[1] O documento descreve os principais processos da replicação do DNA em bactérias, incluindo a replicação semiconservativa, os fragmentos de Okazaki, e as enzimas envolvidas como DNA polimerases e helicases. [2] Apresenta detalhes sobre as DNA polimerases bacterianas, como a Pol I, Pol II e Pol III, e suas funções na replicação e reparo do DNA. [3] Discutem transcriptases reversas virais e não virais, e seu papel na biologia molecular, como a RT-PCR.

1. Seminário
Biologia Molecular & Métodos
Analíticos
Por:
Anderson Moura; Amélia Somensi; Argus Rocha Neto; Clarissa
Feltrin e Luan Aires.

2. Proporcionar a compreensão das atividades
enzimáticas fundamentais utilizadas na clonagem molecular.
OBJETIVO:

3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA:
Dogma Central da Biologia Molecular:
Tradução
Replicação
Transcrição
As sínteses de DNA, RNA e Proteica envolvem três etapas
básicas:
1.Iniciação da cadeia.
2.Ampliação ou alongamento da cadeia.
3.Término da cadeia.

4. Antes de ocorrer a
condensação dos
cromossomos é
necessário haver a
duplicação do DNA.

5. Replicação Semiconservativa:
• Watson e Crick (1953): duplicação do material genético por
complementariedade.
• Matthew Meselson e Franklin Stahl (1958):
- Cultivo de bactérias em isótopo 15
N.

6. Cultivo bacteriano
em meio contendo
o isótopo 15
N
Células
transferidas para
meio com 14
N
Extração e
Purificação de
DNA
Experimentos de
Meselson e Stahl (1958):

7. Como ocorre a replicação:
Em 1963 John Cairns por meio de auto-radiografia de bactérias, percebeu a
existência de um ponto inicial para a replicação, denominado Origem da
replicação.
Acreditava que a replicação era unidirecional.
Cultivo de E. coli
em meio
contendo timidina
(3
H)
Isolamento do DNA,
espalhamento em
emulsão fotográfica
Observação em
microscópio
eletrônico

8. Na origem se formam duas forquilhas de
replicação:
Estrutura da oriC, o único ponto de replicação em cromossomos circulares
bacterianos.

9. DNA ReplicadoDNA Replicado
DNA ParentalDNA Parental
Forquilha deForquilha de
ReplicaçãoReplicação
Forquilha de replicação:
Região do DNA onde ocorre a
transição do DNA parental fita dupla
para as novas fitas filhas duplas.

10. Replicon:
Unidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicação.
 Célula procariórica possui um único replicon.
Células eucarióticas possuem vários replicons e todos
são ativados uma única vez no ciclo celular, ainda que não
simultaneamente.

11. Primeiro passo:
Abrir o DNA (forquilha de replicação) e manter as fitas
complementares separadas, para que a DNA polimerase
inicie atividade:
• Topoisomerase.
• Helicase.
• Proteína ligante de DNA (SSB).

12. As DNAs polimerases são as enzimas que sintetizam DNA:
Também possuem função em atividades auxiliares e de reparo.
As duas fitas parentais são separadas e cada uma atua como molde
para síntese de uma nova fita.

13. Síntese de DNA envolve a formação das
ligações fosfodiéster:

14. Principais DNA polimerases e suas funções:
ENZIMAENZIMA GENEGENE FUNÇÃOFUNÇÃO
I polA
Envolvida no reparo de DNA
danificado.
II polB
Requerida para reiniciar a
replicação.
III polC Replicase (replicação do DNA).
IV dinB
Replicação através de lesão ou
dano.
V umuD’2C Replicação através de lesão ou
dano.

15. Lembrem-se:
•Sentido da síntese sempre
é 5’ 3’.
• A síntese de DNA ocorre
pela adição de
nucleotídeos a extremidade
3’ – OH da cadeia em
crescimento.
As fitas filhas alongam-se
com o desenrolamento da
forquilha?
A síntese de DNA é semidescontínua:

16. Então, qual é o mecanismo?
Fragmentos de Okazaki
A síntese de DNA é semidescontínua:

17. A síntese de DNA é semidescontínua:

18. Por que todas as enzimas DNA
polimerases promovem o
crescimento da fita de DNA
somente na direção 5’ para 3’?
A síntese de DNA é semidescontínua:

19. Conversão do DNA duplex em fita simples:
Para que a replicação ocorra, três atividades são
necessárias para converter a dupla fita de DNA em um
estado de fita simples:
1.Helicase:
2.Topoisomerase:
3.Proteína ligante
DNA (SSB):
Classe de enzimas que podem se
mover ao longo da fita dupla de DNA,
utilizando a energia da hidrólise de
ATP para separar as duas fitas da
molécula.
Responsáveis por aliviar a torção na
parte da fita que não está sendo
replicada.
Ligam-se a cada uma das fitas
impedindo o reanelamento das
mesmas.

20. Um iniciador é necessário para o começo da
síntese de DNA:
Primase:
• Cataliza a síntese de um pequeno RNA (primer).
• Fornece o iniciador para DNA pol III.

21. Em relação a síntese da fita descontínua, vários
iniciadores de RNA são produzidos pela primase
para possibilitar a ligação dos fragmentos de
Okazaki.
Em relação a síntese da fita descontínua, vários
iniciadores de RNA são produzidos pela primase
para possibilitar a ligação dos fragmentos de
Okazaki.
Um iniciador é necessário para o começo da
síntese de DNA:

22. Os fragmentos (Okazaki) sintetizados na fita
descontínua são ligados enzimaticamente (LIGASE)
para gerar uma fita contínua.
Os fragmentos (Okazaki) sintetizados na fita
descontínua são ligados enzimaticamente (LIGASE)
para gerar uma fita contínua.

23. • Circunda o DNA;
• Associa-se com DNA pol III deixando-a altamente processiva;
• Mantém DNA pol III ligada à molécula de DNA.
Braçadeira β: conecta a DNA polimerase ao
DNA:

24. Velocidade: 1000 nucleotídeos/segundo cada
Manutenção de VELOCIDADE e PRECISÃO
REPLISSOMO
ATIVIDADE REVISORA
SISTEMAS DE REPARO
E. coli (20 a 40 min.)
~ 1 erro/ 109
nucleotídeos
Replicação: velocidade e precisão

25. Replissomo:

26. Atividade revisora (atividade exonuclease
3’ 5’) garante a fidelidade da replicação:

27. Visão geral da replicação:
1. HELICASE.
2. TOPOISOMERASE.
3. BRAÇADEIRAS.
4. PRIMASE.
5. DNA POLIMERASE III.
6. DNA POLIMERASE II.
7. DNA POLIMERASE I.
8. DNA LIGASE.

28. DNA Polimerases
• Enzimas responsáveis pela polimerização de uma nova molécula
de DNA através da adição de desoxirribonucleotídeos fosfatados
(dNTPs).

29. DNA Polimerases procariotos
DNA Polimerase
Bacteriana
Atividades
Pol I Alongamento da fita de DNA 5’  3’;
Atividade de revisão 3’  5’;
Atividade de exonuclease 5’ 3’.
Pol II Alongamento da fita de DNA 5’  3’;
Atividade de revisão 3’  5’.
Pol III Alongamento da fita de DNA 5’  3’;
É a principal envolvida na replicação dos procariontes;
Atividade de revisão 3’5’

30. Fragmento Klenow
Polimerase 5’ 3’
Exonuclease 3’ 5’
E. Coli

31. DNA Polimerase T4
• Atividade de exonuclease 3’ 5’ e de polimerase
5’  3’;
• Não apresenta atividade de exonuclease 5’ 3’;
• Pode ser utilizada na finalização da extremidade 5’
saliente e marcação do terminal 3’ da fita dupla de DNA;
• Atividade de exonuclease: retira aproximadamente 40
bases/minuto na fita dupla e 4000 bases da fita simples;
• Atividade de endonuclease: polimeriza 15000
nucleotídeos/minutos em condições padronizadas.

32. DNA Polimerase do bacteriófago
modificado T7
• Complexo de duas ptns:
1) Produto de 84 kDa do gene 5 do T7 – propriedade catalítica;
2) Tireodoxina da E. Coli de 12 kDa – conecta o gene 5 ao molde do iniciador.
• Polimerização de milhares de nucleotídeos sem dissoaciação;
•Taxa de polimerização de mais de 300 nucleotídeos/segundo;
• Utilizado no preparo de sondas radioativas e amplificação de grandes fragmentos de
DNA;
• Identificado uma região de 28 aa com atividade de exonuclease 3’  5’;
• A deleção desta região aumenta a taxa de polimerização e de mutação espontânea;
• Alta eficiência em incorporar nucleotídeos análogos (5’(α-thio)-dNTPs, dc7-GTP ou dITP)
usados para melhorar a resolução do sequenciamento de DNA no gel.

33. DNA Polimerase do bacteriófago
modificado T7

34. Terminal deoxinucleotidil transferase
(TdT)
• Cataliza a adição de homopolímeros nas terminações das caudas
de DNA de uma maneira independente do molde;
• Utilizada para marcação com nucleotídeos modificados;
• Ensaios de apoptose;
• Tdt requer a presença de um iniciador de DNA fita simples na
presença de Mg+2
;
• Aceita a presença de um iniciador de DNA fita dupla na presença de
Co+2
.

35. DNA Polimerases termoestáveis
• Purificadas no início dos anos 70;
• Interesse com o desenvolvimento
da técnica de PCR.

37. TAQ Polimerase
• Purificada em 1976 da
bactéria Thermophilus
aquaticus - 70°C e 80°C;
• Considerada a molécula do
ano pela revista Science em
1989;
• Meia vida de 40 min a 95°C e
30 min a 100°C;
• Atividade ótima: 80°C e Mg+2
;
Yellowstone National Park

38. TAQ Polimerase
• Não possui atividade de revisão;
• Adição de resíduos de adenina nas terminações 3’nos
produtos de PCR;
• Outras DNA polimerases foram descobertas – mais
eficientes;
• As polimerases de DNA termoestáveis são comumente
chamadas de Taq.

39. BST Polimerase
• DNA Pol I isolada em 1968 da bactéria termofílica
Bacillus stearothermophilus (Bst) (39-70°C);
• Ativa a 65°C e inativa depois de 15 min à 75°C;
• Atividade exonuclease 5’3’- requer Mg+2
;
• Proteases geram dois fragmentos;
• O maior fragmento é mais veloz do que a enzima
íntegra.

40. THT Polimerase
• Isolada do Thermus thermophilus HB-8;
• Não possui atividade de revisão;
• Na presença de Mg+2
induz polimerização
de DNA e na presença de Mn+2
tem
atividade de transcriptase reversa.

41. DNA Pol termoestáveis c/ atividade de
revisão
DNA polimerase Características
Pyrococcus furiosus (Pfu) Taxa de erro 10x < Taq
Pyrococcus woesei (Pow)
Meia-vida > 2h a 100°C.
Baixa taxa de erro
Polimeriza apenas moldes pequenos
Mistura de Taq e Pow permite a
amplificação de longas cadeias de
DNA
Thermococcus litoralis (Tli, Vent) Taxa de erros entre Taq e Pfu
Meia vida de 7hs a 95°C
Pyrococcus abyssi (Pol I e II) Taxa de erro similar a Pfu
Mais termoestável que Pfu ou Taq

42. Hot start
• Objetiva evitar eventos não-epecíficos como: hibridização ou
formação de dímeros no iniciador;
• Introduz uma barreira entre as estruturas secundárias e o
sítio de ligação da DNA polimerase durante o seu preparo;
• A barreira pode ser: anticorpo, oligonucleotídeo ou
modificação química reversível;
• Liberada das enzimas durante o primeiro ciclo de
desnaturação do PCR – restaurando a atividade enzimática
apenas depois da desnaturação das estruturas secudárias.

43. Hot start

44. Transcriptase reversa ou
DNA polimerase dependente
de RNA

45. Vírus Epstein-Barr - 1964
Papilomavírus Humano
(HPV) – 1983
Peyton Rous, 1911
Agente filtrável em sarcoma
Rous Sarcoma Virus (RSV)
1960 – 1961 Genoma RNA
1970 – Transcrição reversa
(Temin e Mizutani, 1970)
DNAc

46. Ocorrência natural da TR
Retrovírus
• Rous Sarcoma Virus (RSV)
• Raucher Leukaemia Virus (RLV)

47. TRs virais
Família Exemplos de vírus Particularidades
Metaviridae
(RNA)
Saccharomyces
cerevisiae Ty3 virus,
Drosophila melanogaster
gypsy virus,
Ascaris lumbricoides Tas
virus.
Retrovírus com atividade
de retrotransposon.
Pseudoviridae
(RNA)
Saccharomyces
cerevisiae Ty1 virus,
Drosophila melanogaster
copia virus
RNA de fita simples.
Hepadnaviridae
(DNA fita dupla)
Hepatite B Dupla fita circular com
fragmentação.
Caulimoviridae
(RNA)
Plantas - Cauliflower
mosaic virus, Soyben
chlorotic mottle virus.
TR – Produção de
DNAc, que não se
integra ao genoma do
hospedeiro.

48. TRs não virais
TRANSPOSONS
- 80% genoma total das plantas
- 45% genoma humano
Cortar e colar
RETROTRANSPOSONS
- 42% do genoma humano
Copiar e colar
Elementos transponíveis

49. TRs não virais
Telômeros – Sequências não codificadoras
Telomerase – Enzima composta por RNA e TR
que introduz nucleotídeos na região 3’
possibilitando a reconstrução dos telômeros.
DNA Polimerase?

50. TR e biologia molecular
•RT- PCR (Reverse
Transcription Polymerase
Chain Reaction)
Preparação de bibliotecas DNAc e
sequenciamento.

51. TR usadas em biologia molecular

52. AMV/MAV - TR
• O Avian Myeoloblastosis Virus é dependente de outro vírus para
sua replicação, o Myeoloblastosis Associated Virus;
• AMV - Genoma contem oncogene v-myb = intensa proliferação dos
mieloblastos.
α =RT e RNase H- Fragmenta = RNase H
RT

53. MuLV -TR
• Maloney murine leukemia virus;
• Menos eficaz e menos estável que AMV/MAV -RT;
• Baixa atividade de RNase H;
• Capaz de gerar transcritos mais longos.

54. TR - Termoestável
• DNA polimerase da Thermus Thermophilus:
• Epicentre’s MonsterScript™:
- Dependente de Mg2+;
- Sem atividade RNase H;
- Ativa em 65°C;
- Produz DNAc maior que15kb.
Organismos termófilos
Transcreve RNA na presença de MnCl2.

55. • O fragmento de Klenow da Carboxydothermus
hydrogenoformans:
- Ativo em até 72° C.
• Thermo-X ™ RT :
- Meia-vida de 120 min a 65° C;
- Maior estabilidade já relatada.
TR - Termoestável
Polimerase I

56. RNA polimerase
• Principais usadas em Biologia Molecular:
SP6 e T7- RNA polimerase
SP6 - Bacteriófago da
Salmonella typhymurium LT2
Bacteriófago T7Transcrição!

57. • Usada para:
- Síntese in vitro de transcritos anti-senso;
- Produção de RNAs marcados com sondas;
- Mapeamento com proteção de RNase
(expressão de RNAm).
• SP6 e T7 – RNA polimerase
- Mg2+ e DNA molde fita dupla;
- Espermidina e albumina de soro;
- Transcritos downstream ao promotor;
- Transcreve até a cauda poli-A.
RNA polimerase
Modelo deve ser
linearizado

58. Ligases

59. Atividades da ligase
Conectam fragmentos de DNA por
Ligações fosfodiéster 3’ OH –
5’PO4-
1° AMP
2° União
3°liberação AMP

60. 1) União dos fragmentos de Okazaki
2) Reparo do DNA
3) União de fragmentos gerados pela
ação de enzimas de restrição
Atividades da ligase
4) Outros processos de manipulação
de DNA

61. Ligases utilizadas em biologia
molecular
Cofatores

62. DNA ligase não termoestável
Bacteriófago T7 Vírus da Chlorella
Mais usada em Biologia Molecular:
• T4 DNA ligase – Requer Mg2+ e ATP como cofatores;
• Repara fitas simples em DNA dupla fita, RNA ou híbridos de
DNA/RNA.
Bacteriófago T4

63. E. Coli DNA ligase - Atuação
Preferencialmente em
extremidades coesivas
de DNA dupla fita.
Em abruptas na presença de
Ficoll e polietilenoglicol.
Híbridos de DNA/ RNA ou RNA/RNA
não são eficientemente ligados.

64. Particularidades das DNA ligases
• Dependentes de:
- Temperatura;
- Concentração de fragmentos;
- Natureza dos fragmentos;
- Extremidades rombas ou coesivas.
Dificuldade em presumir uma condição ideal de incubação!
.
• Protocolos: Ligação overnight a 16 ° C;
• Otimização deve ser feita para cada reação.

65. DNA ligases termoestáveis
• Podem ligar duplex e reparar fitas simples a 45 – 80°C;
• Altamente específicas e bem adaptadas ao rigor;
Thermus thermophilus;
Bacillus stearothermophilus;
Thermus scotoductus;
Rhodothermus marinus.
• USO: Reação em cadeia da ligase (LCR) - para detectar
mutações de uma única base.

66. RNA ligases
• Ligações fosfodiéster (5’PO4 – 3’OH) em fitas simples
de DNA ou RNA.
T4 RNA ligase
• T4 RNA ligase 1 – RNA fita simples.

67. T4 RNA ligase 1
• Aplicações:
- Análise da estrutura do RNA;
- Mapeamento de sítios de ligação de
proteínas;
- Rápida amplificação de extremidades
de DNAc;
- Ligação de oligonuceotídeos
adaptadores no DNAc;
- Síntese de oligonucleotídeos;
- Modificação de ácidos nucléicos na
região 5’;
- Extensão de iniciadores na PCR;
- Usada na circularização de moléculas
de RNA e DNA.

68. • Catalisa ligações intramoleculares e intermoleculares
em RNA;
• Mais ativas para ligações de RNA;
• Pode ligar DNA dupla fita.
T4 RNA ligase 2

69. RNA ligase termoestável
• Isolada de bacteriófagos rm378 e TS2126
que infectam Rhodothermus marinus e
Thermus scotoductus respectivamente.
Rhodothermus marinus

70. Fosfatase alcalina

71. Fosfatase alcalina
• Altamente expressa em células indiferenciadas
• Função enzimática > Remove o grupo fosfato de proteínas,
alcalóides e nucleotídeos (hidrolisa ligações fosfodiéster)
• Importância biológica > Upkeep de Pi, Uptake de moléculas
• No leite e produção
• Em pesquisa
> Anticorpos Conjugados
> Remoção do P 5’
– Impede anelamento

72. T4 Polinucleotídeo quinase

73. • Descoberta em E. coli infectadas por T4
• As bactérias infetadas quebram sítios
específicos de seus tRNAs para interferir
na manutenção viral
• O T4, por sua vez, utiliza sua Pkn para
restaurar esses tRNAs
T4 Polinucleotídeo quinase

74. • Atividade enzimática
• Cinase e Fosfatase
– Transferência de um fosfato de ATP
• 3’ de um mononucleotídeo
• 5’-OH de RNAs e DNAs
– Condições ótimas > 37ºC
» pH 7.6
» Mg+2
» Agentes redutores
» 5 ATP : 1 5’OH-
T4 Polinucleotídeo quinase

75. • Aplicações
– Mapeamento de sítios de restrição
– Fingerprint de DNA e RNA
– Síntese de substratos para DNA e RNA ligase
– Sequenciamento de bases
T4 Polinucleotídeo quinase

76. Fosfatase ácida Tobacco
5' cap

77. Desoxirribonuclease I

78. Desoxirribonuclease I
• Glicoproteína purificada de pâncreas
bovino
– Mistura de 4 isoenzimas (A,B,C e D);
– Pode haver RNAse A nessa mistura.
• Atividade enzimática
– Cliva porções 3’ de pirimidinas, formando
polinucleotídeos;
– Age em ssDNA e dsDNA.

79. • Aplicações
– Marcação de DNA;
– Geração de fragmentos aleatórios para
sequenciamento;
– Digestão em amostras protéicas ou de RNA.
Desoxirribonuclease I

80. Exonuclease III

81. Exonuclease III
• Atividade enzimática
– Remove mononucleotídeos da porção 3’-OH
de dsDNAs
• C>A=T>G
– Remove o fosfato de 3’-fosfato de DNA
– Degrada fitas hibridas de DNA-RNA
• Especificidade por dsDNA

82. Exonuclease III
• Aplicações
– Marcação de DNA (principalmente dsDNA)
– Redução do comprimento do DNA

83. Bal 31 nucleases
• Atividade enzimática
– Encurta a fita de DNA em ambas porções 3’ e
5’
• Aplicações
– Mapeamento de sítios de restrição;
– Remoção de longos trechos (milhares de pb);
– Remoção de curtos
trechos(dezenas/centenas de pb).

84. Exonuclease VII
• Atividade enzimática
– Encurta ambas porções 3’ e 5” de DNA
• Específica para DNA fita simples
• Não age em RNAs ou DNA dupla fita
• Aplicações
– Remoção de primers restantes em reações
de PCR finalizadas.

85. RNAse A

86. RNAse A
• Atividade enzimática
– Cliva RNAs na porção 3’-fosfato ou 3’-fosfo-
oligonucleotídeos;
– Em fitas híbridas de DNA-RNA, cliva o RNA
nos pontos não correspondentes.
• Aplicações
• Inativação

87. Ribonuclease H

88. Ribonuclease H
• Cliva específicamente os RNAs de
híbridos RNA-DNA
• Importante em RT-PCR

89. S1 Nuclease
• Hidrolisa ssDNAs
– 5x mais rápido do que ssRNAs
– 75mil x mais rápido do que dsDNAs
• Hidrolisa ssDNAs e ssRNAs
» cDNAS
Mung bean nuclease

90. Metilases

91. Metilase
• Bactérias usam endonucleases de restrição:
– Degradar DNA estranho introduzido por agentes infecciosos
como bacteriófagos;
– Preservar o seu próprio DNA da destruição por enzimas de
restrição:
• Bactérias marcam seu DNA pela adição de grupamentos metil;
• Essa modificação não interfere no pareamento de bases do DNA;
• Metilases são parte do sistema de restrição e modificação!

92. Metilase
• Sistema de restrição-modificação:
– Endonuclease de restrição   Metilase correspondente;
– Catalizam a transferência de grupamentos metil da S-Adenosil
Metionina (SAM) para nucleotídeos específicos da dupla fita de
DNA:
Fonte: http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=Metilases%20De%20Modifica%C3%A7%C3%A3o%20Do%20Dna&lang=3

93. Metilase
• Há três tipos de sistemas:
– I e III  Complexos geralmente grandes, com múltiplas
subunidades contendo atividades tanto de endonucleases
quanto de metilase;
• Tipo I  Cliva o DNA em sítios aleatórios que podem estar a mais de 1000
pb da sequência de reconhecimento;
• Tipo III  Cliva o DNA a cerda de 25 pb da sequência de reconhecimento;
• Os dois tipos requerem uso de ATP para se moverem ao longo do DNA.

94. Metilase
– Complexo II  São as mais comuns no sistema, codificadas por
proteínas independentes;
• Atuam de forma independente da sua endonuclease de restrição;

95. Metilase
• Exceções a inibição das enzimas de restrição pela
metilação:
– Algumas endonucleases de restrição clivam o DNA em uma
sequência de reconhecimento modificada pela DAM ou DCM;
– Alguma bactérias possuem endonucleases de restrição que
apenas degradam DNA metilado e não o DNA não metilado do
hospedeiro:
• De modo a combater a camuflagem evolutiva que certos bacteriófagos
desenvolveram pelo DNA metilado.

96. Reparo do DNA
• Proteínas e RNA danificados  Substituídas pelas
informações codificadas DNA;
– DNA  Insubstituíveis;
• Manutenção é um imperativo celular;
• Conjunto elaborado de sistemas de reparo;
• Erros no pareamento  Replicada e transmitida (permanente)  Mutações.

97. Reparo do DNA
• Número e diversidade de sistemas de reparo:
– Reparo de erro de pareamento (erros de pareamento);
– Reparo por excisão de bases (bases anormais, bases
alquiladas, dímeros de pirimidinas);
– Reparo por excisão de nucleotídeos (lesões do DNA que
causam grandes alterações estruturais);
– Reparo direto (dímeros de pirimidinas).

98. Reparo do DNA
• Erros de pareamento:
– Quase sempre corrigidos refletindo a informação da fita molde;
– Necessidade de discriminar a fita molde da fita recém-
sintetizada;
– Marcação por metilação;
– Mecanismo não completamente compreendido para a maioria
das bactérias ou eucariotos  E.coli e correlatas.

99. Metilase
• Em E. Coli:
– Discriminação das fitas se baseia pela DAM (gene):
• DAM  Metilação do DNA na posição N6
de todas adeninas nas sequências
5’ GATC;
– Imediatamente após passagem pela forquilha de replicação há
um curto período em que:
• Fita molde é metilada X Fita recém sintetizada não.

101. Metilase
• Metilação DCM (gene)  citosina:
– Os sítios de reconhecimento do DCM são pontos intensos para
mutação;
– Especialmente em transições C  T no 3’C pela desaminação
do 5-meC:
• Desaminação do 5-Metil Citosina (5-meC)  base Timina;
– Sistema de reparo que reconhece e repara o pareamento
errado através da formação de pequenos locais de excisão 
Vsp
– Vsp  necessita da sobreposição parcial do gene Dcm 
expressão e coordenação.

102. Metilase
• Cepas deficientes em metilação  Determinação do papel da
metilação do DNA na biologia do organismo;
• Com o avanço das tecnologias de DNA recombinante:
– Propagação do DNA por cepas deficientes em metilação;
• Possibilidade de identificar as endonucleases que são afetadas pela
metilação do DNA;
• Capacidade de se criar sítios específicos de clivagem do DNA;
• Melhorar o entendimento dos papeis que cada sistema atual na organização
e regulação celular.

103. Outras Enzimas
Poliadenilato-polimerase

104. Poliadenilato-polimerase
• Na extremidade 3’, a maioria dos RNAms
eucarióticos possuem um conjunto de resíduos de A
 Cauda poli (A):
– Sítio de ligação para uma ou mais proteínas específicas;
– Ajudam a proteger o RNAm da destruição enzimática
– Em bactérias essas caudas estimulam a degradação do RNAm;

105. Poliadenilato-polimerase
• A cauda poli (A) é adicionada em diversas etapas:
– A Pol II  Sintetiza RNA além do segmento do transcrito contendo
sequências sinalizadoras de clivagem;
– Sequência que sinaliza é ligada por um complexo de enzimas:
• Endonuclease;
• Poliadenilato-polimerase;
• E outras proteínas com múltiplas subunidades.
– A endonuclease cliva o RNA no lado 3’ a da sequência conservada;
– A Poliadenilato-polimerase sintetiza a cauda poli (A) de 80 a 250
nucleotídeos de comprimento.

107. Outras Enzimas
Topoisomerases I e II

108. Topoisomerase
• A supertorção do DNA:
– Processo regulado com precisão;
– Influi em muitos aspectos do metabolismo do DNA;
• Cada célula possui enzimas cuja única função é
desenrolar e/ou relaxar o DNA;
– Enzimas que aumentam ou diminuem o grau de
subenrolamento  Topoisomerases  Modificam o número de
ligações no DNA.

109. Topoisomerase
• Topoisomerase I:
– Atuam quebrando transitoriamente uma das duas cadeias o DNA
passando a cadeia não rompida pela brecha, religando as
extremidades;
– Modificam o Lk (“número de ligações”) em incrementos de 1;
• Topoisomerase II:
– Quebram ambas as cadeias do DNA;
– Modificam o Lk em incrementos de 2;
Vídeo

110. Topoisomerase
• Efeitos demonstrados por eletroforese em géis de
agarose:
– População de DNA de plasmídeos idênticos com o mesmo
número de ligação migra como uma banda discreta;
– Topoisômeros com valores de Lk diferindo em apenas 1 podem
ser separados por este métodos.

112. Topoisomerase
• O estado topológico do DNA está intimamente
relacionado com sua função;
• Sem topoisomerases:
– Células não podem se replicar;
– Não podem compactar seu DNA ou expressam seus genes e
morrem;

113. Topoisomerase
• Importância:
– Duas classes de inibidores de topoisomerases bacterianas
foram desenvolvidos como antibióticos:
• Cumarinas  Inibem a ligação de ATP a topoisomerases do tipo II
bacterianas, DNA girase e topoisomerase IV;
• Quinolonas  Atuam bloqueando a última etapa da reação da
topoisomerase, a soldagem da quebra na cadeia de DNA (inibidores da
DNA girase e da topoisomerase IV);

114. Topoisomerase
• Importância:
– Alguns dos mais importantes agentes quimioterápicos usados
no tratamento de câncer são inibidores de topoisomerases:
• Células tumorais apresentam, geralmente, níveis elevados de
topoisomerases;
– Agentes dirigidos a essas enzimas são mais tóxicos aos tumores do
que a outros tecidos.

115. Outras Enzimas
Guanilil transferase

116. Guanilil transferase
• É um complexo enzimático isolado a partir de Vaccinia
virus;
• Utilizada para rotular ambas extremidades 5’ finais di e
trifosfatos de moléculas de RNA após a remoção
química do resíduo terminal de 7-metil-guanina;

117. Guanilil transferase
• Complexo apresenta 3 atividades enzimáticas:
1. Atua como uma RNA trifosfatase catalizando a quebra do
pirofosfato a partir do trifosfato terminal de uma molécula de
RNA, liberando um bifosfato terminal no RNA;
2. É uma guanil transferase, capaz de transferir uma molécula de
GTP para o RNA, liberando pirofosfato;
3. É uma RNA metil transferase capaz de transferir um
grupamento metil proveniente de SAM para o 5 resíduo de
guanina de uma molécula de RNA.

118. Conclusão do autor
• Diversas são as enzimas à disposição dos
estudiosos para:
– Propagar;
– Cortar;
– Modificar;

119. Conclusão do autor
• A maioria das preparações comerciais são confiáveis e
podem ser utilizadas com muita segurança;
• No entanto, nem sempre há informações a respeito de
origem biológica, dimensão do controle de qualidade,
entre outras informações cruciais para definição dos
protocolos;
• Cuidados ao se escolher as atividades enzimáticas e a
qualidade dos reagentes são fatores chave para o
sucesso.

120. Conclusão
• A correta compreensão de cada uma é que ajudará a
selecionar-se a mais adequada para um propósito
específico;

121. OBRIGADO!