A reação em cadeia da polimerase (PCR) permite a amplificação in vitro de uma sequência específica de DNA através de replicação repetida. A PCR tem aplicações no diagnóstico de doenças, clonagem de genes, determinação de variabilidade genética e outros. O processo envolve extração de DNA, delineamento de primers, reação de PCR e análise dos resultados.

1. REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

2. PCR
Polymerase Chain Reaction
Amplificação in vitro de uma
seqüência específica de DNA
* replicação in vitro

3. Aplicações da Técnica de PCR
 Diagnóstico de doenças infecciosas e genéticas
 Amplificação de genes para posterior clonagem e
expressão
 Determinação de variabilidade genética
 Deteção de OGMs
 Sexagem de embriões
 Estudo da expressão gênica

4. História
 Kary Mullis (1983)
 Prêmio Nobel Química (1993)
 Revolucionou genética
pesquisa genética
medicina forense
genética molecular

5. Componentes da reação
 DNA molde
 Oligonucleotídeos (primer)
 dNTP’s
 DNA Polimerase
 Magnésio
 Tampão
 Água

6. Equipamento
TERMOCICLADOR

7. CICLOS
Programa PCR
94 0C por 5 min
94 0C por 1 min
55 0C por 1 min 35 ciclos
72 0C por 1 min
72 0C por 5 min
4 0C

8. ETAPAS
-Extração de DNA
-Desenho dos Primers
-Reação de PCR
- Análise dos resultados

9. Obtenção do DNA genômico

10. DELINEAMENTO DE PRIMERS
Os iniciadores (oligos / primers) são a
chave do sucesso ou da falha de um
experimento com PCR.
- Tamanho dos primers;
- Estabelecimento das temperaturas corretas a serem utilizadas;

11. DELINEAMENTO DE PRIMERS
Primer Forward
5’ TAGAAGCTTCCAGCCATGAACTCAG 3’
Tm: 57.9
Enzima: Hind III
Anelamento: 16 nt
Total primer: 25 nt
Primer Reverse
5’ ACGGAATTCTCAGAGTGCAGTTTG 3’
Tm: 56.4
Enzima: Eco RI
Anelamento: 15 nt
Total primer: 24 nt

12. ANELAMENTO E POLIMERIZAÇÃO

13. ETAPAS DA PCR
30-60C

14. ETAPAS DA PCR
DESNATURAÇÃO
ANELAMENTO
POLIMERIZAÇÃO

17. Eletroforese

18. Eletroforese em Gel de Agarose

19. Eletroforese em gel de agarose

20. Visualização do DNA em luz
ultravioleta

21. Resultados
Eletroforese do DNA em gel de agarose 0.8%

22. Resultados

23. Limitações
 Extração do DNA da amostra é crítica
 Alguns compostos podem inibir a polimerase
 Condições específicas para cada reação
 Falsos resultados positivos devido a contaminação.
 Falsos resultados negativos.
 Análises conduzidas em laboratórios especializados.

24. http://www.pcrlinks.com/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

25. Tipos de PCR
·AFLP ·PCR-ELISA
·Alu-PCR ·PCR-RFLP
·Asymmetric PCR ·PCR-SSCP
·Colony PCR ·QC-PCR
·DD-PCR ·RACE
·Degenerate PCR ·RAPD
·Hot-start ·Real-Time PCR
·In situ PCR ·Rep-PCR
·Inverse PCR ·RT-PCR
·Long-PCR ·TAIL-PCR
·Multiplex PCR ·Touchdown PCR
·Nested PCR ·Vectorette PCR

26. Aditivos
PCR Additivos
DMSO (dimethyl sulfoxide)
genomas ricos em GC
Formamide
Non-ionic detergents –Triton X 100 Tween 20 or NP-40
TMAC (tetramethylammonium chloride)
BSA (bovine serum albumin)