Introdução aos métodos cromatográficos

Instituto Federal de Mato Grosso
Campus Fronteira Oeste
Pontes e Lacerda
Profº: Adnaldo Brilhante. Ms em Química.
Disciplina: Analise Química Instrumental

INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS
CROMATOGRÁFICOS

Classificação dos métodos analíticos
CLÁSSICOS E INSTRUMENTAIS
Baseados em propriedades
físicas (químicas em alguns casos )
Chamados de métodos
de via úmida
Gravimetria Volumetria Eletroanalítico
Propriedades
elétricas
Espectrométrico
Propriedades
ópticas
Cromatográfico
Propriedades
mistas*
*Separação: interações físico-químicas.
Identificação/quantificação: propriedades ópticas ou elétricas.
3

Histórico
Cromatografia
Mikhail (Michael, Mikhael) Semenovich Tswett (1903), botânico russo: Separação de
misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com adsorventes sólidos e solventes
variados.
éter de
petróleo
CaCO3
mistura de
pigmentos
pigmentos
separados
1906 Cromatografia = chroma [cor] + graphe [escrever] (grego)
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Definição - Princípio Básico
Cromatografia é um método físico-químico de
separação de misturas, identificação e
quantificação de seus componentes.
• A separação depende da interação dos componentes da
mistura com a fase móvel e com a fase estacionária.
A interação dos componentes da mistura com estas duas fases é
influenciada por diferentes forças intermoleculares, incluindo
iônica, dipolar, apolar, e específicos efeitos de afinidade e
solubilidade.
• A identificação se dá mediante a comparação da
interação de padrões com as fases estacionárias.
• A quantificação é feita também pela comparação com
padrões de concentrações conhecidas, através de
curvas analíticas.
Cromatografia
5

Classificação das técnicas cromatográficas
• De acordo com o sistema cromatográfico
• Em Coluna
•Cromatografia Líquida
•Cromatografia Gasosa
•Cromatografia Supercrítica
• Planar
•Centrífuga (Chromatotron®)
•Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
•Cromatografia em Papel (CP)
Cromatografia
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• De acordo com a fase móvel
• Utilização de Gás
•Cromatografia Gasosa (CG)
•Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR)
• Utilização de Líquido
•Cromatografia Líquida Clássica (CLC)
•Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
• Utilização de Gás Pressurizado
•Cromatografia Supercrítica (CSC)
Cromatografia
7

• De acordo com a Fase Estacionária
• Líquida
• Sólida
• Quimicamente Ligadas
• De acordo com o modo de separação
• Por Adsorção
• Por Partição
• Por Troca Iônica
• Por Afinidade
Cromatografia
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Cromatografia
Técnica Planar Coluna
FM
FE
Líquido
Líq Sol
Gás Líquido
Líq Sol
CP CCD CGL CGS CLL CLS CTI CB CLFL CE
Exclusão
Fase
Ligada
Troca
Iônica
Sol
Líq Afinidade
Tipo de
cromato-
grafia
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Analogia
O processo cromatográfico pode ser comparado a um grupo
de abelhas e moscas sobrevoando uma certa região.
Ao passarem por uma flor, espera-se algum efeito sobre as
moscas e abelhas.
Cromatografia
Fase estacionária Analitos
10

Analogia
Para uma mesma mistura, a simples troca da fase
estacionária pode ser suficiente para alterar completamente
a ordem de eluição de componentes da mistura.
Cromatografia
Fase estacionária Analitos
11

Cromatografia
Princípio Básico
Separação de misturas por interação diferencial dos seus
componentes com uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou
sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).
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Cromatografia em papel - CP
A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa!
Fase estacionária líquida suportada na celulose.
Fase móvel
Separação
Cromatografia
A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição, utiliza dois líquidos
(líquido-líquido) sendo um fixado em um suporte sólido (papel de filtro). Um bom
exemplo é a separação da tinta verde. Com o processo de cromatografia é possível
verificar que a cor verde é uma mistura de tintura azul e amarela.
13

Cromatografia em papel - CP
A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa!
Cromatografia
Desenvolvida por Consden, Gordon e Martin em 1944, é bem
simples e utiliza pequena quantidade de amostra. Aplica-se na
separação e identificação de compostos polares hidrossolúveis.
14

Cromatografia de Camada Delgada - CCD
Teve início em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber, mas começou a ser
largamente utilizada na dédaca de 1960. O processo de separação está
fundamentado, principalmente, no fenômeno de adsorção. Entretanto com fases
estacionárias tratadas pode ocorrer também por partição ou troca iônica.
Cromatografia
15

Termos e parâmetros técnicos
Cromatografia
solvente
mancha
f
ΔS
ΔS
R
s
a
R a
f 
s
b
Rb
f 
s
c
Rc
f 
c
b
a
s
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Cromatografia
FASES ESTACIONÁRIAS
Sílica (SiO2)
Alumina (Al2O3)
Celulose
Poliamida
Ativação de 30 a 60 min
de 105 a 110 oC
Ativação de 10 min
a 105 oC
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Cromatografia
ANÁLISE QUALITATIVA
- Comparação com valores de Rf tabelados
- Comparação com padrão eluído em conjunto
- Extração e aplicação de métodos instrumentais
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Cromatografia
A B Após
Eluição
Amostra não contém a espécie B
Amostra pode conter a espécie A
Para se certificar da presença,
eluir em outros solventes
Conclusões:
Amostra
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Cromatografia
Solvente 1 Solvente 2
Cromatografia
Bi-dimensional
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Cromatografia planar
Cromatografia
Chromatotron é uma
cromatografia de camada
fina preparativa acelerada
centrifugamente. Pode
substituir pequenas colunas e
HPLC.
21

Cromatografia
Cromatografia em Coluna
22

Cromatografia
PROCESSOS DE SEPARAÇÃO
Exclusão
Adsorção
Partição
Troca Iônica
Afinidade
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Cromatografia
ADSORÇÃO
- Fase Móvel Líq. ou Gás
- Fase Estacionária Sólida
Processos de
Adsorção/Dessorção
Ligações de hidrogênio;
Forças de Van der Waals
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Cromatografia
Diferença entre Absorção e Adsorção
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Cromatografia
ADSORÇÃO
Fase Estacionária Sólida:
Polar
Aumento da Atividade
-CO2H > -OH > -NH2 >
-SH > -CHO > -C=O >
-CO2R > -OCH3 > -CH=CH-
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Cromatografia
Hexano < Éter de Petróleo < Ciclohexano <
Tetracloreto de Carbono < Benzeno < Tolueno <
Diclorometano < Clorofórmio < Éter Etílico <
Acetato de Etila < Acetona < Etanol <
Metanol < Ácido Acético
SOLVENTES: Polaridade em Ordem Crescente
A função das fases móveis na cromatografia por adsorção
tem sentido amplo:
a) Função solvente
• Solubilizar os componentes
• Ter baixo ponto de ebulição
b) Função eluente
• Conduzir os componentes da mistura pela coluna
• Remover ou dessorver estes componentes do adsorvente (FE)
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Cromatografia
Usos:
a) Laboratórios de química orgânica  separar e purificar
reagentes e materiais obtidos em síntese.
b) Laboratórios de produtos naturais  escala preparativa
e analítica.
c) Laboratórios de análises clínicas  separação de
esteróides de urina ou de sangue, etc.
ADSORÇÃO
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Cromatografia
PARTIÇÃO
Fase Móvel Gasosa
Fase Estacionária Líquida
Processos de Solubilidade
O processo de partição é
intrafacial e a volta de cada
componente para a fase móvel
depende da sua volatilidade.
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Cromatografia
PARTIÇÃO
Fase Móvel Líquida
Fase Estacionária Líquida
Processos de Solubilidade
O processo de partição é
intrafacial e a volta de cada
componente para a fase móvel
depende da sua solubilidade.
30

Cromatografia
TROCA IÔNICA
Fase Estacionária Sólida
Processos de Troca Iônica
Adsorção reversível e
diferencial dos íons da fase
móvel pelo grupo trocador
da matriz
Por volta de 1935 começaram a ser fabricadas resinas de troca iônica
orgânicas, muito eficientes, passando a constituir um meio químico de
extraordinário valor em processos analíticos.
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Cromatografia
Maior Interação
• Íons de alta carga
• Íons de menor tamanho
TROCA IÔNICA
Resinas Catiônicas
e Aniônicas
FE altamente carregada
Fluxo
da
FM
A diferença de afinidade entre
os íons da FM pode ser
controlada por pH e força iônica
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Cromatografia
O ajuste do pH proporciona a separação das duas proteínas
33

Cromatografia
EXCLUSÃO
Fase Estacionária em Gel
Enquanto as partículas menores penetram nas
cavidades, as maiores vão sendo eluídas
contornando as estruturas moleculares da FE.
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Cromatografia
EXCLUSÃO
A propriedade que distingue a cromatografia de exclusão,
introduzida por volta de 1960, de outros tipos de
cromatografia é que o recheio (FE) é um gel não carregado
constituído de macromoléculas que têm ligações cruzadas,
com afinidade pelos solventes, mas que neles são insolúveis.
- Separação de tamanhos específicos
- Separação de polímeros e proteínas
- Determinação de Massa Molar
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Cromatografia
EXCLUSÃO
Características
desejáveis para os Géis
-Inércia Química:
Não pode haver uma interação
química entre a matriz e o soluto.
-Estabilidade:
O gel deve suportar uso contínuo
quanto mantido em condições
brandas de temperatura e pH.
-Baixo teor de íons:
Grupos carregados interferem no
processo de separação.
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Cromatografia
EXCLUSÃO
Tipos de Géis
Dextrano (Sephadex)
Poliacrilamida
Ágar e Agarose
Fluxo
da
FM 37

Cromatografia
Fase Estacionária Sólida
Propriedades
Biológicas e
Funcionais
AFINIDADE
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Cromatografia
Teoria Básica
SOLUTO
FASE
ESTACIONÁRIA
FASE
MÓVEL
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Teoria Básica
Cromatografia
Coluna cromatográfica: série de estágios independentes onde acontece o
equilíbrio entre o analito dissolvido (sorvido) na fase estacionária e na fase
móvel:
 
 
FM
FE
C
A
A
K 
KC = Constante de Distribuição
[A]FE = concentração do analito na FE
[A]FM = concentração do analito na FM
Ocorre um “quase-equilíbrio” entre o analito
sorvido na FE e dissolvido na FM.
MENOR RETENÇÃO !!!
Volatilidade [A]FM
Afinidade pela FE [A]FE
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Quantificação da eficiência
Cromatografia
Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios separados
onde ocorre o equilíbrio entre o analito, a FE e a FM:
Cada “estágio” de equilíbrio é
chamado de PRATO TEÓRICO
O número de pratos teóricos
de uma coluna (N) pode ser
calculado por:
Coluna mais
eficiente
tR
wb
N
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Quantificação da eficiência
Cromatografia
ALTURA EQUIVALENTE A UM
PRATO TEÓRICO (H)
“Tamanho” de cada estágio de
equilíbrio
Valores de H para colunas capilares e empacotadas são próximos, mas
como L para capilares é MUITO maior tipicamente elas são mais
eficientes
(L = comprimento da coluna)
Valores típicos de H e N:
dC df H N
0,10 0,25 0,081 370370
0,25 0,25 0,156 192308
0,32 0,32 0,200 150000
0,32 0,50 0,228 131579
0,32 1,00 0,294 102041
0,32 5,00 0,435 68966
0,53 1,00 0,426 70423
0,53 5,00 0,683 43924
2,16 10% 0,549 3643
2,16 5% 0,500 4000
Capilares, L = 30 m
Empacotadas, L = 2 m
dc = diâmetro da coluna em mm
df = espessura da fase estacionária em m
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Cromatografia em fase gasosa
Fase estacionária
Fase móvel
Separação
Cromatografia
Detecção
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Cromatografia em fase gasosa
Cromatografia
Coluna: contendo a
fase estacionária está
submetida à
temperaturas
controladas
Fase móvel:
gás inerte
Detector:
submetido à
temperatura
controlada
Injetor: submetido
à temperatura
controlada
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Cromatografia Gasosa
Aplicabilidade
Quais misturas podem ser
separadas por CG ?
Misturas cujos constituintes sejam
VOLÁTEIS (=“evaporáveis”)
para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo de um gás ela
deve dissolver-se, pelo menos parcialmente, nesse gás.
DE FORMA GERAL:
CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos
constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oC e que
sejam termicamente estáveis.
45

Requisitos - Gás de arraste (FM)
INERTE: Não deve reagir com a amostra, nem
com a fase estacionária ou superfícies do
instrumento.
PURO: Deve ser isento de impurezas que
possam degradar a fase estacionária.
Impurezas típicas em
gases e seus efeitos:
oxida / hidrolisa algumas FE
incompatíveis com DCE
H2O, O2
hidrocarbonetos ruído no sinal de DIC
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Requisitos - Gás de arraste (FM)
CUSTO: Gases de
altíssima pureza
podem ser muito
caros.
COMPATÍVEL COM DETECTOR: Cada detector demanda
um gás de arraste específico para melhor funcionamento.
Seleção de Gases de
Arraste em Função
do Detector:
He , H2
DCT
DIC N2 , H2
DCE N2 (SS), Ar + 5% CH4
CUSTO PUREZA
A
B
C
A = 99,995 % (4.5)
B = 99,999 % (5.0)
C = 99,9999 % (6.0)
47

Injetor
Os dispositivos para injeção (INJETORES ou
VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução
INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica
Injeção instantânea:
Injeção lenta:
t = 0
t = x
t = 0
t = x
48

Injetor “on column”
1
2
3
4
1 - Septo (silicone)
2 - Alimentação de gás de
arraste)
3 - Bloco metálico aquecido
4 - Ponta da coluna
cromatográfica
49

Injetor “on column”
1 2 3
1 - Ponta da agulha
da microsseringa é
introduzida no início
da coluna.
2 - Amostra injetada
e vaporizada
instantaneamente no
início da coluna.
3 - “Plug” de vapor
de amostra forçado
pelo gás de arraste a
fluir pela coluna.
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Parâmetros de injeção
TEMPERATURA DO INJETOR: Deve ser suficientemente
elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem
decomposição.
Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulição do
componente menos volátil.
VOLUME INJETADO: Depende do tipo de coluna e do estado
físico da amostra.
COLUNA
Amostras
Gasosas
Amostras
Líquidas
empacotada
 = 3,2 mm (1/4”) 0,1 mL ... 50 mL
0,2 L ... 20 L
capilar
 = 0,25 mm 1 L ... 100 L
0,01 L ... 3 L
Sólidos:
convencionalmente
se dissolve em um
solvente adequado e
injeta-se a solução
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LÍQUIDOS: Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L
êmbolo
corpo (pirex)
agulha (inox 316)
Microsseringa de
10  L:
Microsseringa de 1  L (seção
ampliada):
corpo
guia
êmbolo (fio de aço
soldado ao guia)
agulha
Microsseringas para injeção
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Colunas
EMPACOTADA
 = 3 a 6 mm
L = 0,5 m a 5 m
Recheada com sólido pulverizado
(FE sólida ou FE líquida
depositada sobre as partículas do
recheio)
CAPILAR
 = 0,1 a 0,5 mm
L = 5 m a 100 m
Paredes internas recobertas com
um filme fino (fração de m) de
FE líquida ou sólida
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Temperatura da coluna
Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora
para percorrer a coluna depende de sua PRESSÃO DE
VAPOR (p0).
p0 = f
Estrutura química do analito
Temperatura
da
coluna
Pressão
de
vapor
Velocidade
de
migração
ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE
(MENOR RETENÇÃO)
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AUMENTO DA
TEMPERATURA DA COLUNA
CONTROLE CONFIÁVEL
DA TEMPERATURA DA
COLUNA É ESSENCIAL
PARA OBTER BOA
SEPARAÇÃO EM CG
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Programação linear de temperatura
Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito
diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:
TCOL
BAIXA:
- Componentes mais voláteis são
separados
- Componentes menos voláteis
demoram a eluir, saindo como
picos mal definidos
TCOL ALTA:
- Componentes mais voláteis não
são separados
- Componentes menos voláteis
eluem mais rapidamente
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A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação:
Consegue-se boa
separação dos
componentes da
amostra em menor
tempo
TEMPO
TEMPERATURA
tINI tFIM
TINI
TFIM
R
TINI - Temperatura Inicial
TFIM - Temperatura Final
tINI - Tempo Isotérmico Inicial
tFIM - Tempo Final do Programa
R - Velocidade de Aquecimento
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VARIAÇÕES DE VAZÃO
DO GÁS DE ARRASTE: A
viscosidade de um gás
aumenta com a temperatura.
viscosidade vazão
DERIVA (“DRIFT”) NA
LINHA DE BASE: Devido ao
aumento de volatilização de
FE líquida
Possíveis problemas associados à PLT:
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Fase Estacionária
REGRA GERAL: a FE deve ter características tanto quanto possível
próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromático ...)
FE SELETIVA (ideal): Deve interagir diferencialmente com os
componentes da amostra.
FE Seletiva:
separação adequada dos constituintes
da amostra
FE pouco Seletiva:
má resolução mesmo com coluna de
boa eficiência
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Fase estacionária sólida
• O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE sólida é
a ADSORÇÃO
A adsorção ocorre na
interface entre o gás de
arraste e a FE sólida
• Sólidos com grandes áreas superficiais
(partículas finas, poros)
• Solutos polares
• Sólidos com grande número de sítios
ativos (hidroxilas, pares de elétrons...)
ADSORÇÃO
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Fase estacionária líquida
• O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE líquida é
a ABSORÇÃO
A absorção ocorre no interior
do filme de FE líquida
(fenômeno INTRAfacial)
• Filmes espessos de FE líquida
• Grande superfície líquida exposta ao gás
de arraste
• Interação forte entre a FE líquida e o
analito (grande solubilidade)
ABSORÇÃO
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Fase estacionária quirais
• As propriedades físico-químicas dos isômeros óticos são MUITO
SIMILARES  FE convencionais não interagem diferencialmente com os
isômeros óticos.
FÁRMACOS - Em muitos fármacos apenas um dos isômeros óticos
têm atividade farmacológica.
PRODUTOS BIOLÓGICOS - Distinção entre produtos de
origem sintética e natural (natural = normalmente substâncias
oticamente puras; sintético = muitas vezes são misturas racêmicas).
63

Detectores
Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal
quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste.
Características ideais:
1.Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s.
2.Boa estabilidade e reprodutibilidade.
3.Resposta linear para solutos que se estenda por várias
ordens de grandeza.
4.Faixa de temperatura desde a ambiente até pelo menos
400 ºC.
5.Tempo de resposta curto e independente da vazão.
6.Alta confiabilidade e facilidade de uso.
7.Similaridade de resposta para todos os solutos.
8.Não destrutivo.
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Detectores
Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA
Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no cromatograma.
REGISTRO
DE
SINAL
ANALÓGICO
Registradores XY
DIGITAL
Integradores
Computadores
65

Detectores
UNIVERSAIS:
Geram sinal para
qualquer
substância eluída.
SELETIVOS:
Detectam apenas
substâncias
com determinada
propriedade
físico-química.
ESPECÍFICOS:
Detectam substâncias
que
possuam determinado
elemento
ou grupo funcional em
suas
estruturas
DCT DCE DNP
66

Detectores - Funcionamento
DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD):
Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por
eluatos altamente eletrofílicos.
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU
TCD): Variação da condutividade térmica do gás de arraste.
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID):
Íons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de
H2 + ar.
DETECTOR TERMOIÔNICOS (DNP OU NPD): Modificação
do DIC. Os eluatos queimados na chama H2 + ar passam por
uma superfície de silicato de rubídio onde se formam íons de
moléculas com N e P.
67

Detectores – Limites de detecção
DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD):
Seletivo. Responde muito bem a halogenetos orgânicos, aldeídos
conjugados, nitrilas, nitratos e organometálicos. Sensibilidade: 0,01
a 1 pg com linearidade até ng. (104)
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU
TCD): Universal. Observa-se para qualquer substância eluída.
Sensibilidade: 0,4 a 1 ng com linearidade até dezenas de g (104).
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID):
Quase-universal. Detecta qualquer substância que contenha
ligações C-H. Não responde a gases nobres, H2, O2, N2, CX4, SiX4
(X=halogênio), CO, CO2, CS2, H2O, NO, N2O, NO2, NH3.
Sensibilidade: 10 a 100 pg com linearidade até mg (107 – 108).
DETECTOR TERMOIÔNICO (DNP OU NPD): Específico.
Responde a compostos orgânicos com N e P. Sensibilidade: 0,1 a 1 pg
(P) e 0,4 a 10 pg (N) com linearidade até ng. (103 - 105)
68

Detectores – Espectrometria de massas
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico. Um dos
detectores mais poderosos para a cromatografia gasosa é o
espectrômetro de massas. Observa-se para qualquer substância
eluída um sinal, mesmo que complexo, no espectrômetro de massa.
É seletivo ou específico quando monitora-se um fragmento de
determinada razão m/z.
Detecção
TIC
Universal
Similar a DCT
SIM
Seletivo
Maior Sensibilidade
69

CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico.
TEMPO
CONTAGENS
MASSA
/
CARGA
CONTAGENS
Cromatograma de íons totais:
TIM ou TIC
Em cada posição do
cromatograma tem-se
um espectro de massa.
70

CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico.
TEMPO
CONTAGENS
Cromatograma de íons
selecionados: SIM
Em cada posição do
cromatograma tem-se
o sinal somente da m/z
selecionada. MASSA / CARGA
CONTAGENS
Oferece a vantagem
de registrar
somente o sinal do
constituinte de
interesse, sendo
“cego” para os
demais.
71

CG-EM (GC-MS): Interface CG-EM.
CG EM
Vácuo
Separador Molecular
O gás de arraste leve
(He) difunde mais
rapidamente que o analito
e tende a ser drenado
para o vácuo.
Câmara
de Ionização
Coluna
Capilar
Interface Capilar Direta
Com colunas capilares a
vazão baixa de gás de
arraste pode ser drenada
pelo sistema de vácuo.
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Análise qualitativa
t
R
t
M
t
R
’
=
t
R
-
t
M
TEMPO
SINAL
O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito é o
TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO, tR’:
tR = Tempo de Retenção (tempo
decorrido entre a injeção e o ápice
do pico cromatográfico)
tM = Tempo de Retenção do
Composto Não-Retido (tempo
mínimo para um composto que não
interaja com a FE atravesse a
coluna)
tR’ = Tempo de Retenção Ajustado
(tempo médio que as moléculas do
analito passam sorvidas na FE)
73

Análise qualitativa
Coluna HP-Innowax (PEG – altamente polar): 30 m x 0,25 mm x 0,25 m
Detector FID: 250 ºC
Injetor com divisão de fluxo 1:25: 250 ºC
Volume injetado: 1 L
Como se explica esta
ordem de eluição?
Mistura de benzeno, n-propanona,
n-propanol, n-butanol, isobutanol e
n-pentanol.
A n-propanona elui primeiro
devido à sua maior volatilidade.
O benzeno em segundo devido sua
natureza apolar (menor ).
Para os demais compostos, cujas
diferenças de polaridade não são
elevadas, a volatilidade se torna o
principal parâmetro que define a
ordem de eluição.
74

Análise quantitativa
TEMPO
SINAL
O parâmetro diretamente relacionado à quantidade de analito é:
• Altura da banda cromatográfica: não recomendado, pois
a banda necessita ser perfeitamente simétrica.
• Área da banda cromatográfica.
Altura
Área
75

tempo
Concentração
Área
amostra
76

MASSA
ÁREA
A partir de certo
ponto o sinal não
aumenta mais
linearmente
O fim da zona de linearidade pode
ser detectado quando a razão
(Área / Massa) diverge em mais de
5 % da inclinação da reta na
região linear:
MASSA
ÁREA
/
MASSA
0,95 S
1,05 S
77

tempo
amostra
Concentração
Adicionada
Área
concentração
na amostra
78

Cromatografia em fase líquida
Cromatografia Líquida
79

Cromatografia Líquida - CLAE
Aplicabilidade
Quais misturas podem ser
separadas por CLAE ?
Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa molar
de 32 até 4000000.
para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um líquido ela deve
dissolver-se nesse líquido.
DE FORMA GERAL:
CL é aplicável para separação e análise de misturas cujos
constituintes sejam solúveis na FM. Não há limitação de
volatilidade ou de estabilidade térmica.
80

Tipos e
Aplicações da
Cromatografia
Líquida
Insolúvel em água
Solúvel em água
Aumento de
p o l a r i d a d e
Polar não iônico
Apolar
Iônico
Massa
molecular
102
103
104
105
106
Troca
iônica
Partição
Partição
em fase
reversa
Partição
em fase
normal
Exclusão
Permeação em
gel
Filtração em gel
Adsorção
81

Componentes
típicos - CLAE
82

Esquema de um equipamento para CLAE
83

Requisitos dos sistemas de bombeamento
1 – Geração de pressões até 6.000 psi
2 – Saída com ausência de pulsos
3- Velocidades de fluxo de 0,1 a 10 mL/min
4 – Controle e reprodutibilidade de fluxo de
0,5% ou melhor
5 – Componentes resistentes à corrosão
Bomba recíproca (também são chamadas de
bombas de pistão ou de diafragma)
84

Suportam pressões de até 7.000 psi
Volumes típicos: 5 a 500 L
Microamostragem: 0,5 a 5 L
Sistemas de injeção de amostras
85

A eluição com gradiente produz efeitos similares aos
produzidos pela programação de temperatura na CG.
Solvente puros ou misturas de solventes de acordo com a
polaridade requerida na separação.
Fase móvel para CLAE
 Eluição isocrática: Quando a separação é feita utilizando um único
solvente de composição constante.
 Eluição com gradiente: São utilizados dois ou três sistemas de
solventes que diferem bastante entre si em polaridade. Depois
que a eluição começa, a razão entre os solventes é variada de
modo programado, de forma contínua ou em passos.
86

Eluição com gradiente Coluna C18, 5 m, fase reversa
Detector fluorescência:
excit. 334 nm – emis. 425 nm
87

Colunas para CLAE
As colunas geralmente são
construídas de aço inox, embora
tubos de vidro com paredes
resistentes sejam encontrados
ocasionalmente. No entanto, estes
últimos são restritos a pressões
mais baixas do que 600 psi.
Existem comercialmente centenas de colunas
empacotadas, diferindo entre si no tamanho e na fase
estacionária. Preços variam de 200 a 500 dólares.
88

Colunas para CLAE
Pré-coluna
•Remoção de material particulado
•Contaminantes do solvente
•Contaminantes da amostra
•Saturar a FM com a FE
Aumenta a vida útil da coluna
COLUNAS TÍPICAS
•Material: aço inox
•Comprimento: 10 a 30 cm
•Diâmetro: 4 a 10 mm
•FE: Partículas de 5 a 10 m
•Eficiência: 40 mil a 60 mil
pratos/metro
89

Separação isocrática de alta velocidade
1– p-xileno
2- anisol
3- acetato de benzila
4- dioctil-ftalato
5- dipentil-ftalato
6- dibutil-ftalato
7- dipropil-ftalato
8- dietil-ftalato
- 4 cm de comprimento
- 0,4 cm d.i.
- FE: spherisorb 3 m
Coluna de alta
velocidade e
alta eficiência
FM: 4,1% EtAc em n-Hexano
100.000 pratos/metro
90

• Pelicular:
• Consiste de leitos de polímero ou vidro não-poroso, esférico, com diâmetros
típicos da ordem de 30 a 40 m, recoberto com uma camada fina e porosa de:
• Sílica
• Alumina
• Resina de poliestireno-divinil-benzeno
• Resina trocadora de íons
• Partícula porosa:
• Consiste de micropartículas porosas com diâmetros de 3 a 10 m. As
partículas são constituídas dos mesmos materiais do recobrimento pelicular.
Basicamente são dois tipos de FE:
Fase estacionária para CLAE
91

Detectores
As características desejáveis para os detectores para
CLAE não são diferentes daquelas para CG.
Existem dois tipos de detectores:
• Propriedades universais (índice de refração, densidade ou
constante dielétrica).
• Propriedades do soluto (absorbância, fluorescência, etc).
Características ideais:
1.Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s.
2.Boa estabilidade e reprodutibilidade.
3.Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de
grandeza.
4.Tempo de resposta curto e independente da vazão.
5.Alta confiabilidade e facilidade de uso.
6.Similaridade de resposta para todos os solutos.
7.Não destrutivo.
8.Volume interno mínimo e compatível com a vazão e com a pressão.
92

Detectores
• Absorbância
• UV/Vis – S: 10-9 g/mL – FL: 105
• IV
• Fluorescência – S: 10-9 a 10-12 g/mL – FL: 103
• Índice de refração (universal) –
S: 10-7 g/mL – FL: 104
93

Detectores
• Eletroquímicos: existem vários tipos disponíveis atualmente.
Embora não sejam tão explorados quanto os detectores
ópticos, eles apresentam algumas vantagens como alta
sensibilidade, simplicidade e ampla aplicabilidade.
• Amperométricos
• Coulométricos
• Condutométricos – S: 10-8 g/mL – FL: 104
• Polarográficos – S: 10-12 g/mL – FL: 106
94

Detectores
• Espectrometria de massa - universal
• Assim como na CG-EM, o acoplamento de um espectrômetro de massa
potencializa a técnica de separação e quantificação
• Um grande problema é o descompasso entre os volumes relativamente
grandes de solventes na CL e os requisitos de vácuo na EM.
Interface CL-EM
95

Detectores
• Espectrometria de massa
TEMPO
CONTAGENS
MASSA
/
CARGA
CONTAGENS
TEMPO
CONTAGENS MASSA / CARGA
CONTAGENS
TIC
SIM
96

Tipos de CLAE
Ao contrário da CG, onde a FM se comporta como
um gás ideal e não contribui para o processo de
separação, a FM líquida da CLAE interage tanto
quanto a FE com os componentes da amostra.
Isto torna o desenvolvimento dos métodos em
CLAE um tanto mais complexo que na CG.
97

Tipos de CLAE
• PARTIÇÃO: líquido-líquido e fase ligada. A diferença entre
elas consiste em como a FE é mantida nas partículas do
suporte do empacotamento  Adsorção e ligação química.
Dois tipos podem ser distinguidos: Fase normal e Fase
reversa.
Fase normal: FE de natureza fortemente polar (ex. água)
FM apolar (ex. hexano ou éter isopropílico)
O componente menos polar é eluído primeiro por ser o
mais solúvel na fase móvel.
Fase reversa: FE de natureza apolar (ex. hidrocarbonetos)
FM polar (ex. água, metanol ou acetonitrila)
O componente mais polar aparece primeiro e o aumento
da polaridade da fase móvel aumenta o tempo de eluição.
98

Tipos de CLAE
• É provável que ¾ de toda a CLAE esteja baseada na fase
reversa ligada, onde o grupo R do siloxano nesses
recobrimentos é uma cadeia C8 (n-octil) ou C18 (n-octadecil)
99

Tipos de CLAE
Campo Misturas típicas
Farmacêutico Antibióticos, sedativos, esteróides, analgésicos
Bioquímico Aminoácidos, proteínas, carboidratos, lipídios
Produtos alimentícios Adoçantes artificiais, antioxidantes, aflatoxinas,
aditivos
Produtos químicos Aromáticos condensados, surfactantes,
propelentes, corantes industriais
Poluentes Pesticidas, herbicidas, fenóis, PCB (bifenilas
policloradas)
Química forense Drogas tóxicas, venenos, álcool no sangue,
narcóticos
Clínica médica Ácidos de bílis, metabólitos de drogas, extratos de
urina, estrógenos
100

Tipos de CLAE
• ADSORÇÃO: líquido-sólido. FE sílica ou alumina. É a forma
clássica da CL introduzida no início do século 20. Sofreu
adaptações e tornou-se o mais importante dos métodos de
HPLC.
• TROCA IÔNICA: líquido-sólido. FE resina com capacidade
de troca iônica.
• EXCLUSÃO: líquido-gel. FE gel. Um material polimérico,
hidrofóbicos ou hidrofílicos, com muitas ligações cruzadas,
são capazes de promover a separação de acordo com os
tamanhos das moléculas  EXCLUSÃO DE TAMANHO. Se o
material reticulado for uma resina de troca iônica, tem-se a
cromatografia de EXCLUSÃO DE ÍONS.
101

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
CIENFUEGOS, F.e VAISTRUMAN, D., Análise Instrumental, Rio de Janeiro: Interciência,
2000.
GONÇALVES, M. L. S. S. Métodos Instrumentais para análise de soluções. Fundação Calouste
Gulbenkian, Lisboa. 4ª edição. 2001.
HARRIS, D. C. Análise Química Quantitativa (6a edição). Trad de José A. P. Bonapace: LTC -
Livros Técnicos e Científicos, 2005, Rio de Janeiro.
SKOOG, D.A.; HOLLER, F. J.; NIEMAN, T. A. Princípios de Análise Instrumental (5a edição).
2002. Editora Bookman.
BACCAN, Nivaldo. Química analítica quantitativa elementar. 3ª Edição. São Paulo. Ed.
Edgard Blucher. 2001.
HARRIS, D. C. Análise Química Quantitativa (6ª edição). Trad de José A. P. Bonapace: LTC -
Livros Técnicos e Científicos, 2005, Rio de Janeiro.
VOGEL, Arthur Israel. Química analítica quantitativa. 6ª Edição. São Paulo. Ed. Mestre Jou.
1991.
102

MUITO
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