Este documento fornece um resumo sobre cromatografia com ênfase na cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Aborda o histórico da cromatografia, os princípios, tipos, componentes, aplicações e etapas iniciais para desenvolvimento de métodos cromatográficos.

1. CROMATOGRAFIA COM ÊNFASE
EM CLAE:
APLICAÇÕES PRÁTICAS
CENTRO DE ENERGIA NUCLEAR NA AGRICULTURA
Alessandra de Cássia Romero
Doutoranda em Ciências
acromero@cena.usp.br

2. HISTÓRICO:
 SÉCULO XX: século da cromatografia
♦ Utilização descrita em textos antigos,
gregos e egípcios
♦ Michael Tswett (1872-1919)
♦ 1903 1906: “cromatografia”
♦ Martin & Synge cromatografia de partição

3. CROMATOGRAFIA:
 Técnica de separação (física/química) na qual os
componentes a serem separados são distribuídos
entre 2 fases: sendo uma fixa e de grande área
superficial, denominada “fase estacionária”, e
outra, denominada fase móvel, um fluido que
percola através da fase estacionária

4. SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA
 Substâncias têm afinidades diferentes com a fase
estacionária e com a fase móvel.
 Fase móvel percola a fase estacionária separação
♦ Fase Estacionária: adsorção do soluto
♦ Fase Móvel: dessorção do soluto da F.E.
Eluição do analíto

5. TIPOS DE CROMATOGRAFIA:
Lanças, F.M. Cromatografia em fase gasosa, 1993 (com modificações)

6. DEFINIÇÕES GERAIS:
 ADSORÇÃO
Os compostos são retidos na fase estacionária (polaridade)
por um período de tempo (tempo de retenção – TR) até que a
passagem constante da fase móvel seja capaz de retirar
gradativamente, cada um desses compostos.
 PARTIÇÃO
Os compostos passam por uma distribuição (solubilidade)
entre a fase móvel e a estacionária, que é colocada na
coluna na forma de um filme em um suporte sólido hidrofílico.

7. DEFINIÇÕES GERAIS:
 FATOR DE RETENÇÃO (k): razão entre a massa do soluto
presente na FM e na FE.
♦ Quanto maior o k , maior o tempo de retenção na coluna.
♦ Juntamente com o fluxo, determina o TR do pico.
 SELETIVIDADE (α): relação entre o tempo que 2 solutos
passam na fase líquida.
♦ Mede a capacidade de separação entre 2 picos e é alterada
com a troca do solvente da FM, pH, FE e temperatura.
α

8. DEFINIÇÕES GERAIS:
 EFICIÊNCIA DA COLUNA:
Número de pratos teóricos (N): número de distribuição de
equilíbrio entre a fase móvel e a estacionária.
♦ Quanto maior o nº de N, mais eficiente a coluna.
 RESOLUÇÃO:
Medida quantitativa da separação de 2 picos consecutivos,
determinada pela distância entre os TRs e a largura da base
dos picos.

9. DEFINIÇÕES GERAIS:
Rs = t
wb2
N = 16 TR
2
wb
α = TR (B)
TR (A)
A B

10. HIGH RESOLUTION GAS
CHROMATOGRAPHY (HRGC)
 Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CG).
 Fase móvel é um gás.
 Fase estacionária: sólida ou líquida.
 Mecanismo de separação:
CGS: tubo percolado com um sólido adsorção
CGL: suporte sólido revestido por um líquido partição

11. CROMATOGRAFIA GASOSA (CG):
 Vantagens da técnica:
♦ resolução
♦ velocidade em análise
♦ sensibilidade
♦ exatidão (repetibilidade excelente)
 Limitações:
♦ amostra deve ser volátil (gás, líquido ou sólido)
♦ amostras sujas requerem limpeza
♦ uso de outro instrumento para confirmação de identidade
♦ treinamento e experiência

12. CROMATOGRAFIA GASOSA (CG):
 Escolhas para uma boa utilização da técnica:
♦ Detector (seletivo ou universal)
♦ Coluna (recheio, espessura, comprimento)
♦ Gás de arraste
♦ Introdução da amostra
♦ Controle da temperatura (injeção, coluna e detector)
♦ Quantificação
Cilindro do gás de arraste
Controle de fluxo
Injetor
Coluna
Detector
Registrador
Forno

13. DETECTORES GC:
 CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS:
♦ Alta sensibilidade
♦ Resposta/detecção adequada a amostra
♦ Linearidade
♦ Ruído baixo
♦ Quantidade mínima detectada

14. DETECTORES GC:
 Principais detectores em CG:
♦ Detector por Condutividade Térmica (TCD): Universal.
♦ Detector por Ionização de Chama (FID): Orgânicos.
♦ Detector por Captura de Elétrons (ECD): Orgânicos com
capacidade de capturar elétrons.

15. COLUNAS GC:
 Empacotadas: maior quantidade de amostra injetada; menor
resolução e pratos teóricos.
 Capilares: menor quantidade de amostra; maior resolução e pratos
teóricos.
 Quanto maior o comprimento, maior a resolução e eficiência (mas
também, o custo, o TR, a pressão...).
 Quanto menor o diâmetro, maior a eficiência.
 Uso adequado de temperatura.

16. COLUNAS GC:
 Gás-sólido: (recheio de sílica gel, carvão ativado, aluminosilicato
sintético): Adsorção interação entre o analíto e FE, na interface com
o gás de arraste (FM); quanto maior a afinidade da amostra pela FE,
maior o tempo de adsorção.
 Gás-líquido: (recheio é um sólido recoberto com um líquido de alto ponto
de ebulição) Partição quanto mais similares forem a fase líquida e a
amostra, mais simples e eficiente será a separação.

17. GÁS DE ARRASTE:
 Fase móvel.
 Não interagir com a fase estacionária ou com a amostra.
 Baixo custo.
 Elevado grau de pureza.
 Ser adequado ao detector utilizado.
 Fluxo do gás de arraste irá influenciar na eficiência da coluna.

18. INTRODUÇÃO DA AMOSTRA:
 Uma introdução ou injeção de amostra eficiente deve permitir
que quantidades controladas cheguem até a coluna,
constituindo uma composição idêntica ou pelo menos
representativa da amostra.
 Não existe uma forma universal de injeção que atenda a todas
as demandas.
 A escolha depende da coluna utilizada, das condições
operacionais, da T°C e das características da amostra.

19. INTRODUÇÃO DA AMOSTRA:
 SPLIT: amostra vaporiza no pórtico de injeção e uma porção é
introduzida na coluna.
 SPLITLESS: sem divisão da amostra.
 ON COLUMN: diretamente na coluna
♦ Cold on column: amostra depositada à frio na coluna dentro
do forno.
♦ PTV (Programação de Temperatura Variável): permite a
injeção de amostras líquidas em colunas capilares

20. ANÁLISE QUALITIVA:
 Tempo de retenção: característico do composto, mas não
exclusivo dele.
 TR varia com a coluna, fluxo do gás de arraste, fase líquida,
temperatura da coluna.
 Identificação por fortificação.
 Sistemas acoplados “on-line” ou “off-line” (Ex: GC-MS).

21. ANÁLISE QUANTITATIVA:
 Normalização da área simples
 Normalização da área corrigida
 Padrão externo: curva de calibração
 Padrão interno: curva de calibração com adição de padrão
interno a cada ponto da curva.
Massa A (%) = área A x 100
área total
Massa A (%) = área A / FC x 100
área total / FC
Fator de correção: massa / área

22. SHIMADZU - LANA:

23. SHIMADZU - LANA:

24. CROMATOGRAMA:
Lanças, F.M. Cromatografia em fase gasosa, 1993

25. THIN LAYER CHROMATOGRAPHY
(TLC)
 Cromatografia em camada delgada (CCD)
- Aplicação da amostra em papel recoberto por sílica;
- Aplicação de concentrações de padrões analíticos;
- Desenvolvimento da placa em sistemas de solvente;
- Comparação visual entre o desenvolvimento dos padrões e
da amostra (distância e intensidade).

26. THIN LAYER CHROMATOGRAPHY
(TLC)

27. THIN LAYER CHROMATOGRAPHY
(TLC)

28. THIN LAYER CHROMATOGRAPHY
(TLC)

29. HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY (HPLC)
 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).
 CLAE: Separação de substâncias em uma mistura,
proporcionada pela impulsão de um solvente a fluxo
constante e elevada pressão, através de uma coluna na
qual essa mistura é seletivamente separada.

30. CLASSIFICAÇÃO:
 Quantidade de Amostra
 Mecanismo de separação
 Fase Estacionária

31. Quantidade de amostra:
 Cromatografia em escala preparativa (>1g)
 Cromatografia em escala semi-preparativa (µg – g)
 Cromatografia analítica (pg - µg)

32. Mecanismo de Separação:
 Cromatografia líquida de adsorção (Líquido-sólido):
adsorção sobre superfície polar.
 Cromatografia de partição líquido-líquido
 Líquido-líquido em Fase ligada: partição (FE e FM).
 Troca iônica: adsorção reversível de íons.
 Exclusão: poros internos separam partículas por tamanho.

33. Fase Estacionária:
 Fase Normal: FE polar, FM apolar.
 Fase Reversa: FE apolar, FM polar.

34. ELUIÇÃO
 4 PASSOS:
- Introdução da amostra
- Interação entre a amostra, FE e FM
- Remoção de interferentes
- Eluição do analíto

35. TIPOS DE ELUIÇÃO:
 ISOCRÁTICA
- proporção entre os solventes utilizados na fase
móvel é constante durante a eluição.
 GRADIENTE
- a proporção entre os solventes utilizados varia
gradualmente durante a eluição.

36. PRIMEIROS PASSOS
ANALÍTO????
 Escolha do tipo de coluna
 Modo de detecção
 Escolha da Fase Móvel
 Otimização de parâmetros para cromatografia
 Validar o método

37. ANALÍTO: Colunas
 As características do analíto determinam quais as
escolhas acertadas quanto ao tipo de equipamento
utilizado e suas configurações RESULTADOS
AMOSTRA APOLAR AMOSTRA POLAR
COLUNA DE FASE NORMAL COLUNA DE FASE REVERSA
Recheio é polar Recheio é apolar

38. ANALÍTO: Detecção
DETECÇÃO:
 O analíto apresenta fluorescência natural ou
pode ser derivatizado?
DETECTOR DE FLUORESCÊNCIA
 O analíto absorve a luz branca?
DETECTOR UV, UV-VIS ou PDA UV-Vis

39. OUTROS DETECTORES:
 Detector de índice de refração: diferença de
refração entre o solvente e o soluto.
 Detector eletroquímico: oxidação ou redução de
um composto.
 Espectrometria de massas: combinação de
processos de ionização, fragmentação e
separação iônica.

40. DETECTORES:
 Seletivos: UV fixo e variável, fluorescência
 Universais: IR e MS
 UV, fluorescência e MS podem utilizar eluição
gradiente, o IR não.
 Quantidade Mínima Detectada:
♦ UV: ng
♦ IR: µg
♦ Fluorescência: pg
♦ MS: ng-pg

41. ESCOLHA DA FASE MÓVEL
 CONSIDERAÇÕES GERAIS:
 Alto grau de pureza
 Força do solvente
 Polaridade
 Seletividade
 Polaridade ou Força: determina por quanto
tempo os eluentes são retidos (TR)
 Seletividade: retenção relativa pode afetar o
formato dos picos

42. ESCOLHA DA FASE MÓVEL
 Modo de eluição?
 Tempo de retenção?
 Presença de interferentes?
 Resolução de picos.
 Linha de base.
 Repetibilidade.

43. FASE MÓVEL
 Nem todos os solventes podem ser utilizados
em conjunto!
- Podem interagir quimicamente;
- Viscosidade (pressão);
- Alta pressão de vapor (bolhas);
- Interferir na detecção do analíto;
- Filtrados e degaseificados.

44. COMPONENTES HPLC:

45. SHIMADZU

46. INICIANDO:
 Purga
 Acionar a bomba / subir fluxo

47. OPERANDO:

48. AGILENT 1100 - LANA:

49. SOFTWARE:

50. MÉTODO:
 A amostra é solúvel?
 É possível analisá-la por HPLC?
 Se sim, qual o detector?
 Qual o modo da coluna?
 Qual a coluna? FE, comprimento, diâmetro, etc.
 FM? Polaridade, pH, força iônica.

51. A amostra é solúvel?
 Desejável: 1% solução em solvente fraco. Tente hexano,
MeOH ou água.
 Ácido ou básico (sal?)?
0,01 N HAc – pH ~ 3,4
0,5 N NH4OH – pH ~ 10,6
 Alguns polímeros precisam ser aquecidos.
Ex: polietileno-tolueno (120°C)

52. Qual detector?
 Se a amostra pode ser analisada por HPLC (consulte a
literatura, busque informações sobre a amostra), o
próximo passo é definir qual o detector.
 UV-Vis é a primeira escolha.
 LC/MS – é a melhor escolha.
 Fluorescência – apenas se houver o conhecimento prévio
de que é apropriado para a amostra.
 IR – quando não houver informação suficiente sobre a
amostra universal, mas pouco sensível.

53. Que tipo de coluna?
AMOSTRA
MW >1500
Solúvel em
ÁGUA
Cromatografia
de Filtração em
Gel (GFC)
Solúvel em
ORGÂNICOS
Cromatografia
de Permeação em
gel (GPC)
MW < 1500
Solúvel em
ORGÂNICOS
HEXANO
Líquido-
Sólido
Fase ligada
BCP- NP
METANOL
Fase ligada
BCP- NP
Fase ligada
BCP-RP
Solúvel em
ÁGUA
ELETRÓLITO
Exclusão
Iônica (IEC)
Pares
Iônicos (IPC)
NÃO
ELETRÓLITO
Fase
Reversa
Fase
Reversa
BCP - RP
Lanças, F.M. Cromatografia líquida moderna, 2009 – com modificações

54. Qual a coluna?
 Se solúvel em hexano, a amostra não é polar:
- Sílica gel
- Alumina
- Ciano
 Se solúvel em MeOH:
- RP-18 ou ODS
- RP-8
- Fenil

55. Qual a coluna?
 Comprimento:
- Começar com 15 cm, 5mm
- Maior comprimento, maior TR
 Diâmetro da partícula:
- 10 e 5 µm
 Diâmetro interno:
- 4 mm ~ 1mL/min.
- 2 mm ~ 250µL/min.

56. Fase Móvel:
 Começar com solvente forte, fluxo rápido.
- Obtenha os picos;
- Reduza a força do solvente, se necessário.
 Meça os picos eluídos e otimize a seletividade.
 Aumente o N: fluxo mais lento, menos amostra, maior
T°C, comprimento maior, partículas menores.

57. TROUBLESHOOTING

58. DIAGNÓSTICO DE PROBLEMAS:
 ALARGAMENTO DOS PICOS:
- TR alto
- Viscosidade da FM muito alta
- Eficiência pobre da coluna
- Eluição de analítos de injeções anteriores
- Dispersão do pico na válvula de injeção
- Coluna com grande volume extra
- Volume da cela do detector muito grande

59. DIAGNÓSTICO DE PROBLEMAS:
 PICOS FANTASMAS:
- Contaminação
- Eluição posterior de analítos retidos
- Água contaminada em FR
- Interferentes desconhecidos na amostra
Branco?
Padrão?

60. DIAGNÓSTICO DE PROBLEMAS:
 Formação de cauda frontal:
- Formação de caminhos preferenciais
- Sobrecarga da coluna
- Cauda lateral: TR elevado, degradação coluna, volume morto

61. DIAGNÓSTICO DE PROBLEMAS:
 Sobreposição de picos:
- Frit entupido
- Co-eluição de interferentes (corrida atual ou anterior)
- Sobrecarga da coluna (uso ou volume)

62. DIAGNÓSTICO DE PROBLEMAS:
 Mudanças no tempo de retenção:
- Contaminantes
- Tempo de condicionamento insuficiente
- Poucas injeções anteriores (sítios ativos)
- Mistura inadequada da FM ou evaporação seletiva
- Temperatura variável da coluna
- Sobrecarga da coluna com amostra
- Fluxo instável
- Degradação da coluna

63. DIAGNÓSTICO DE PROBLEMAS:
 Pressão alta:
- Entupimento
- Viscosidade muito alta da FM
- Crescimento de microorganismos
- Precipitação de sais
- Adsorção irreversível na coluna
 Pressão baixa:
- Vazamentos
- Válvula de purga aberta ou com vazamento

64. ANÁLISE QUALITIVA:
 Tempo de retenção: característico do composto, mas não
exclusivo dele.
 TR varia com a coluna, fase móvel e temperatura.
 Identificação por fortificação.
 PDA: mais informações sobre o composto.
 Sistemas acoplados “on-line” ou “off-line” (Ex: LC-MS).

65. ANÁLISE QUANTITATIVA:
 Normalização da área simples
 Normalização da área corrigida
 Padrão externo: curva de calibração
 Padrão interno: curva de calibração com adição de padrão
interno a cada ponto da curva.
Massa A (%) = área A x 100
área total
Massa A (%) = área A / FC x 100
área total / FC
Fator de correção: massa / área

66. VALIDAÇÃO:
 Instrumento
- Check-list do aparelho
- Testes nos módulos
 Método
- Definir os parâmetros da validação objetivo da análise
- Exatidão e precisão
- Sensibilidade
- LD e LQ
- Linearidade
- Recuperação
- ...

67. ALGUMAS APLICAÇÕES
PRÁTICAS:
 AFLATOXINAS
 DERIVADOS DE PURINAS
 ÉSTERES DE FORBOL

68. AFM1 EM FLUIDOS BIOLÓGICOS:

69. AFM1 EM FLUIDOS BIOLÓGICOS:
 Parâmetros cromatográficos:
- CLAE (Shimadzu)
- Extração com colunas de imunoafinidade
- Fase reversa, C18, 250 x 4,6mm, 3 µm (Phenomenex)
- Fase móvel: ACN:H2O (75:25, v/v), isocrática
- Detector de fluorescência
- Volume de Injeção de 100 µL (manual)
- Quantificação em ppt
- Tempo de retenção e derivatização para qualificação

70. AFM1 EM FLUIDOS BIOLÓGICOS:
AFM1 em urina Amostra derivatizada – confirmação AFM1

71. DERIVADOS DE PURINAS:
 Parâmetros cromatográficos:
- CLAE (Agilent 1100)
- Alantoína, creatinina, ácido úrico, hipoxantina e xantina
- Diluição / centrifugação
- Fase reversa, C18, 250 x 4,6mm (Zorbax)
- FM - tampão A: NH4H2PO4 0,0025 M e tampão B (tampão A:MeOH,
19:1)
- Detector: Arranjo de fotodiodos
- Volume de Injeção de 20uL (automática)
- Quantificação em ppb
- Qualificação por comparação espectral

72. DERIVADOS DE PURINAS:
CREATININA
ÃC. ÚRICO

73. ÉSTERES DE FORBOL:
 Parâmetros cromatográficos:
- CLAE (Agilent 1100)
- Extração por solvente / centrifugação
- Fase reversa, C18, 250 x 4,6mm (Zorbax)
- FM – ACN, tampão B (1,75mL de ácido ortofosfórico, 85%) e
THF (eluição gradiente)
- Detector: Arranjo de fotodiodos
- Volume de Injeção de 20uL (automática)
- Quantificação em ppb
- Qualificação por comparação espectral

74. ÉSTERES DE FORBOL:
min
0 5 10 15 20 25
mAU
0
50
100
150
200
250
DAD1 E, Sig=284,8 Ref=360,100 (LANACURVA TPA 1250PPM 22ABRIL 2 F_OTIMIZADO.D)
3.048
17.789
21.528
21.713
21.785
24.143
26.775
26.850
26.904
n m
225 250 275 300 325 350
m A U
0
10
20
30
40
50
*D A D 1, 17.787 (63.9 m A U , - ) R ef= 17.600 & 18.067 of 250P P M 22A B R IL 2 F_O TIM IZA D O .D
n m
225 250 275 300 325 350
m A U
0
10
20
30
40
50
D AD 1, 17.600 (4.4 m AU , - ) of 250PPM 22ABR IL 2 F_O TIM IZAD O .D
D AD 1, 18.067 (4.6 m AU , - ) of 250PPM 22ABR IL 2 F_O TIM IZAD O .D
D AD 1, 17.787 (67.2 m AU , - ) of 250PPM 22ABR IL 2 F_O TIM IZAD O .D
FORBOL - TPA

75. Considerações Finais:
 SÉCULO XXI:
UPLC ou U-HPLC
LC-MS
Cromatografia Multidimensional (LC-LC ou LC/LC, idem CG)
Cromatografia Abrangente (LCxLC ou CGxCG)

76. OBRIGADA!
acromero@cena.usp.br
(19) 3429-4811