Roteiro da Prática 2 - Aminoacidos e Proteinas Curso de Bioquímica I - Profa. Dra. Maria Tereza Marques Novo Mansur UFSCar - São Carlos

1. Universidade Federal de São Carlos - Prof. Dr. Iran Malavazi/ Profa. Dra. M. Teresa M. Novo
1
Disciplina de Bioquímica I – Curso de Química - UFSCar
Prática 2- AMINOÁCIDOS E PROTEÍNAS
A - REAÇÕES GERAIS PARA IDENTIFICAÇÃO DE PROTEINAS E AMINOÁCIDOS
A.1. Reação de ninidrina – Identificação de aminoácidos
Adicione a um tubo de ensaio, 2 mL da solução de glicina 0,1 M e 5 gotas de
ninidrina em álcool. Fazer um tubo como branco: 2 mL H2O, 5 gotas de ninidrina em
álcool.
TUBO Glicina 0,1 M Ninidrina em álcool água Cor observada
1 (amostra) 2 mL 5 gotas -
2 (branco) - 5 gotas 2 mL
Ferva os tubos durante 1 ou 2 minutos.
Observe e explique o aparecimento de coloração azul na solução por meio de
reação química.
A.2. Prova do biureto – Pesquisa da ligação peptídica
Proceder segundo o protocolo a seguir:
TUBO Soro (1:3)
Gelatina
2%
Glicina 0,1 M água
NaOH
2 mol/L
CuSO4
0,5%
Cor
observada
3 2,0 mL -- -- -- 2,0 mL 8 gotas
4 -- 2,0 mL -- -- 2,0 mL 8 gotas
5 -- -- 2,0 Ml -- 2,0 mL 8 gotas
6
(branco)
-- -- -- 2,0 mL 2,0 mL 8 gotas
Misture bem a solução após a adição de cada gota. O aparecimento de uma
coloração violeta indica a presença de ligações peptídicas.
Observe e explique o aparecimento de coloração na solução por meio de reação
química.
A.3. Reação de Folin-Ciocalteau
Proceder segundo o protocolo a seguir:
TUBO
Solução de
tirosina
NaOH
2 mol/L
H2O
destilada
Soro
1:3
Reagente de
Folin
Cor
observada
7 0,2 mL 0,6 mL 8 mL - 0,3 mL
8 - 0,6 mL 8 mL 0,2
mL
0,3 mL
9 (branco) - 0,6 mL 8,2 mL - 0,3 mL
Adicionar o reagente de Folin a todos os tubos lentamente. Discutir as cores
observadas em cada tubo.

2. Universidade Federal de São Carlos - Prof. Dr. Iran Malavazi/ Profa. Dra. M. Teresa M. Novo
2
Disciplina de Bioquímica I – Curso de Química - UFSCar
Observe e explique o aparecimento de coloração na solução por meio de reação
química. A reação de Folin funciona para qualquer aminoácido? Explique.
A.4. Reação Xantoprotéica
Proceder segundo o protocolo a seguir:
TUBO
Amostra
Soro (1:3)
Tirosina
(0,1 M)
Glicina
(0,1 M)
água
HNO3
concentrado
Cor
observada
A 2 mL - - - 0,25 mL
B - 2 mL - - 0,25 mL
C - - 2 mL - 0,25 mL
D (branco) - - - 2,0 mL 0,25 mL
Ferver com cuidado cada tubo por dois minutos em banho-maria;
Após resfriar, adicione, gota a gota o 0,25 mL da solução de NaOH 12 M;
Misture,observe e anote os resultados.
Observe e explique o aparecimento de coloração na solução por meio de reação
química.
B – REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS
B.1. PRECIPITAÇÃO IRREVERSÍVEL
B.1.1. Desnaturação pelo calor
No tubo de ensaio 10, pipetar 2 mL de solução de plasma bovino 1:3. e aquecer
diretamente na chama. Observar e explicar.
OBSERVAÇÃO: preparar 15 mL dessa diluição pois ela será utilizada outras vezes
ao longo do roteiro. Para tanto utilize 5 mL de soro e 10 mL de água destilada.
B.1.2. Desnaturação por ácidos
Montar os tubos conforme a tabela:
TUBO 11 TUBO 12
Plasma diluído 1:3 1 mL 1 mL
TCA (20%) 1 mL -
HNO3 (1 mol/L) - 1 mL
Observar a formação do coágulo e explicar.
B.1.3. Desnaturação por metais pesados
TUBO 13
Soro diluído 1:3 1 mL
AgNO3 1 mol/L 1 ml
Observar a formação do coágulo e explicar.

3. Universidade Federal de São Carlos - Prof. Dr. Iran Malavazi/ Profa. Dra. M. Teresa M. Novo
3
Disciplina de Bioquímica I – Curso de Química - UFSCar
B.1.4. Desnaturação por solventes orgânicos
TUBO 14 TUBO 15
Soro diluído 1:3 1 mL 1 mL
Acetona 100% --- 1 ml
Etanol absoluto 1 mL ---
Observar a formação do coágulo e explicar o seu aparecimento.
B.1.5. Precipitação fracionada pelas soluções salinas concentradas
Adicione 5 mL de solução saturada de (NH4)2SO4 em 5 mL de plasma diluído 1:3
(TUBO 16). O precipitado formado deve ser tratado de acordo com o fluxograma a seguir:
* A saturação é atingida quando não é mais possível dissolver o sal adicionado.
** Filtar utilizando papel de filtro colocado sobre um tubo falcon de 50 mL.
Nos tubos de ensaio 19 e 20, coloque 2,0 mL de água destilada e dissolva no
primeiro tubo o precipitado I e no segundo o precipitado II. Faça o teste do biureto nos
três tubos (18, 19 e 20). Para o teste do tubo 18 (filtrado II), retire uma alíquota de 2,0 mL.
Para cada tubo teste adicione 2,0 mL de NaOH 2 mol/L e 500 µL de CuSO4 0,5%.
Descrever porque ocorreu a precipitação fracionada das proteínas. Explique quais
proteínas podem estar presentes no precipitado I e no precipitado II.
B.2. PRECIPITAÇÃO REVERSÍVEL
B.2.1. Salting-in- solubilização
Pipetar 3 mL de clara de ovo no béquer. Adicionar 10 mL de H2O e agitar com um
bastão de vidro até a precipitação. Juntar NaCI 1 mol/L até redissolução do precipitado.
B.2.2. Salting-out- precipitação
Da solução de proteína obtida no item (a), pipetar 3 mL para o tubo 21. Adicionar 3
mL de (NH4)2SO4 e observar o precipitado formado de proteínas não-desnaturadas. Em
Filtrar **
(TUBO 17)
Precipitado Filtrado + (NH4)2SO4 sólido
Filtrar **
Precipitado Filtrado
(até saturação)*(I)(I) (TUBO 19)
(II) (TUBO 18)
Soro (1:3) + (NH4)2SO4 (sol. saturada)
(II) (TUBO 20)

4. Universidade Federal de São Carlos - Prof. Dr. Iran Malavazi/ Profa. Dra. M. Teresa M. Novo
4
Disciplina de Bioquímica I – Curso de Química - UFSCar
seguida, adicionar 5 mL de H20 destilada. Fazer a inversão do tubo lentamente,
observando a re-dissolução do precipitado de proteínas.
Discutir os resultados e o fundamento das técnicas de salting in e salting out.
C. DETERMINAÇÃO DO pH DA CASEÍNA por precipitação isoelétrica
Preparar 5 tubos de ensaio contendo caseína (0.5% em pH 8,5), de acordo com a
tabela:
Tubo Água (mL) Caseína, pH 8,5
(mL)
Ácido Acético 0,1 M (µL) pH
1 4,5 0,5 10
2 4,45 0,5 50
3 4,35 0,5 150
4 4,0 0,5 500
5 - 0,5 4500
Agitar bem os tubos e medir o pH (com papel indicador universal). Observar se
ocorre precipitação e registrar os resultados de maneira comparativa, em uma escala de 4
sinais positivos para o tubo de precipitação máxima.
Resultados: Verificar a precipitação considerando os sinais +;++;+++;++++, quanto maior
for a precipitação.
Determinar o pH que correponde ao provável pI da caseína e comparar com os valores da
literatura.
Questões para o relatório
Nesta aula você realizou a quantificação de proteínas pelo método do biureto. Agora
pesquise e descreva como funcionam os seguintes métodos também amplamente
utilizados para a quantificação de proteínas:
Método de Lowry
Método do ácido Bicinchônico
Método de Bradford
Descreva para cada um desses métodos a metodologia empregada para cada um, os
reagentes utilizados e a sensibilidade de cada teste. Pesquise também sobre a
sensibilidade do método do Biureto.