARTIDORES DNase I quebra o DNA DNA POLIMERASA + dNTPs + dNTP-P DNA pol I agrega NTPs

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