O documento explica o que é DNA recombinante, como as bactérias desenvolveram enzimas de restrição e modificação para se defender de DNA invasor de fagos, e como estas enzimas são usadas junto com vetores para construir DNA recombinante através de técnicas como clonagem molecular e PCR.

1. O que é um DNA recombinante?
São moléculas de DNA que contêm fragmentos de DNA ligados covalentemente, derivados
de duas ou mais fontes, geralmente espécies diferentes.
A Guerra Natural
Bactérias vs. Fagos (bacteriófagos)
Durante a infecção viral, para se defender, as bactérias precisam destruir o DNA “invasor”
dos fagos sem afetar o seu próprio DNA.
As bactérias desenvolveram um sistema de defesa contra DNAs “invasores”, duas poderosas
“Armas”: Enzimas de Restrição e Enzimas de Modificação
Enzimas de Restrição:
Enzimas que se ligam ao DNA e o cortam em sítios específicos (sítios de restrição)
Também chamadas de endonucleases porque cortam o DNA internamente
Cada espécie de bactéria tem uma única enzima de restrição que reconhece um sítio
específico.
Enzimas de Modificação:
Para garantir que apenas o DNA viral (“invasor”) será degradado, a bactéria modifica
o seu próprio DNA nos sítios que serão atacados pela enzima de restrição
A bactéria destrói o DNA não-modificado enquanto o seu próprio DNA está protegido
 Sítios de Restrição: São “repetições invertidas” (Palíndromes)
Por que um palíndrome? As enzimas de restrição são dímeros formados por 2
subunidades idênticas. O eixo de simetria da enzima é o mesmo da sequência do
DNA.
 As enzimas de restrição cortam cada fita do DNA na mesma posição do
palíndrome
 Os cortes das enzimas de restrição podem produzir:
– Extremidades abruptas (bunt-ends)
(Podem se ligar com outras moléculas de DNA com extremidades abruptas)
– Extremidades coesivas (stick-ends)
Podem ser
5’ - protuberantes (5’ - overhangs) / 3’ - protuberantes (3’ - overhangs)

2. Construção do DNA recombinante: DNA-alvo + Vetor
VETORES: Elemento central na técnica de
clonagem molecular
 Usado para transferir DNA de um organismo
para outro com a finalidade de obter DNA
recombinante ou um organismo transgênico
 São os “veículos” que “carregam” o DNA
recombinante e permitem sua replicação e/ou
expressão na célula hospedeira
Características gerais:
- Capacidade de penetrar na célula hospedeira
- Capacidade de replicar no interior da célula
hospedeira
- São facilmente recuperáveis
- Contêm pelo menos um marcador específico que
permite distinguir as células transformadas das
células normais não-transformadas
- Possuem sítios de restrição únicos que permitem a
inserção do DNA-alvo
CONSTRUÇÃO DE UM ORGANISMO RECOMBINANTE:
 Obtenção do DNA a ser clonado
 Preparação do vetor
 Ligação do vetor com o “inserto”
 Transformação da bactéria
 Seleção dos clones recombinantes
 Expressão do DNA e da Proteína
OBTENÇÃO DO DNA A SER CLONADO:
 - Extração de DNA
 - PCR
 - Digestão
 - Purificação
TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE
Um único plasmídeo recombinante replica várias vezes em cada célula Cada célula (com vários
plasmídeos recombinantes) se multiplica, gerando trilhões de células.

3. PCR (Polymerase Chain Reaction)
● PCR é usado para amplificar seqüências específicas de DNA
● O DNA molde é desnaturado (96oC) – suas fitas são separadas
● Dois oligonucleotídeos complementares as extremidades 3’ do segmento de interesse são
adicionados em excesso e a temperatura é diminuída (50-60oC)
● Os oligonucleotídeos se hibridizam com seqüências complementares presentes nas moléculas do
DNA molde
● Os oligos funcionam como iniciadores (primers) para a síntese de DNA, a qual se inicia com a
adição de nucleotídeos e de uma polimerase resistente a temperatura
● A Taq Polymerase tem a capacidade de estender os oligos em temperaturas ao redor de 72°C
● Quanto a síntese esta terminada, aquece-se de novo a 96°C para, novamente separar-se as dupla-fitas
de DNA
● A repetição (30 – 40 vezes) deste ciclo de síntese, rapidamente gera muitas cópias de DNA
Amplificação por PCR:
● A PCR é exponencial – O produto (P) aumenta exponencialmente com o número de ciclos (n)
● A quantidade de produto de PCR depende do número de cópias de molde (M) presentes no início da
reação P = (2)n M
● Para 2X mais molde no início, existe 2X mais produto de PCR, na fase exponencial.
● Para 4X Molde, existe 4X mais produto de PCR, etc.
● Os produtos de PCR não podem dobrar para sempre
● Limites – Quantidade de primer – Atividade da Taq Polimerase
● Uma vez atingido o plato... – Não há mais aumento na quantidade de produto