Universidade Federal de Mato Grosso
Disciplina: Taxonomia de Fungos Filamentosos, com ênfase em
Endofíticos
Docente: Profº...
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SEQUENCIAMENTO E MÉTODOS
EM METABOLÔMICA DE PROTEÍNA
- COM APLICAÇÕES
Ciências Ômicas
Plataformas tecnológicas que visam isolar e
caracterizar biomoléculas.
As mais comuns são a genômica, a ...
ESQUEMA DA CIÊNCIAS ÔMICAS
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ESQUEMA DAS CIÊNCIAS ÔMICAS
Villas-Bôas & Gombert (2006).
Metabolômica
Visa as pequenas moléculas que compõem o metabolismo
celular – isto é, os metabólitos – tanto para
caracteri...
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METABOLÔMICA
Villas-Bôas & Gombert, 2006
Conceitos Importantes
Caracterização metabólica:
Isolamento de moléculas alvo e a caracterização de sua via
de síntese.
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Etapas da Metabolômica
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Gautam et al., (2007).
Técnicas experimentais
Eletroforese 2D
 Método para separação e
visualização de proteínas;
 Separação por carga e massa...
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A primeira dimensão
(separação por ponto isoelétrico)
Gel com um gradiente de pH
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Corrente elétrica leva
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Ponto Isoelétrico (PI)
Separação por carga:
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Alto pH:
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A segunda Dimensão
(separação por massa)
pH gel strip e colocado em um gel SDS;
SDS desnatura a proteína (movimento
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Gautam et al., (2007).
Exemplo de técnica de 2D-gel
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Vantagens
Boa resolução para
proteínas;
Detecção de modificações
pós-transcricionais.
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 Não funciona bem para
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Exemplo de experimento 2-D gel
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Gautam et al., (2007).
Análise de dados do experimento 2-D gel
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Exemplo de experimento 2-D gel
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Protein identification via 2DE and MALDI-TOF PMF
Kim et al., (2007)
Exemplo de experimento 2-D gel
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Kim et al., (2007)
O que é Espectrometria de
massa?
Ferramenta analítica para determinar a composição
molecular de uma amostra ou os pesos m...
Que tipo de informação é gerada?
Informação estrutural;
Tandem de espectrometria de massa – particularmente, uma
sequenc...
Como funciona um espectrômetro?
3 partes fundamentais: fonte de ionização, o analisador e o
detector
Amostras fáceis de ...
Esquematização de um espectrômetro
O analisador, o detector e o ionizador estão em vácuo, para
evitar movimento indesejad...
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mcponline.org
Esquema típico de um TOF-MS
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http://www.abrf.org/abrfnews/1997/june1997/jun97lennon.html
Introdução da amostra e Ionização
Ionização direta ou via cromatografia para separação de
componentes (HPLC, GC, eletrofo...
Metodologias de Ionização
Pressão atmosférica Ionização Química (APCI);
Ionização Química (CI);
Impacto de Elétron (EI)...
Detecção dos Íons
O detector monitora o íon, amplifica seu sinal e o transmite
para o sistema
Detectores comuns: fotomul...
Espectrometria de massas é uma metodologia
poderosa para analisar a estrutura de compostos
orgânicos, mas tem algumas limi...
Tandem MS ou MS/MS tem 2
espectro de massa em série:
O primeiro (MS1) é usado para selecionar, de uma fonte
primária de ío...
Sequenciamento de peptídeos
Peptídeos de 2.5 kDa ou menos dão melhores resultados.
Proteínas retiradas de géis 2-D e dig...
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Identificação de proteínas por MS
Espectro
artificial
Tripsinizado
artificialmente
Database de
sequências
(ex. SwissProt)
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Como funciona o sequenciamento de proteínas
Tandem MS: dois analisadores de
massa em série com uma célula de
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Bioinformática e Integração de
técnicas e conhecimentos
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Espindola et al., 2010
Exemplo de Experimento com MS
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Vantagens
Determinação de
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Etapas da Metabolômica
Fatores que influenciam as análises metabolômicas
durante a seleção do organismo a ser analisado:
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Etapas da Metabolômica
Fatores que influenciam as análises metabolômicas
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Quantidade de amo...
Etapas da Metabolômica
 Fatores que influenciam as análises metabolômicas
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Etapas da Metabolômica
Técnicas comumente utilizadas no fracionamento:
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RMN e EMFT-ICR-MS
Etapas da Metabolômica
Requisitos básicos para realizar análises
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Grande capital para investimento;
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Fator que influencia as análises
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Etapas da Metabolômica
Principal metodologia de análise estatística:
Análise de Componente Principal (ACP):
Identificaç...
Aplicabilidade da Metabolômica
Aplicações em diversas áreas:
Farmacologia;
Nutrição;
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Metabolômica na nutrição
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Metabolômica na ecologia
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Identificar metabólitos comuns e
diferenciais entre plantas
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Metabolômica na ecologia
 Diferenciação de populações a partir de RMN de biofluidos:
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Perspectivas para a Metabolômica
Determinação de um protocolo padrão;
Desenvolvimento de ferramentas para um melhor
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Considerações finais
Ômica mais nova e bastante promissora;
Grupo de moléculas muito diverso;
Necessita de padronização...
Referências
• Kim, Y., Nandakumar, M. P., & Marten, M. R. (2007). Proteome map of Aspergillus nidulans during osmoadaptati...
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Sequenciamento e métodos em metabolômica de proteína

  1. 1. Universidade Federal de Mato Grosso Disciplina: Taxonomia de Fungos Filamentosos, com ênfase em Endofíticos Docente: Profº Dr. Marcos Antônio Soares Discentes: Mestrando: Adnaldo Brilhante (Pós Graduação em Química). Doutoranda: Ivani Souza Mello (Pós Graduação em Biotecnologia e Biodiversidade - Rede Pró-Centroeste). Cuiabá/ MT 2015
  2. 2. 2 SEQUENCIAMENTO E MÉTODOS EM METABOLÔMICA DE PROTEÍNA - COM APLICAÇÕES
  3. 3. Ciências Ômicas Plataformas tecnológicas que visam isolar e caracterizar biomoléculas. As mais comuns são a genômica, a trancriptômica a proteômica e a metabolômica. A origem etimológica desse termo deriva da genômica: 3 GENE + CROMOSSOMA = GENOMA GENÔMICA
  4. 4. ESQUEMA DA CIÊNCIAS ÔMICAS 4 pt.slideshare.net
  5. 5. 5 ESQUEMA DAS CIÊNCIAS ÔMICAS Villas-Bôas & Gombert (2006).
  6. 6. Metabolômica Visa as pequenas moléculas que compõem o metabolismo celular – isto é, os metabólitos – tanto para caracterização, quanto buscando uma melhor compreensão dos processos biológicos que estão ocorrendo em seus objetos de estudo. 6 Metabólitos Rotas principais Primários Secundários Funções específicas Gautam et al., (2007).
  7. 7. 7 METABOLÔMICA Villas-Bôas & Gombert, 2006
  8. 8. Conceitos Importantes Caracterização metabólica: Isolamento de moléculas alvo e a caracterização de sua via de síntese. Metabolômica: Isolamento de todos os metabólitos de uma amostra biológica em condições normais e sob algum tipo de estresse. Engenharia de metabolismo: Identificação de genes e rotas metabólicas de determinado composto, visando aumentar, reduzir ou eliminar sua produção. 8 Villas-Bôas & Gombert, 2006
  9. 9. Etapas da Metabolômica 9 Gautam et al., (2007).
  10. 10. Técnicas experimentais Eletroforese 2D  Método para separação e visualização de proteínas;  Separação por carga e massa. Espectrometria de Massa  Análise de alta confiabilidade e identificação de proteínas;  Fragmentação de proteínas;  Análise de peptídeos. 10 http://www.neobio.com.br/ www.alunonaweb.com.br
  11. 11. 11 A primeira dimensão (separação por ponto isoelétrico) Gel com um gradiente de pH imobilizado; Corrente elétrica leva proteínas carregadas a se mover até alcançar o ponto isoelétrico. 2D-SDS PAGE gel Gautam et al., (2007).
  12. 12. Ponto Isoelétrico (PI) Separação por carga: 12 4 5 6 7 8 9 10 GradientedepHestável Alto pH: Proteína carregada - Baixo pH: Proteína Carregada + No ponto isoelétrico, a proteína não tem carga e portanto não migra mais no campo elétrico. Gautam et al., (2007).
  13. 13. 13 A segunda Dimensão (separação por massa) pH gel strip e colocado em um gel SDS; SDS desnatura a proteína (movimento somente devido a massa) e elimina carga. 2D-SDS PAGE gel A primeira Dimensão (separação por ponto isoelétrico) Gel com um gradiente de pH imobilizado; Corrente elétrica leva a proteínas carregadas a mover até alcançar o ponto isoelétrico. Gautam et al., (2007).
  14. 14. 14 2D-SDS PAGE gel Gautam et al., (2007).
  15. 15. Exemplo de técnica de 2D-gel 15 Gautam et al., (2007).
  16. 16. Vantagens Boa resolução para proteínas; Detecção de modificações pós-transcricionais. 16  Não funciona bem para proteínas altamente hidrofóbicas  Limitado pelo alcance de pH  Difícil detecção de proteínas pouco abundantes  Análise e quantificação são difíceis Desvantagens franquiastop.com.br
  17. 17. Exemplo de experimento 2-D gel 17 Gautam et al., (2007).
  18. 18. Análise de dados do experimento 2-D gel 18 Gautam et al., (2007).
  19. 19. Exemplo de experimento 2-D gel 19 Protein identification via 2DE and MALDI-TOF PMF Kim et al., (2007)
  20. 20. Exemplo de experimento 2-D gel 20 Kim et al., (2007)
  21. 21. O que é Espectrometria de massa? Ferramenta analítica para determinar a composição molecular de uma amostra ou os pesos moleculares; Somente picomolares de concentrações são requeridas; Acurácia de 0.01%, com somente 5 ppm de pequenas moléculas orgânicas; Para 40 kDa, erro de 4 Da; Pode-se identificar substituições de aminoácidos ou modificações pós-traducionais. 21 Villas-Bôas & Gambert (2006), Wang et al., (2003).
  22. 22. Que tipo de informação é gerada? Informação estrutural; Tandem de espectrometria de massa – particularmente, uma sequencia definida; Fragmentação de amostra – análise de produtos; Sequenciamento de peptídeos; Identificação de compostos individuais em misturas complexas; 22 Wang et al., (2003); Jewett et al., (2006); Espindola et al., (2010).
  23. 23. Como funciona um espectrômetro? 3 partes fundamentais: fonte de ionização, o analisador e o detector Amostras fáceis de manipular se ionizadas Separação no analisador de acordo com a razão massa-carga (m/z) Detecção de íons em separado e abundância relativa Sinais enviados ao sistema de dados e apresentados em um espectro m/z 23
  24. 24. Esquematização de um espectrômetro O analisador, o detector e o ionizador estão em vácuo, para evitar movimento indesejado de íons; A operação está sob completo controle de sistema. 24 Moraes & Lago (2003).
  25. 25. 25 mcponline.org
  26. 26. Esquema típico de um TOF-MS 26 http://www.abrf.org/abrfnews/1997/june1997/jun97lennon.html
  27. 27. Introdução da amostra e Ionização Ionização direta ou via cromatografia para separação de componentes (HPLC, GC, eletroforese capilar); Ionização pode resultar em íons positivamente carregados (proteínas) ou negativamente carregados (sacarídeos e oligonucleotídeos). 27 http://uab.ifsul.edu.br/tsiad/conteudo/modulo1/fis/fis_ua/at1/img/pag03-img03.gif
  28. 28. Metodologias de Ionização Pressão atmosférica Ionização Química (APCI); Ionização Química (CI); Impacto de Elétron (EI); Ionização por Eletro spray (ESI); Bombardeamento Atómico Rápido (FAB); Dessorção de Campo / campo de ionização (FD/FI); Matriz Laser Assistida por Dessorção de Ionização (MALDI); Ionização por Termo spray. 28
  29. 29. Detecção dos Íons O detector monitora o íon, amplifica seu sinal e o transmite para o sistema Detectores comuns: fotomultiplicador, eléctron multiplicador chapa de micro canal 29 altered-states.net prezi.com
  30. 30. Espectrometria de massas é uma metodologia poderosa para analisar a estrutura de compostos orgânicos, mas tem algumas limitações: Nada pode ser caracterizado se não estiver em uma solução DEVIDAMENTE LIMPA; A técnica não tem habilidade de apresentar uma análise seletiva de uma mistura complexa; Para moléculas grandes, resultados são difíceis de interpretar. 30
  31. 31. Tandem MS ou MS/MS tem 2 espectro de massa em série: O primeiro (MS1) é usado para selecionar, de uma fonte primária de íons, aqueles que possuem um m/z particular, o qual passa para a região de fragmentação, onde ocorrerá a dissociação. No segundo (MS2), haverá a análise dos íons gerados. Na verdade, MS1 é uma fonte de íons para MS2. MS2MS1 31
  32. 32. Sequenciamento de peptídeos Peptídeos de 2.5 kDa ou menos dão melhores resultados. Proteínas retiradas de géis 2-D e digeridas; Peptídeos fragmentados nas ligações peptídicas na Tandem da espectrometria de massa; Alguns peptídeos geram informações para uma sequência completa, enquanto a maioria gera sequencias parciais de 4-5 aa; Geralmente essas “tag” de sequencias são suficientes para identificação por database. 32
  33. 33. 33
  34. 34. Identificação de proteínas por MS Espectro artificial Tripsinizado artificialmente Database de sequências (ex. SwissProt) Spot removido do gel Fragmentação com tripsina Espectro dos Fragmentos MATCH Library 34
  35. 35. Como funciona o sequenciamento de proteínas Tandem MS: dois analisadores de massa em série com uma célula de colisão no meio; Célula de colisão: um local aonde os íons colidem com um gás (He, Ne, Ar) resultando em fragmentação do íon; A fragmentação dos petídeos na células de colisão ocorre de maneira previsível, principalmente nas ligações peptídicas; Os íons resultantes tem massas que são consistentes com uma database de pesos moleculares de dipeptídeos, tripeptídeos, tetrapeptídeos. 35 Ser-Glu-Leu-Ile-Arg-Trp Célula de colisão Ser-Glu-Leu-Ile-Arg Ser-Glu-Leu Ser-Glu-Leu-Ile Etc…
  36. 36. Bioinformática e Integração de técnicas e conhecimentos 36 Espindola et al., 2010
  37. 37. Exemplo de Experimento com MS 37 http://iitb.vlab.co.in/userfiles/Slide2%289%29.jpg
  38. 38. 38 Exemplo de Experimento com MS Gautam et al, 2007
  39. 39. Vantagens Determinação de peso molecular e sequencia de aa; Detecção de modificações pós- transcricionais; Alta confiabilidade. 39  Alto custo  Requer sequencia de peptídeos em database. Desvantagens franquiastop.com.br
  40. 40. Etapas da Metabolômica Fatores que influenciam as análises metabolômicas durante a seleção do organismo a ser analisado: Tratamento; Idade; Tamanho. 40 www.bagozzi.edu.br novosinsolitos.blogspot.com
  41. 41. Etapas da Metabolômica Fatores que influenciam as análises metabolômicas durante o preparo da amostra: Quantidade de amostra; Maceração; Horário de coleta. 41 Villas-Bôas & Gombert (2006).
  42. 42. Etapas da Metabolômica  Fatores que influenciam as análises metabolômicas durante o pré fracionamento:  Escolha do solvente mais adequado;  Evitar interferência nos equipamentos;  Evitar reações indesejadas entre o solvente e a amostra. 42
  43. 43. Etapas da Metabolômica Técnicas comumente utilizadas no fracionamento: 43 RMN e EMFT-ICR-MS
  44. 44. Etapas da Metabolômica Requisitos básicos para realizar análises metabolômicas: Grande capital para investimento; Espaço físico adequado; Profissionais capacitados. 44 http://aston.chem.purdue.edu/research/metabolomics
  45. 45. Etapas da Metabolômica Fator que influencia as análises metabolômicas durante a conversão de valores: Colocar os resultados obtidos por diferentes técnicas de fracionamento em uma linguagem comum. 45 www.nextidea.com.brMorgenthal (2005); Espindola et al., (2010)
  46. 46. Etapas da Metabolômica Principal metodologia de análise estatística: Análise de Componente Principal (ACP): Identificação de componentes mais abundantes; Organização hierárquica dos componentes identificados. 46 Morgental (2005)
  47. 47. Aplicabilidade da Metabolômica Aplicações em diversas áreas: Farmacologia; Nutrição; Ecologia; Evolução; 47 Villas-Bôas & Gombert (2006); Weckwerth & Fiehn, 2002..
  48. 48. Metabolômica na farmacologia 48 Seleção Síntese Industrialização Ensaios de toxicidade in vitro e in vivo Busca de marcadores de toxicidade Mecanismos de toxicidade Villas-Bôas & Gombert (2006); Weckwerth & Fiehn, 2002..
  49. 49. Metabolômica na nutrição Conhecer as modificações causadas pela alimentação no metaboloma do indivíduo: 49 Villas-Bôas & Gombert (2006); Weckwerth & Fiehn ( 2002). www.scielo.br
  50. 50. Alimento Nutrientes Não- nutrientes FitoquímicosInsumos agrícolas Micro- nutrientes Macro-nutrientes Contaminantes Defensivos Metabolômica na nutrição 50
  51. 51. Metabolômica na ecologia Observar diferenças imprevistas entre cultivares selvagens e modificadas geneticamente:  Glutamato desidrogenase em Nicotiana tabacum (Mungur et al., 2005):  + de 350 compostos alterados;  9 compostos carcinogênicos;  14 fármacos em potencial. 51
  52. 52. Metabolômica na ecologia Identificar metabólitos comuns e diferenciais entre plantas resistentes e susceptíveis a uma determinada praga: Já realizado pela transcriptômica e pela proteômica; Poucos trabalhos utilizando a metabolômica (Forst, 2006). 52 br.freepik.com
  53. 53. Metabolômica na ecologia  Diferenciação de populações a partir de RMN de biofluidos:  Haliotis rufescens (mariscos) – (Viant et al., 2003);  Organização evolutiva a partir da presença de determinados metabólitos:  Streptomyces – (Challis & Hopwood, 2003); 53
  54. 54. Perspectivas para a Metabolômica Determinação de um protocolo padrão; Desenvolvimento de ferramentas para um melhor aproveitamento dos dados gerados; Integração das ômicas (Biologia de Sistemas). 54
  55. 55. Considerações finais Ômica mais nova e bastante promissora; Grupo de moléculas muito diverso; Necessita de padronização e melhoramento das técnicas. 55
  56. 56. Referências • Kim, Y., Nandakumar, M. P., & Marten, M. R. (2007). Proteome map of Aspergillus nidulans during osmoadaptation. Fungal Genetics and Biology,44(9), 886-895. • Moraes, M. C. B., & do Lago, C. L. (2003). Espectrometria de massas com ionização por" electrospray" aplicada ao estudo de espécies inorgânicas e organometálicas. Química Nova, 26(4), 556-563. • Espindola, F. S., Calábria, L. K., de Rezende, A. A. A., Pereira, B. B., Santana, F. A., Amaral, I. M. R., ... & de Araújo, T. G. (2010). Recursos de bioinformática aplicados às ciências ômicas como genômica, transcriptômica, proteômica, interatômica e metabolômica= Bioinformatic resources applied on the omic sciences as genomic, transcriptomic, proteomic, interatomic and metabolomic. Bioscience Journal, 26(3). • Villas-Boas, S. G., & Gombert, A. K. (2006). Análise do Metaboloma—Uma ferramenta biotecnológica emergente na era pós —genômica. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, 9(36), 58-69. • Weckwerth, W., & Fiehn, O. (2002). Can we discover novel pathways using metabolomic analysis?. Current Opinion in Biotechnology, 13(2), 156-160. • TAN, K. C., Ipcho, S. V., Trengove, R. D., Oliver, R. P., & Solomon, P. S. (2009). Assessing the impact of transcriptomics, proteomics and metabolomics on fungal phytopathology. Molecular Plant Pathology, 10(5), 703-715. • Hofmann, G., McIntyre, M., & Nielsen, J. (2003). Fungal genomics beyond Saccharomyces cerevisiae?. Current opinion in biotechnology, 14(2), 226-231. • Jewett, M. C., Hofmann, G., & Nielsen, J. (2006). Fungal metabolite analysis in genomics and phenomics. Current opinion in biotechnology, 17(2), 191-197. • Weckwerth, W., & Morgenthal, K. (2005). Metabolomics: from pattern recognition to biological interpretation. Drug discovery today, 10(22), 1551-1558. • Szewczyk, R., Soboń, A., Słaba, M., & Długoński, J. (2015). Mechanism study of alachlor biodegradation by Paecilomyces marquandii with proteomic and metabolomic methods. Journal of hazardous materials, 291, 52-64. • Wang, W., Zhou, H., Lin, H. U. A., Roy, S., Shaler, T. A., Hill, L. R., ... & Becker, C. H. (2003). Quantification of proteins and metabolites by mass spectrometry without isotopic labeling or spiked standards. Analytical chemistry, 75(18), 4818-4826. • Hollywood, K., Brison, D. R., & Goodacre, R. (2006). Metabolomics: current technologies and future trends. Proteomics, 6(17), 4716-4723. • Roessner, U., & Bowne, J. (2009). What is metabolomics all about?.Biotechniques, 46(5), 363. • Albright, J. C., Henke, M. T., Soukup, A. A., McClure, R. A., Thomson, R. J., Keller, N. P., & Kelleher, N. L. (2015). Large- Scale Metabolomics Reveals A Complex Response of Aspergillus nidulans to Epigenetic Perturbation.ACS chemical biology. 56

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