Enzimas

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Aula prática lecionada no Laboratório de Graduação em Bioquímica (LGBioq) da Universidade Federal do Maranhão (UFMA).

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Enzimas

  1. 1. MONITORIABIOQUIMICA CURTA-NOS NO FACEBOOK: WWW.FACEBOOK.COM/LGBIOQ
  2. 2. Enzimas Universidade Federal do Maranhão
  3. 3. Introdução A manutenção da vida celular depende de um complexo conjunto de reações químicas, que: Devem ocorrer em velocidades adequadas; Precisam de ser altamente específicas. A presença de enzimas dirigindo as reações celulares atende a esses quesitos.
  4. 4. Introdução As enzimas são catalisadores biológicos e como tal aumentam de várias ordens de grandeza a velocidade das reações que catalisam. Até recentemente admitia-se que todos os catalisadores biológicos fossem proteicos, mas a revelação das ribozimas, constituídas de moléculas específicas de RNA, desfez esse conceito.
  5. 5. Introdução O aumento na velocidade da reação de 3 fatores principais: Aumento na concentração de reagentes; Aumento da temperatura do meio; Diminuição da energia livre de ativação. Catalisadores biológicos Podem ser potencialmente tóxicos às células
  6. 6. Introdução A eficiência dos catalisadores biológicos de muito deriva de sua especificidade, graças à: Forma do sítio ativo ou centro ativo; Cadeia lateral dos aminoácidos desse sítio ativo ou centro ativo.
  7. 7. Introdução A relação substrato-enzima é explicada por várias teorias: Teoria de Fischer, que propõe o modelo chave-fechadura, onde enzima e substrato seriam complementares num modelo extático. Teoria de Koshland, que propõe o modelo de encaixe induzido, onde o substrato se encaixa na enzima durante a catálise num modelo dinâmico.
  8. 8. Introdução Assim, existem 4 vantagens dos catalisadores biológicos sobre os catalisadores inorgânicos: Diminuição da energia de ativação e indução de altas velocidades de reação; Alta especificidade; Sintetizados pelas próprias células; Concentração e atividade moduláveis.
  9. 9. Caracterização da Urease A urease é o catalisador biológico responsável pela conversão da ureia em amônia e dióxido de carbono: Essa enzima é encontrada em bactérias, fungos e plantas.
  10. 10. Caracterização da Urease Reação de Biureto A reação de biureto serve para a demonstração da natureza proteica da urease, conforme se espera da maioria dos catalisadores biológicos. Reagente de biureto: volumes iguais de NaOH a 12M e solução de CuSO4 a 0,5% gota a gota. ❖ Fundamento teórico: quando a urease - que é proteína - é colocada na presença de reagente de biureto, obtém-se um composto de coloração violeta pela interação dos átomos de nitrogênio dos resíduos de aminoácidos da urease com íons Cu2+ disponibilizados pelo CuSO4 do reagente de biureto.
  11. 11. Caracterização da Urease Reação de Heller A reação de Heller serve para a demonstração da natureza proteica da urease, conforme se espera da maioria dos catalisadores biológicos. Ácido nítrico ❖ Fundamento teórico: o ácido nítrico é um bom fornecedor de ânions, de forma que suas interações com a urease, que é uma proteína, a provocam a formação de um sal onde a urease atua como cátions.
  12. 12. Reação de Biureto Procedimentos Práticos 2mL de água destilada 2 gotas de solução de urease 2mL de reagente de biureto 2mL de água destilada2mL de reagente de biureto
  13. 13. Procedimentos Práticos Reação de Biureto ❖ No tubo de ensaio com solução de urease espera-se a formação de coloração violeta. ❖ No tubo de ensaio com água destilada espera-se a não mudança de cor. A reação de biureto deverá ser positiva para a solução de urease, que é uma proteína; em contrapartida, não deve haver reação com água destilada (controle negativo).
  14. 14. Procedimentos Práticos Reação de Heller ❖ Ao colocar o acido nítrico, cuidar para que ele escorra lentamente pela parede do tubo. 1mL de ácido nítrico 4 gotas de solução de urease 2mL de água destilada
  15. 15. Procedimentos Práticos Reação de Heller ❖ Espera-se o surgimento de um anel branco entre a soluão de urease e o ácido nítrico. A formação nativa de uma proteínas é estável apenas numa faixa estreita de valores de pH, uma vez que em determinados valores de pH onde há excesso de cargas positivas, as repulsões coulombianas correspondentes concorrem para desestabilizar a estrutura compacta da proteína. Assim, na reação de Heller, a partir de tratamento com ácido nítrico, induz-se alteração na carga líquida de proteínas e consequente precipitação, onde o ácido nítrico atua como fornecedor de ânions e as proteínas atuam como fornecedor de cátion.
  16. 16. Polifenoloxidase A polifenoloxidase ou monofenol monoxigenase é um catalisador biológico pertencente ao grupo das oxirredutases, responsáveis por reações de oxirredução em sistemas biológicos. A polifenoloxidase é responsável pelo escurecimento enzimá- tico de frutas e demais vegetais quando cortados e expostos. TEMPO
  17. 17. Cada espécime de plantas, fungos, bactérias e animais pode possuir pequenas variações em suas polifenoloxidases. A polifenoloxidase é o único catalisador biológico necessário para a conversão do aminoácido tirosina em melanina, susbtância de coloração preta; as demais etapas são espontâ- neas. Polifenoloxidase Estrutura 3D da polifenoloxidase da batata-doce
  18. 18. Polifenoloxidase Tirosina Devagar Polifenoloxidase DOPA-quinonaDOPA Devagar Rápido Relativamente devagar Leuco- -composto DOPAcromo5,6-dihidroxindol Melanina Indol-5,6-quinona
  19. 19. Escurecimento Enzimático de Alimentos O escurecimento enzimático de alimentos serve para a demonstração da ação de polifenoloxidases presentes em diversos frutos, notadamente os de polpa de coloração mais clara. ❖ Fundamento teórico: frutas e vegetais, que contêmm compostos polifenólicos, quando cortados e expostos ao ar atmosférico, sofrem escurecimento, causado pela ação da polifenoloxidase sobre esses compostos polifenólicos, que são então oxidados a ortoquinonas. Por sua vez, essas ortoquinonas polimerizam-se com facilidade, formando compostos escuros, como a melanina.
  20. 20. Procedimentos Práticos Cortar em vários pedaços (longe do miolo) 1 PEDAÇO NO REFRIGERADOR AOS DEMAIS, 2 GOTAS DE LIMÃO EM TEMPERATURA AMBIENTE 1 PEDAÇO À TEMPERATURA AMBIENTE hora
  21. 21. ❖ Espera-se que os pedaços de maçã e batata-doce que permaneceram à temperatura ambiente tenham a polpa mais escurecida. ❖ Os pedaços de maçã e batata-doce que permaneceram no refrigerado e à temperatura ambiente com adição de duas gotas de limão devem ter escassa ou nenhuma polpa escurecida, permanecendo aproximadamente como dantes. Os pedaços de maçã e batata doce que permaneceram à temperatura ambiente tiveram melhor cinética das suas polifenoloxidases, com conversão de tirosina em melanina e consequente aquisição de coloração mais escura em polpa. Já aqueles pedaços encaminhados ao refrigerador e expostos ao limão tiveram cinética comprometida pelo menor temperatura e pelo contato com vitamina C, respectivamente - dois retardadores dos processos de oxidação. Procedimentos Práticos
  22. 22. Referências HIRANO, ZMB et al. Bioquímica - Manual Prático. 1 ed. Blumenau: Edifurb, 2008. DOS SANTOS, APSA et al. Bioquímica Prática. Disponível em: <http://www.repositorio.ufma.br:8080/ jspui/handle/1/445>. Acesso em: 3 set 2013.

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