O documento descreve os princípios e métodos da cromatografia. A cromatografia é um método físico-químico de separação baseado na migração diferencial dos componentes de uma mistura devido a diferentes graus de interação entre duas fases imiscíveis, uma móvel e outra fixa. O documento classifica os diferentes tipos de cromatografia e descreve métodos como a cromatografia líquida, em coluna, em camada delgada e por exclusão.

1. CROMATOGRAFIA
Marilena Meira

2. 1. Histórico
Em 1903, o botânico russo
Mikhail Tswett conseguiu separar
pigmentos vegetais passando,
através de uma coluna contendo
CaCO3, uma solução de
pigmentos dissolvidos em um
hidrocarboneto.
Obteve um registro colorido do
processo de separação
cromatos: cor ; grafia: registro =
CROMATOGRAFIA.

3. 2. Definição de Cromatografia:
• Fase móvel: solvente (gás ou líquido)
que se move através do sistema
Método físico-químico de separação baseado na
migração diferencial dos componentes de uma
mistura devido a diferentes graus de interação
entre duas fases imiscíveis, uma móvel e outra fixa.
que se move através do sistema
(coluna ou placa), carregando os
solutos.
• Fase Estacionária: sólido (ou líquido
impregnado em um sólido) que
permanece fixo no sistema (coluna ou
placa).

4. 3. CLASSIFICAÇÃO
1. PELA FORMA FÍSICA DO SISTEMA CROMATOGRÁFICO:
• CROMATOGRAFIA PLANAR
• CROMATOGRAFIA EM COLUNA
2. PELA FASE MÓVEL EMPREGADA:
• LÍQUIDA
• GASOSA
• SUPERCRÍTICA
3. PELA FASE ESTACIONÁRIA UTILIZADA:
• SÓLIDA
• LÍQUIDA
• QUIMICAMENTE LIGADA
4. PELO MODO DE SEPARAÇÃO:
• ADSORÇÃO
• PARTIÇÃO
• TROCA IÔNICA
• EXCLUSÃO

5. CROMATOGRAFIA
COLUNAPLANARTÉCNICA
LÍQUIDA GASOSAFASE
MÓVEL
LÍQUIDA
FASE
ESTACIONÁRIA
LÍQUIDA LÍQUIDALÍQUIDASÓLIDA SÓLIDA SÓLIDA
CGLCP CCD CLL CLS; CE CGS

6. 4. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
1. CROMATOGRAFIA POR PARTIÇÃO OU LÍQUIDO-
LÍQUIDO (CLL)
2. CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA (CTI)
3. CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO (CE)
4. CROMATOGRAFIA POR ADSORÇÃO OU
LÍQUIDO-SÓLIDO (CLS)
CL
CTI CE
CLL CLS

7. 4.1. CROMATOGRAFIA POR PARTIÇÃO OU
LÍQUIDO-LÍQUIDO (CLL)
• A separação é baseada nos
diferentes coeficientes de
partição (solubilidade) dos
componentes da mistura
entre dois solventes
imiscíveis, um fixo (faseimiscíveis, um fixo (fase
estacionária) imobilizado
na superfície de um
suporte sólido e o outro
móvel.
FASE MÓVEL F. ESTACIONÁRIA

8. EXEMPLO DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDO-
LÍQUIDO: CROMATOGRAFIA EM PAPEL (CP)
• A celulose do papel forma pontes
de hidrogênio com a água, que fica
retida formando a fase estacionária.
• A separação da mistura é baseada
nas diferentes solubilidades
relativas dos componentes na faserelativas dos componentes na fase
móvel e estacionária.
• A fase móvel sobe por ação capilar.
• Os componentes mais solúveis na
fase estacionária serão
seletivamente retidos, tendo uma
movimentação mais lenta.

9. FATOR DE RETENÇÃO (Rf)
Distância percorrida pela fase móvel
Rf = Distância percorrida pela substância
Rf = dsRf = ds
dm
ds2
dm
ds1

10. SUBSTÂNCIAS SEPARADAS POR
CROMATOGRAFIA EM PAPEL
• COMPOSTOS HIDRÓFILOS
(HIDROSSOLÚVEIS) COMO ÁCIDOS
ORGÂNICOS E ÍONS METÁLICOS.

11. 4.2.CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA (CTI)
• A fase estacionária é
constituída por uma
matriz com grupos
funcionais ionizáveis.
• Trocadores catiônicos,
têm sítios carregados
+
-
+
Trocador catiônico
têm sítios carregados
negativamente
adsorvendo cátions.
• Trocadores aniônicos têm
sítios ativos carregados
positivamente
adsorvendo ânions.
+
-
-
Trocador aniônico

12. TIPOS DE FASES ESTACIONÁRIAS NA
CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA (CTI)
• Derivados sulfônicos de copolímeros do estireno e
divinilbenzeno. Fortemente catiônica.
• Amina quaternária de copolímeros do estireno e
divinilbenzeno. Fortemente aniônica.
• Resinas com o grupo ácido carboxílico. Fracamente• Resinas com o grupo ácido carboxílico. Fracamente
catiônicas.
• Resina com o grupo funcional amina primária.
Fracamente aniônicas.
• Derivada da celulose: por tratamento químico, em
geral sulfonação.
• Sílica-gel impregnada com trocadores iônicos
líquidos (ex: triisoctilamina)

13. TROCADOR CATIÔNICO: ESTIRENO-
DIVINILBENZENO SULFONADO.
CH
SO3
-H+
C
H2
CH
CH
C
H2
C
H2
CHC
H2
CH C
H2
CH2CH
SO3
-H+
C
H2
CH
2 2
C
H2
CH
CH
CH C
H2
CH C
H2
CH
SO3
-H+
SO3
-H+
SO3
-H+
C
H2
CH

14. TROCADOR ANIÔNICO: AMINA TERCIÁRIA
ESTIRENO-DIVINILBENZENO.
CH
CH2NR3+OH-
C
H2
CH
CH
C
H2
C
H2
CHC
H2
CH C
H2
CH2CH
CH2
NR3
+OH-
C
H2
CH
H22 H2
C
H2
CH
CH
CH C
H2
CH C
H2
CH
CH2
NR3
+OH-CH2NR3+OH-
CH2NR3+OH-
C
H2
CH

15. TIPOS DE FASES MÓVEIS NA
CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA (CTI)
• Soluções tampões (pH 3,0 – 8,0):
Tampão de Fosfato de pH = 8,0.
Tampão de Fosfato de sódio de pH =
3,4.3,4.
• Soluções de sal: 0,1 – 0,2 M de LiCl ou
NaCl.
• Água destilada.
• Qualquer solvente orgânico.

16. 4.3. CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO (CE):
Cromatografia de permeação ou filtração por gel
• Baseia-se em um processo puramente
mecânico. A fase estacionária é uma matriz de
composição inerte, com partículas de forma,
tamanho e porosidade uniformes.
• As moléculas menores são capazes de• As moléculas menores são capazes de
penetrar em todos os poros da fase
estacionária, ficando mais tempo retidas,
enquanto as maiores são excluídas de todos
os poros, passando entre os grânulos,
arrastadas pela fase móvel.

17. CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO (CE):
A fase estacionária mais usada é um gel de
dextrano (um polissacarídeo com unidades de
glicose), conhecido comercialmente como
Sephadex.

18. 4.4. CROMATOGRAFIA LÍQUIDO-SÓLIDO:
CROMATOGRAFIA POR ADSORÇÃO
• Baseia-se na adsorção seletiva dos
componentes da mistura pela fase
estacionária por ação de forças eletrostáticas
e nas diferentes solubilidades que estese nas diferentes solubilidades que estes
componentes têm na fase móvel.
• São exemplos: Cromatografia em coluna
(CC) e Cromatografia em camada delgada
comparativa e preparativa (CCDC e CCDP).

19. Adsorção e Absorção
• Absorção: penetração de um material na
massa de outro por ação molecular ou
química. A substância absorvida infiltra-se
na substância que a absorve.na substância que a absorve.
• Adsorção: adesão das moléculas de um
material sobre a superfície de um sólido ou
líquido em que estas estão em contato.
Quanto maior a superfície do adsorventes
mais forte a adsorção.

20. Escolha do adsorvente e eluente na
Cromatografia por Adsorção
• Pontos a considerar:
1. Características da amostra
2. O Adsorvente ou fase estacionária2. O Adsorvente ou fase estacionária
3. O eluente ou fase móvel

21. Características da amostra:
1. Acidez, basicidade, caráter iônico, solubilidade,
reatividade com o adsorvente e solventes,
2. Constituição química:
• ligações duplas, particularmente conjugadas
aumentam adsorção.
• Compostos com pontes de H intramoleculares• Compostos com pontes de H intramoleculares
são menos adsorvidos que seus isômeros.
• Grupos funcionais aumentam afinidade de
adsorção. Este efeito decresce na ordem: -
COOH, -CONH2, -OH, -NHCOCH3, -NH2, -
OCOCH3, -COCH3, -NO2, -OCH3, -H, -Cl.

22. Pontes de hidrogênio intramoleculares fazem com que
o composto seja menos adsorvido que seu isômero:
OH
COOH
H
O
OH
O
COOH
1 2
1 2
Com a formação das pontes de H
intramoleculares, menos moléculas do
composto orto (1), relativamente ao para
(2) , estarão formando pontes de H com a
sílica, daí maior rapidez na eluição.

23. Escolha do Adsorvente
COMPOSTOS ADSORVENTES
LIPOFÍLICOS
ÓXIDO DE ALUMÍNIO
SÍLICA-GEL
HIDROFÍLICOS
CELULOSE
CELULOSE COM
TROCADORES DE ÍONS
KIESELGUR
POLIAMIDA

24. Principais adsorventes
• Sílica-gel: Separa bem aldeídos, cetonas,
alcalóides, açúcares, fenóis, esteróides,
terpenóides, ácidos graxos e aminoácidos.
• Alumina ou óxido de alumínio: Útil na
separação de hidrocarbonetos policíclicos,
alcalóides, aminas, vitaminas lipossolúveis ealcalóides, aminas, vitaminas lipossolúveis e
algumas cetonas. Inadequado para
flavonóides e cetonas insaturadas.
• Kieselgur (Terras diatomáceas ou diatomita).
Ácido silícico de origem fóssil. É utilizado
como suporte nas separações por partição.

25. Principais adsorventes
• Óxido de magnésio: Usado para
compostos aromáticos e substâncias
com várias ligações duplas conjugadas
(Ex: carotenóides).
• Celulose e celulose modificada: Para• Celulose e celulose modificada: Para
compostos hidrofílicos (aminoácidos,
ácidos nucléicos, açúcares, glicosídeos.
• Poliamida: Separa flavonóides, fenóis,
nitroanilinas, benzofenonas e derivados
de aminoácidos.

26. Escolha da Fase móvel
• Sua escolha depende do adsorvente
utilizado, sua atividade e da classe de
compostos da amostra.
• Misturas equieluotrópicas: Misturas de• Misturas equieluotrópicas: Misturas de
solventes distintas que originam iguais
deslocamentos de uma mesma
amostra.

27. Ordem crescente da capacidade eluotrópica do
solvente
• Éter de petróleo
• Hexano
• Tetracloreto de carbono
• Dissulfeto de carbono
• Benzeno
• Diclorometano
• Clorofórmio• Clorofórmio
• Éter dietílico
• Acetato de etila
• Éter dipropílico
• Propanol
• MeOH
• Piridina
• Água
• Ácido Orgânico diluído
• Fenol

28. 4.4.1. CROMATOGRAFIA EM CAMADA
DELGADA (CCD)
Aplicações:
1. Para determinar o número de componentes de
uma mistura.
2. Para determinar a identidade de duas
substâncias.substâncias.
3. Para monitorar o progresso de uma reação
4. Para determinar a eficiência de uma
purificação.
5. Para determinar o melhor sistema de solvente
para uma separação em coluna cromatográfica.
6. Para monitorar uma coluna cromatográfica.

29. CCD
UV 254 nm: detecta compostos aromáticos, compostos com
duplas conjugadas e alguns compostos insaturados.

30. REVELADORES EM CCD
Triterpenos e esteróides Reagente de Liebermann-Burchard
Flavonóides Solução de cloreto de alumínio
Alcalóides Reagente de Dragendorff
CLASSE REVELADOR
Alcalóides Reagente de Dragendorff
Vapores de iodoCompostos insaturados

31. DETERMINAÇÃO DO MELHOR SISTEMA DE
SOLVENTES PARA SEPARAÇÃO DE UMA MISTURA.
• Deve-se fazer uma série de placas por
CCD em sistemas de diferentes
polaridades com a mistura a ser
separada.separada.
• O melhor sistema é aquele que dê um
valor de Rf na faixa de 0,25-0,35 para o
componente mais rápido na placa.

33. CALCULANDO O Rf

34. solvente 1 solvente 2 solvente3 solvente 4 solvente 5 solvente6 solvente 7
solvente 3.95 3.9 4.0 4.1 4.0 4.0 4.05
Mais
lento
(álcool)
0.6 0.35 0.35 0.25 0.1 0.1 0.1
Mais
rápido
(cetona)
1.45 1.0 1.0 0.8 0.65 0.6 0.45
Rf álcool 0.15 0.09 0.088 0.061 0.025 0.025 0.025
Rf cetona 0.37 0.26 0.25 0.20 0.16 0.15 0.11
O Rf do componente mais rápido deve estar na faixa de 0.25-0.35. Os solventes
1, 2 e 3 estão nesta faixa. Para uma melhor resolução a diferença de Rf de cada
componente deve ser no mínimo 0,1:
solvente 1: Rf cetone - Rf álcool = 0.37 - 0.15 = 0.22
solvente 2: Rf cetone - Rf álcool = 0.26 - 0.09 = 0.17
solvente 3: Rf cetone - Rf álcool = 0.25 - 0.088 = 0.16
Os sistemas 1, 2 e 3 dão diferença de Rf superior a 0,1. Escolhe-se o sistema 3 por
ser o menos polar.

36. CROMATOGRAFIA EM COLUNA (CC)

37. CROMATOGRAFIA EM COLUNA
Pré-eluição
Empacotamento
Carregamento

38. ELUIÇÃO: EXEMPLO DE MONITORAÇÃO
POR CCD
• A amostra foi eluída
com o sistema de
solventes
previamentepreviamente
escolhido por CCD.
Recolheu-se 6
frações que foram
testadas por CCD.
Eluição

39. CCD DAS SEIS PRIMEIRA FRAÇÕES
•Frações 1 e 2 não têm nenhum componente.
•Nas Frações 3, 4 e 5 saiu o primeiro componente, deve-se
juntar estas frações.
•Pode-se agora aumentar a polaridade do sistema de
solvente para sair o segundo componente.

40. CCD DAS FRAÇÕES 7 a 12
Nas frações 7, 8 e 9 saiu o segundo componente
Nas frações 10 a 12 não saiu mais nada
Pode-se encerrar a coluna e juntar 7, 8 e 9.

41. BIBLIOGRAFIA
• COLLINS, Carol H.; Braga, Gilberto L.; Bonato, Pierina S. -
Introdução a Métodos Cromatográficos. 7ª ed. Editora da
Unicamp. 1997.
• Degani, A. L. ; Cass, Quezia B; Vieira, P. C. Cromatografia, um
breve ensaio. Química Nova na Escola, 07, 21-25, 1988.