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Detecção do genoma de HPV em pacientes com carci-
noma espino-celular da laringe: Comparação entre os
    ensaios de PCR convencional e em tempo real
  Detection of HPV genome in patients with squamous cell carcinoma of the larynx: Comparison
                       between conventional and real time PCR assays
                                    Cunha DMC1; Silva AMTC2; Curado MP3; da Silva CC4 & da Cruz AD5

 RESUMO - A interação do genoma do HPV com o genoma da célula hospedeira ou de proteínas virais com proteínas celulares neces-
 sárias ao controle do ciclo celular desencadeia a morte celular ou age como fator de iniciação e progressão de processos malignos. Di-
 versos trabalhos têm sido desenvolvidos no sentido de associar a infecção de HPV aos cânceres de cabeça e pescoço. O objetivo do
 presente estudo foi comparar a detecção do genoma de HPV em pacientes com CEC da laringe, considerando os ensaios de PCR con-
 vencional e em tempo real. O grupo amostral foi constituído de 15 pacientes do Registro de Câncer de Base Populacional da ACCG.
 Das peças cirúrgicas, foi obtido DNA total, usado na investigação molecular, para detecção do genoma de HPV, utilizando os primers
 genéricos GP05/06, que detectam todos os tipos de HPV. O genoma de HPV foi amplificado em 30% dos casos por PCR convencional
 e no ensaio de PCR em tempo real apresentaram amplificação em 46,7% das amostras, evidenciando uma diferença em 40%. Os es-
 tudos de associação entre o HPV e os cânceres da laringe são importantes no sentido de ampliar o conhecimento acerca dos mecanis-
 mos de infecção, iniciação e promoção tumoral potencializada por estes vírus.
 PALAVRAS-CHAVE - HPV, PCR e PCR em tempo real

 SUMMARY - The random integration of HPV DNA into the cell genome causes the interaction of viral proteins with cell cycling pro-
 teins, which will eventually lead to apoptosis or to initiation or progressions of carcinomas. Several studies have been designed to in-
 vestigate the potential association of HPV infection and tumorigenesis of the head and neck. The objective of the current study was
 to compare the sensitivity of detection of HPV DNA using total DNA of SCC of the larynx trough classical and real-time PCR essays.
 The study group was comprised of 15 patients who agreed to voluntarily participate in this study. Total DNA was extracted from tu-
 mor tissue samples and PCR was carried out using GP05/06 primer set. HPV genome detection was observed in 30% (5/15) and 46.7%
 (7/15) of samples amplified with classical and real-time PCR, respectively. The results of this study indicated that real-time PCR is 40%
 more sensitive to detect HPV genome in total human DNA than classical PCR essay. Thus, real-time PCR strategy is a powerful tool
 to detect HPV genome integrated into host cells and, consequently, could be use to further our knowledge regarding the role of HPV
 infection on laryngeal carcinomas.
 KEYWORDS - HPV, PCR and Real Time PCR

                            INTRODUÇÃO                                           mem, pênis, uretra, saco escrotal e região anal (Almadori et
                                                                                 al., 2002). Além da região geniturinária, o HPV também
                                                                                 pode ser encontrado nas células epiteliais das vias aéreas
O    s HPVs são pertencentes à família Papillomaviridae,
     gênero Papilomavírus (Santos et al., 2002). São vírus
não-envelopados, simétricos, apresentando 72 capsômeros
                                                                                 superiores e o seu papel na oncogênese dos tumores da ca-
                                                                                 beça e pescoço tem sido freqüentemente investigado
e um genoma de DNA de fita dupla circular, medindo                               (Einstein & Goldberg, 2002). Neste sentido, diversos auto-
aproximadamente 8000pb (Souto et al., 2005). A infecção                          res evidenciam uma correlação positiva do parasitismo
viral promove modificações bioquímicas e moleculares em                          provocado pelo HPV com tumores benignos como papilo-
seus hospedeiros, necessárias para o desenvolvimento e                           mas, verrugas comuns e condilomas (Garcia-Garrancá &
reprodução viral, alterando significativamente a população                       Garriglio, 1993) e malignos, sobretudo nas células da re-
dos hospedeiros ou a população de células por eles parasi-                       gião cervical (Bibbo & Filho, 1998). Lin e colaboradores
tadas, através da interação do genoma viral com o genoma                         (1998) realizaram estudos de tipagem de HPVs associando
da célula hospedeira ou de proteínas virais com proteínas                        alguns tipos virais com cânceres de cabeça e pescoço.
celulares necessárias ao controle do ciclo celular, como as                      A carcinogênese é um processo de múltiplas etapas que en-
proteínas supressoras de tumor pRb e p53, desencadeando                          volvem mudanças genéticas e epigenéticas, culminando na
a morte celular ou agindo como um fator de iniciação e                           ativação de proto-oncogeneses e/ou inativação dos genes
progressão de processos malignos (Silva et al., 2003).                           supressores de tumor, que modifica o fenótipo celular. Uma
Alguns tipos de papilomavírus humano (HPV), nos últimos                          célula maligna se difere de uma célula normal principal-
anos, têm sido responsabilizados pelo desenvolvimento de                         mente pela sua independência no controle do ciclo celular.
malignidade nas regiões que comumente infectam, com-                             O HPV pode transformar e imortalizar as células hospedei-
preendendo, na mulher, o períneo, vulva, vagina, colo do                         ras, iniciando assim um processo maligno. Os produtos dos
útero e região anal (Einstein & Goldberg, 2002) e, no ho-                        genes E6 e E7 são importantes para a transformação e

                                                                     Recebido em 28/08/2006
                                                                     Aprovado em 21/09/2007
    1
     Pós-Graduanda do Programa de Pós-Graduação Lato Senso em Genética / Núcleo de Pesquisas Replicon / Universidade Católica de Goiás / Goiânia – GO;
 2
  Biomédico Geneticista, Pesquisador do Núcleo de Pesquisas Replicon / Professor de Biologia Molecular do Departamento de Biologia / Universidade Católica de
   Goiás / Goiânia – GO; 3Médica do Hospital Araújo Jorge / Registro de Câncer de Base Populacional / Associação de Combate ao Câncer em Goiás / SuLeide –
    Superintendência Leide das Neves Ferreira / Secretaria de Estado da Saúde Goiânia – GO; 4Biomédico Geneticista do LaGene - Laboratório de Citogenética e
Genética Humana / SuLeide – Superintendência Leide das Neves Ferreira / Secretaria de Estado da Saúde, Professor de Genética do Departamento de Biologia e
Pesquisador do Núcleo de Pesquisas Replicon / Universidade Católica de Goiás / Goiânia – GO; 5Biomédico Geneticista do LaGene - Laboratório de Citogenética e
 Genética Humana / SuLeide – Superintendência Leide das Neves Ferreira / Secretaria de Estado da Saúde, Professor de Biologia Molecular do Departamento de
   Biologia, Pesquisador do Núcleo de Pesquisas Replicon / Universidade Católica de Goiás e Pesquisador do Hospital Araújo Jorge / Registro de Câncer de Base
                                           Populacional / Associação de Combate ao Câncer em Goiás / Goiânia – GO


RBAC, vol. 39(4): 255-257, 2007                                                                                                                          255
imortalização celular. A proteína E6 tem uma grande afini-                        MATERIAL E MÉTODOS
dade pelo DNA e é encontrada tanto no núcleo como na
membrana plasmática. A proteína E7 é uma fosfoproteína           GRUPO AMOSTRAL
encontrada no citoplasma e, provavelmente, no núcleo             O grupo amostral foi constituído de 15 pacientes recém di-
(Garcia-Carrancá & Gariglio, 1993). Os produtos dos genes        agnosticados com carcinoma da laringe. Os casos foram
supressores de tumores presentes nas células como as pro-        obtidos do Registro de Câncer de Base Populacional de
teínas pRb e p53 são alvo da ação dos produtos dos genes         Goiânia/GO da Associação de Combate ao Câncer em Goi-
dos virais. Em geral, a atividade da proteína pRb é inibida
                                                                 ás. Todos os pacientes considerados foram diagnosticados
pela proteína viral E7, enquanto que, a proteína p53 é de-
                                                                 como carcinomas da laringe (CID-O: C32). A participação
gradada subseqüentemente à ligação com a proteína E6. A
perda das funções de ambas as proteínas celulares respon-        foi de caráter voluntário e no ato da coleta da amostra, os
sáveis pela supressão tumoral contribui para a progressão        pacientes foram submetidos a uma entrevista e preenche-
de tumores (Vousden, 1993).                                      ram um questionário sobre hábitos de vida para determinar
O gene RB1 é um supressor de tumor (GST) localizado no           possíveis associações entre hábitos e os carcinomas larín-
braço longo do cromossomo 13 (13q14), que tem como pro-          geos. As amostras biológicas dos tumores foram separadas
duto a proteína celular pRb, de aproximadamente 105 kDa.         na ocasião de realização de biópsias e/ou cirurgias. Após a
A proteína pRb tem a função de inibir a progressão do ci-        retirada cirúrgica, as biópsias foram transportadas em câ-
clo celular, pois é capaz de seqüestrar o fator de transcrição   mara fria, com temperatura média de 10oC, armazenadas
E2F e impedi-lo de promover a transcrição de genes neces-        sem conservantes e fixadores em criotubos e acondiciona-
sários para a replicação do DNA na fase S. A associação da       das a – 20oC até o momento do uso.
proteína pRb com a proteína viral E7 causará uma pertur-
bação no controle normal do ciclo celular, resultando em         EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DO DNA
um estímulo positivo para a proliferação das células infec-      Para a extração de DNA, 10-20mg de cada biópsia foram
tadas (Sandal, 2002).
                                                                 maceradas previamente em nitrogênio líquido. Posterior-
O gene p53 é também considerado como GST, está locali-
                                                                 mente, o tecido macerado foi submetido à extração do
zado no braço curto do cromossomo 17 (17p13), cujo pro-
duto é a proteína p53. Esse gene apresenta 11 éxons, entre       DNA com o kit de purificação do DNA genômico Wizard®
os quais o primeiro deles não é codificante. A proteína p53      (Promega Corporation, EUA), seguindo-se as instruções do
é constituída de 393 aminoácidos na sua extensão, apre-          fabricante.
sentando quatro regiões com funções distintas, chamadas
domínios da proteína. Uma vez ativada a proteína p53 é ca-       PCR CONVENCIONAL
paz de reprimir a progressão celular e sinaliza para a apop-     Todas as amostras foram submetidas a uma primeira PCR
tose. A proteína p53 uma vez ativada por fosforilação ou         com os primers genéricos GP05/06 para detecção do geno-
acetilação da extremidade C-terminal passa a se ligar de         ma de qualquer HPV. Em seguida, fez-se uma segunda PCR
maneira específica ao DNA, agindo como um fator de               com os mesmos primers, utilizando o produto da PCR ante-
transcrição através da ligação em seqüências específicas,        rior. Assim, as amostras só foram consideradas negativas
promovendo a transativação downstream de genes alvos.            para o HPV após serem submetidas a duas PCRs, com pos-
Para desempenhar tal função as proteínas p53 se associam         terior repetição das reações para confirmação do resultado.
entre si formando tetrâmeros, que são complexos protéicos        Um conjunto de primers, que amplifica a região D8S135 de
resultantes da associação de quatro monômeros. Após o
                                                                 8p11, foi utilizado como controle interno da reação. A se-
evento de tetramerização a proteína passa a ser capaz de
                                                                 qüência de todos os primers e o tamanho esperado dos frag-
impedir a proliferação celular ou induzir a morte da célula
por apoptose. Nesse sentido, a proteína p53 é responsável        mentos amplificados encontram-se na Tabela 1.
por monitorar danos ocorridos nas moléculas de DNA. Des-
ta forma, o ciclo celular é impedido de prosseguir até que       O protocolo de termociclagem para a amplificação do ge-
o dano no DNA seja restaurado.                                   noma de HPV está descrito na Tabela 2.
A proteína E6 do papiloma vírus humano de alto risco on-
cogênico se associa a proteína p53, que é responsável pela       ANÁLISE DOS FRAGMENTOS DE PCR
regulação da passagem da fase G1 para S e da fase G2 pa-         Para a análise dos produtos de PCR, o DNA foi submetido
ra M, no ciclo celular. A proteína E6 recruta a proteína ce-     à eletroforese em campo elétrico constante de 8V/cm em
lular E6AP, que funciona como uma ubiquitina-ligase para         gel de poliacrilamida 6% em TBE 1x. Para a visualização
o complexo tetramérico contendo p53. Este recrutamento           do DNA amplificado, o gel foi corado em banho de solução
resulta na ubiquitinação de p53 seguido de sua rápida de-        de brometo de etídio (5μg/mL) e as imagens foram captu-
gradação (Stubenrauch & Laimins, 1999). Sem a proteína           radas e reveladas pelo sistema de vídeo documentação
p53 a célula perde a capacidade de perceber e reparar pos-       ImageMasterVDS® (Amersham Pharmacia Biotech, EUA).
síveis danos no DNA, assim, a divisão celular passa a ocor-
rer sem reparo. Conseqüentemente, aumenta-se a fre-
                                                                 PCR EM TEMPO REAL
qüência das mutações, dos rearranjos cromossômicos, das
aneuploidias. O acúmulo de eventos mutacionais é a causa         As reações de PCR em tempo real foram realizadas no apa-
subjacente ao desenvolvimento de um fenótipo neoplásico          relho Rotor-Gene® (Corbertt Research, Austrália) que mos-
e, assim, provavelmente, resultam no câncer (Vogel & Mo-         trou resultados similares quando repetidos. Para cada teste,
tulsky, 2000; Griffiths et al.,1998; Vousden, 1993).             foram utilizados 0,5uL de DNA, 12,5uL SYBR Green PCR
O objetivo deste estudo foi comparar a eficiência da detecção    Master Mix® (Invitrogen,USA), 1,0uL de cada um dos pri-
do genoma de HPV pela reação em cadeia da polimerase             mers conforme indicado na Tabela 1 e 10,0uL de água para
(PCR) convencional com a PCR em tempo real, em biopsia de        completar o volume final de 25,0uL. As condições de ampli-
laringe de pacientes com carcinoma espino-celular (CEC).         ficação foram as mesmas conforme indicadas na Tabela 3.

256                                                                                           RBAC, vol. 39(4): 255-257, 2007
TABELA I                                                                                                                 RESULTADOS
Seqüências consenso dos primers utilizados e o tamanho
         esperado do fragmento amplificado.                                                                    Foram observadas a amplificação de DNA humano
                                                                                                               (D8S135) em todas as reações. Na PCR convencional, os
   Tipos              S*                        Se qüê nc ias 5 ’‡ 3’                     Fragm ent o (pb)     primers GP05/GP06 foram amplificados em 30% dos casos
                       F              GG G A G G C TT TA T AA T TA T TTA GC
                                                                                                               (5/15), evidenciando a presença do genoma de HPV nas
 D8S 135
                       R                  CTG GGC A AC AG A GT G G GA C
                                                                                                 100           células de CEC da laringe. Quando estes mesmos primers
                                                                                                               foram utilizados no ensaio de PCR em tempo real, apresen-
   GP05                F              TT T G TT AC T G TG GT A G AT ACT AC
                                                                                                 170           taram amplificação em 46,7% (7/15) das amostras, eviden-
   GP06                R           GAA AA A TAA AC T G TA AA T CA T A TT C
                                                                                                               ciando uma diferença em 40% dos casos. A Tabela 4 apre-
 *S: Sentido – F: Forward (Direto) e R: Reverse (Reverso).                                                     senta os resultados observados neste estudo.
                        TABELA II                                                                                                              DISCUSSÃO
 Protocolo da termociclagem para o ensaio de PCR con-
vencional para a amplificação do genoma de HPV a partir                                                        Estudos recentes demonstram que a utilização da reação
  de DNA total extraído das células de CEC da laringe.                                                         em cadeia da polimerase em tempo real com primers con-
                                                                                                               senso é mais eficiente para identificar o genoma de HPV
                              Passos                             Temperatura (oC)              Te mpo (m in)   quando comparada com o ensaio de PCR convencional. O
                     Desnaturação inicial                                 95                            5
                                                                                                               ensaio PCR em tempo real tem sido muito utilizado em ava-
                                                                                                               liação retrospectiva, na tentativa de detectar a presença de
                                  Desnaturação                            95                            1
      Ciclos (10)




                                                                                                               genomas virais. Adicionalmente, PCR em tempo real é uma
                                   Anelamento                             57                            1      ferramenta muito útil na quantificação da carga viral e da
                                    Extensão                              72                            1      genotipagem de HPV, assim como de outros tipos virais.
                                                                                                               O aumento na freqüência de detecção da presença do ge-
      Ciclos (30)




                                  Desnaturação                            95                            1
                                                                                                               noma viral nas amostras de pacientes com CEC na laringe
                                   Anelamento                             50                            1
                                                                                                               por PCR em tempo real sugere que devemos ter uma
                                    Extensão                              72                            1      atenção especial nos resultados obtidos pelo método con-
                           Extensão final                                 72                            5      vencional. Durante anos o ensaio utilizando PCR convenci-
                           Conservação                                    4                             ∞
                                                                                                               onal vem sendo largamente utilizado nos laboratórios para
                                                                                                               diagnóstico em diversas rotinas laboratoriais. Apesar de
                         TABELA III                                                                            ser confiável, os ensaios que utilizam PCR convencional
  Protocolo da termociclagem para o ensaio de PCR em                                                           podem não ser completamente satisfatórios. Por outro lado,
tempo real para a amplificação do genoma de HPV a par-                                                         os testes utilizando novas metodologias devem ser inseri-
                                                                                                               dos na rotina laboratorial de maneira consciente e funda-
 tir de DNA total extraído das células de CEC da laringe.                                                      mentados. È necessário aumentar investimentos em infra-
                                                                                                               estrutura e na aquisição de novos equipamentos, treina-
                             Passos                              Temperatura (oC)             Tempo (min)
                                                                                                               mento pessoal e compreensão pelos clínicos da utilização
                    Desnaturação inicial                                 95                         10         de novas metodologias.
                                 Desnaturação                            94                             1
    Ciclos (40)




                                                                                                                                         AGRADECIMENTOS
                                  Anelamento                             40                             1

                                   Extensão                              72                             1      Nossos agradecimentos aos membros do Hospital Araújo
                           Conservação                                   4                             ∞       Jorge/ Registro de Câncer de Base Populacional/ Asso-
                                                                                                               ciação de Combate ao Câncer de Goiás, do
                      TABELA IV                                                                                do LaGene/SES e do NPR/UCG pelo extenso apoio para
Resultados da amplificação das amostras de DNA extraí-                                                         com todos os pesquisadores associados.
         do de pacientes com CEC da laringe.
                                                                                                                                             REFERÊNCIAS
                                                                     Primers                                   1. ALMADORI G., GALLI J., CADONI. Et al. Human papilomavirus infection and
          Código                                                                                                  cyclin D1 gene amplification in laryngeal squamous cell carcinoma: biologic
                                                                        GP0 5/G P06
         Paciente                D8S 135                                                                          function and clinical significance. Head and Neck. 24 (6), p.597-604, jun. 2002.
                                                  PCR convencional                  PCR em tempo real          2. BIBBO, M. & SILVA FILHO, A.M. Lesões relacionadas à infecção por HPV no
                                                                                                                  trato anogenital. In Villa, L.L. (Eds). Aspectos moleculares da oncogênese por
            085 -209                  +                                                                           papilomavírus. Revinter, 1998, p.51-58.
            085 -213                  +                                                      +                 3. EINSTEIN, M.H.; GOLDBERG, G>L> Human Papillomavirus and cervical ne-
                                                                                                                  oplasia. Cancer Invest, 20 (7-8), p.1080-5, 2002
            085 -261                  +                                                                        4. HA CUBIE, ALSEAGAR, Et al. Rapid real time PCR to distinguish beteween
            085 -417                  +                      +                               +                    hig risk human papillomavirus types 16 and 18. Clin Pothol: Mol Pothol
                                                                                                                  2001;54:24-29.
            085 -429                  +
                                                                                                               5. MARTIN MORBERG< INGER GUSTAVSSON, AND ULF GYLLENSTEN. Real-
            085 -438                  +                      +                               +                    Time PCR-Based System For Simultaneous Quantification Of Human Papil-
                                                                                                                  lomavirus Types Associated With High Risk Of Cervical Cancer Journal of
            085 -434                  +
                                                                                                                  clinical Microbiology, july 2003, p. 3221-3228.
            085 -476                  +                                                      +                 6. MCKAIG, R>G.; BARIC, R>S.; OLSHAN, A>F> Human papillomavirus and
                                                                                                                  hed and neck câncer: epidemiology and molecular biology. Head and Neck,
            085 -491                  +
                                                                                                                  20 (3), p 250-65, maio 1998.
            085 -597                  +                                                                        7. SANTOS, O.S.N.; ROMANOS, V.T.M.; WIGG, D.M. Introdução à virologia hu-
                                                                                                                  mana. In: ROMANOS, M.T.V.; SSANTOS, N.S.O.; MIRANDA, M.M.F.S. (Eds).
            085 -600                  +
                                                                                                                  Virose oncogênicas. Guanabara Koogan, 2002. p. 204
            085 -657                  +                      +                               +                 8. SOUTO, R, FALHARI,J.P.B.; DA CRUZ, A.D.; O Papilomaviírus Humano: Um
            085 -659                  +                      +                               +
                                                                                                                  Fator Relacionado Com a formação de Neoplasias. Revista Brasileira de
                                                                                                                  Cancerologia,2005; 51 (2): 155-160
            085 -660                  +                                                                        ________________________________________
            085 -743                  +                      +                               +                 ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA:
                                                                                                               Núcleo de Pesquisas Replicon
            085 -200                  +                                                                        Departamento de Biologia
            085 -200                  +                                                                        Universidade Católica de Goiás
                                                                                                               Rua 235, 40 Bloco 4L – Área IV - Setor Universitário
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Detecção do genoma de hpv em pacientes com carcinoma espino celular da laringe comparação entre os

  • 1. Detecção do genoma de HPV em pacientes com carci- noma espino-celular da laringe: Comparação entre os ensaios de PCR convencional e em tempo real Detection of HPV genome in patients with squamous cell carcinoma of the larynx: Comparison between conventional and real time PCR assays Cunha DMC1; Silva AMTC2; Curado MP3; da Silva CC4 & da Cruz AD5 RESUMO - A interação do genoma do HPV com o genoma da célula hospedeira ou de proteínas virais com proteínas celulares neces- sárias ao controle do ciclo celular desencadeia a morte celular ou age como fator de iniciação e progressão de processos malignos. Di- versos trabalhos têm sido desenvolvidos no sentido de associar a infecção de HPV aos cânceres de cabeça e pescoço. O objetivo do presente estudo foi comparar a detecção do genoma de HPV em pacientes com CEC da laringe, considerando os ensaios de PCR con- vencional e em tempo real. O grupo amostral foi constituído de 15 pacientes do Registro de Câncer de Base Populacional da ACCG. Das peças cirúrgicas, foi obtido DNA total, usado na investigação molecular, para detecção do genoma de HPV, utilizando os primers genéricos GP05/06, que detectam todos os tipos de HPV. O genoma de HPV foi amplificado em 30% dos casos por PCR convencional e no ensaio de PCR em tempo real apresentaram amplificação em 46,7% das amostras, evidenciando uma diferença em 40%. Os es- tudos de associação entre o HPV e os cânceres da laringe são importantes no sentido de ampliar o conhecimento acerca dos mecanis- mos de infecção, iniciação e promoção tumoral potencializada por estes vírus. PALAVRAS-CHAVE - HPV, PCR e PCR em tempo real SUMMARY - The random integration of HPV DNA into the cell genome causes the interaction of viral proteins with cell cycling pro- teins, which will eventually lead to apoptosis or to initiation or progressions of carcinomas. Several studies have been designed to in- vestigate the potential association of HPV infection and tumorigenesis of the head and neck. The objective of the current study was to compare the sensitivity of detection of HPV DNA using total DNA of SCC of the larynx trough classical and real-time PCR essays. The study group was comprised of 15 patients who agreed to voluntarily participate in this study. Total DNA was extracted from tu- mor tissue samples and PCR was carried out using GP05/06 primer set. HPV genome detection was observed in 30% (5/15) and 46.7% (7/15) of samples amplified with classical and real-time PCR, respectively. The results of this study indicated that real-time PCR is 40% more sensitive to detect HPV genome in total human DNA than classical PCR essay. Thus, real-time PCR strategy is a powerful tool to detect HPV genome integrated into host cells and, consequently, could be use to further our knowledge regarding the role of HPV infection on laryngeal carcinomas. KEYWORDS - HPV, PCR and Real Time PCR INTRODUÇÃO mem, pênis, uretra, saco escrotal e região anal (Almadori et al., 2002). Além da região geniturinária, o HPV também pode ser encontrado nas células epiteliais das vias aéreas O s HPVs são pertencentes à família Papillomaviridae, gênero Papilomavírus (Santos et al., 2002). São vírus não-envelopados, simétricos, apresentando 72 capsômeros superiores e o seu papel na oncogênese dos tumores da ca- beça e pescoço tem sido freqüentemente investigado e um genoma de DNA de fita dupla circular, medindo (Einstein & Goldberg, 2002). Neste sentido, diversos auto- aproximadamente 8000pb (Souto et al., 2005). A infecção res evidenciam uma correlação positiva do parasitismo viral promove modificações bioquímicas e moleculares em provocado pelo HPV com tumores benignos como papilo- seus hospedeiros, necessárias para o desenvolvimento e mas, verrugas comuns e condilomas (Garcia-Garrancá & reprodução viral, alterando significativamente a população Garriglio, 1993) e malignos, sobretudo nas células da re- dos hospedeiros ou a população de células por eles parasi- gião cervical (Bibbo & Filho, 1998). Lin e colaboradores tadas, através da interação do genoma viral com o genoma (1998) realizaram estudos de tipagem de HPVs associando da célula hospedeira ou de proteínas virais com proteínas alguns tipos virais com cânceres de cabeça e pescoço. celulares necessárias ao controle do ciclo celular, como as A carcinogênese é um processo de múltiplas etapas que en- proteínas supressoras de tumor pRb e p53, desencadeando volvem mudanças genéticas e epigenéticas, culminando na a morte celular ou agindo como um fator de iniciação e ativação de proto-oncogeneses e/ou inativação dos genes progressão de processos malignos (Silva et al., 2003). supressores de tumor, que modifica o fenótipo celular. Uma Alguns tipos de papilomavírus humano (HPV), nos últimos célula maligna se difere de uma célula normal principal- anos, têm sido responsabilizados pelo desenvolvimento de mente pela sua independência no controle do ciclo celular. malignidade nas regiões que comumente infectam, com- O HPV pode transformar e imortalizar as células hospedei- preendendo, na mulher, o períneo, vulva, vagina, colo do ras, iniciando assim um processo maligno. Os produtos dos útero e região anal (Einstein & Goldberg, 2002) e, no ho- genes E6 e E7 são importantes para a transformação e Recebido em 28/08/2006 Aprovado em 21/09/2007 1 Pós-Graduanda do Programa de Pós-Graduação Lato Senso em Genética / Núcleo de Pesquisas Replicon / Universidade Católica de Goiás / Goiânia – GO; 2 Biomédico Geneticista, Pesquisador do Núcleo de Pesquisas Replicon / Professor de Biologia Molecular do Departamento de Biologia / Universidade Católica de Goiás / Goiânia – GO; 3Médica do Hospital Araújo Jorge / Registro de Câncer de Base Populacional / Associação de Combate ao Câncer em Goiás / SuLeide – Superintendência Leide das Neves Ferreira / Secretaria de Estado da Saúde Goiânia – GO; 4Biomédico Geneticista do LaGene - Laboratório de Citogenética e Genética Humana / SuLeide – Superintendência Leide das Neves Ferreira / Secretaria de Estado da Saúde, Professor de Genética do Departamento de Biologia e Pesquisador do Núcleo de Pesquisas Replicon / Universidade Católica de Goiás / Goiânia – GO; 5Biomédico Geneticista do LaGene - Laboratório de Citogenética e Genética Humana / SuLeide – Superintendência Leide das Neves Ferreira / Secretaria de Estado da Saúde, Professor de Biologia Molecular do Departamento de Biologia, Pesquisador do Núcleo de Pesquisas Replicon / Universidade Católica de Goiás e Pesquisador do Hospital Araújo Jorge / Registro de Câncer de Base Populacional / Associação de Combate ao Câncer em Goiás / Goiânia – GO RBAC, vol. 39(4): 255-257, 2007 255
  • 2. imortalização celular. A proteína E6 tem uma grande afini- MATERIAL E MÉTODOS dade pelo DNA e é encontrada tanto no núcleo como na membrana plasmática. A proteína E7 é uma fosfoproteína GRUPO AMOSTRAL encontrada no citoplasma e, provavelmente, no núcleo O grupo amostral foi constituído de 15 pacientes recém di- (Garcia-Carrancá & Gariglio, 1993). Os produtos dos genes agnosticados com carcinoma da laringe. Os casos foram supressores de tumores presentes nas células como as pro- obtidos do Registro de Câncer de Base Populacional de teínas pRb e p53 são alvo da ação dos produtos dos genes Goiânia/GO da Associação de Combate ao Câncer em Goi- dos virais. Em geral, a atividade da proteína pRb é inibida ás. Todos os pacientes considerados foram diagnosticados pela proteína viral E7, enquanto que, a proteína p53 é de- como carcinomas da laringe (CID-O: C32). A participação gradada subseqüentemente à ligação com a proteína E6. A perda das funções de ambas as proteínas celulares respon- foi de caráter voluntário e no ato da coleta da amostra, os sáveis pela supressão tumoral contribui para a progressão pacientes foram submetidos a uma entrevista e preenche- de tumores (Vousden, 1993). ram um questionário sobre hábitos de vida para determinar O gene RB1 é um supressor de tumor (GST) localizado no possíveis associações entre hábitos e os carcinomas larín- braço longo do cromossomo 13 (13q14), que tem como pro- geos. As amostras biológicas dos tumores foram separadas duto a proteína celular pRb, de aproximadamente 105 kDa. na ocasião de realização de biópsias e/ou cirurgias. Após a A proteína pRb tem a função de inibir a progressão do ci- retirada cirúrgica, as biópsias foram transportadas em câ- clo celular, pois é capaz de seqüestrar o fator de transcrição mara fria, com temperatura média de 10oC, armazenadas E2F e impedi-lo de promover a transcrição de genes neces- sem conservantes e fixadores em criotubos e acondiciona- sários para a replicação do DNA na fase S. A associação da das a – 20oC até o momento do uso. proteína pRb com a proteína viral E7 causará uma pertur- bação no controle normal do ciclo celular, resultando em EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DO DNA um estímulo positivo para a proliferação das células infec- Para a extração de DNA, 10-20mg de cada biópsia foram tadas (Sandal, 2002). maceradas previamente em nitrogênio líquido. Posterior- O gene p53 é também considerado como GST, está locali- mente, o tecido macerado foi submetido à extração do zado no braço curto do cromossomo 17 (17p13), cujo pro- duto é a proteína p53. Esse gene apresenta 11 éxons, entre DNA com o kit de purificação do DNA genômico Wizard® os quais o primeiro deles não é codificante. A proteína p53 (Promega Corporation, EUA), seguindo-se as instruções do é constituída de 393 aminoácidos na sua extensão, apre- fabricante. sentando quatro regiões com funções distintas, chamadas domínios da proteína. Uma vez ativada a proteína p53 é ca- PCR CONVENCIONAL paz de reprimir a progressão celular e sinaliza para a apop- Todas as amostras foram submetidas a uma primeira PCR tose. A proteína p53 uma vez ativada por fosforilação ou com os primers genéricos GP05/06 para detecção do geno- acetilação da extremidade C-terminal passa a se ligar de ma de qualquer HPV. Em seguida, fez-se uma segunda PCR maneira específica ao DNA, agindo como um fator de com os mesmos primers, utilizando o produto da PCR ante- transcrição através da ligação em seqüências específicas, rior. Assim, as amostras só foram consideradas negativas promovendo a transativação downstream de genes alvos. para o HPV após serem submetidas a duas PCRs, com pos- Para desempenhar tal função as proteínas p53 se associam terior repetição das reações para confirmação do resultado. entre si formando tetrâmeros, que são complexos protéicos Um conjunto de primers, que amplifica a região D8S135 de resultantes da associação de quatro monômeros. Após o 8p11, foi utilizado como controle interno da reação. A se- evento de tetramerização a proteína passa a ser capaz de qüência de todos os primers e o tamanho esperado dos frag- impedir a proliferação celular ou induzir a morte da célula por apoptose. Nesse sentido, a proteína p53 é responsável mentos amplificados encontram-se na Tabela 1. por monitorar danos ocorridos nas moléculas de DNA. Des- ta forma, o ciclo celular é impedido de prosseguir até que O protocolo de termociclagem para a amplificação do ge- o dano no DNA seja restaurado. noma de HPV está descrito na Tabela 2. A proteína E6 do papiloma vírus humano de alto risco on- cogênico se associa a proteína p53, que é responsável pela ANÁLISE DOS FRAGMENTOS DE PCR regulação da passagem da fase G1 para S e da fase G2 pa- Para a análise dos produtos de PCR, o DNA foi submetido ra M, no ciclo celular. A proteína E6 recruta a proteína ce- à eletroforese em campo elétrico constante de 8V/cm em lular E6AP, que funciona como uma ubiquitina-ligase para gel de poliacrilamida 6% em TBE 1x. Para a visualização o complexo tetramérico contendo p53. Este recrutamento do DNA amplificado, o gel foi corado em banho de solução resulta na ubiquitinação de p53 seguido de sua rápida de- de brometo de etídio (5μg/mL) e as imagens foram captu- gradação (Stubenrauch & Laimins, 1999). Sem a proteína radas e reveladas pelo sistema de vídeo documentação p53 a célula perde a capacidade de perceber e reparar pos- ImageMasterVDS® (Amersham Pharmacia Biotech, EUA). síveis danos no DNA, assim, a divisão celular passa a ocor- rer sem reparo. Conseqüentemente, aumenta-se a fre- PCR EM TEMPO REAL qüência das mutações, dos rearranjos cromossômicos, das aneuploidias. O acúmulo de eventos mutacionais é a causa As reações de PCR em tempo real foram realizadas no apa- subjacente ao desenvolvimento de um fenótipo neoplásico relho Rotor-Gene® (Corbertt Research, Austrália) que mos- e, assim, provavelmente, resultam no câncer (Vogel & Mo- trou resultados similares quando repetidos. Para cada teste, tulsky, 2000; Griffiths et al.,1998; Vousden, 1993). foram utilizados 0,5uL de DNA, 12,5uL SYBR Green PCR O objetivo deste estudo foi comparar a eficiência da detecção Master Mix® (Invitrogen,USA), 1,0uL de cada um dos pri- do genoma de HPV pela reação em cadeia da polimerase mers conforme indicado na Tabela 1 e 10,0uL de água para (PCR) convencional com a PCR em tempo real, em biopsia de completar o volume final de 25,0uL. As condições de ampli- laringe de pacientes com carcinoma espino-celular (CEC). ficação foram as mesmas conforme indicadas na Tabela 3. 256 RBAC, vol. 39(4): 255-257, 2007
  • 3. TABELA I RESULTADOS Seqüências consenso dos primers utilizados e o tamanho esperado do fragmento amplificado. Foram observadas a amplificação de DNA humano (D8S135) em todas as reações. Na PCR convencional, os Tipos S* Se qüê nc ias 5 ’‡ 3’ Fragm ent o (pb) primers GP05/GP06 foram amplificados em 30% dos casos F GG G A G G C TT TA T AA T TA T TTA GC (5/15), evidenciando a presença do genoma de HPV nas D8S 135 R CTG GGC A AC AG A GT G G GA C 100 células de CEC da laringe. Quando estes mesmos primers foram utilizados no ensaio de PCR em tempo real, apresen- GP05 F TT T G TT AC T G TG GT A G AT ACT AC 170 taram amplificação em 46,7% (7/15) das amostras, eviden- GP06 R GAA AA A TAA AC T G TA AA T CA T A TT C ciando uma diferença em 40% dos casos. A Tabela 4 apre- *S: Sentido – F: Forward (Direto) e R: Reverse (Reverso). senta os resultados observados neste estudo. TABELA II DISCUSSÃO Protocolo da termociclagem para o ensaio de PCR con- vencional para a amplificação do genoma de HPV a partir Estudos recentes demonstram que a utilização da reação de DNA total extraído das células de CEC da laringe. em cadeia da polimerase em tempo real com primers con- senso é mais eficiente para identificar o genoma de HPV Passos Temperatura (oC) Te mpo (m in) quando comparada com o ensaio de PCR convencional. O Desnaturação inicial 95 5 ensaio PCR em tempo real tem sido muito utilizado em ava- liação retrospectiva, na tentativa de detectar a presença de Desnaturação 95 1 Ciclos (10) genomas virais. Adicionalmente, PCR em tempo real é uma Anelamento 57 1 ferramenta muito útil na quantificação da carga viral e da Extensão 72 1 genotipagem de HPV, assim como de outros tipos virais. O aumento na freqüência de detecção da presença do ge- Ciclos (30) Desnaturação 95 1 noma viral nas amostras de pacientes com CEC na laringe Anelamento 50 1 por PCR em tempo real sugere que devemos ter uma Extensão 72 1 atenção especial nos resultados obtidos pelo método con- Extensão final 72 5 vencional. Durante anos o ensaio utilizando PCR convenci- Conservação 4 ∞ onal vem sendo largamente utilizado nos laboratórios para diagnóstico em diversas rotinas laboratoriais. Apesar de TABELA III ser confiável, os ensaios que utilizam PCR convencional Protocolo da termociclagem para o ensaio de PCR em podem não ser completamente satisfatórios. Por outro lado, tempo real para a amplificação do genoma de HPV a par- os testes utilizando novas metodologias devem ser inseri- dos na rotina laboratorial de maneira consciente e funda- tir de DNA total extraído das células de CEC da laringe. mentados. È necessário aumentar investimentos em infra- estrutura e na aquisição de novos equipamentos, treina- Passos Temperatura (oC) Tempo (min) mento pessoal e compreensão pelos clínicos da utilização Desnaturação inicial 95 10 de novas metodologias. Desnaturação 94 1 Ciclos (40) AGRADECIMENTOS Anelamento 40 1 Extensão 72 1 Nossos agradecimentos aos membros do Hospital Araújo Conservação 4 ∞ Jorge/ Registro de Câncer de Base Populacional/ Asso- ciação de Combate ao Câncer de Goiás, do TABELA IV do LaGene/SES e do NPR/UCG pelo extenso apoio para Resultados da amplificação das amostras de DNA extraí- com todos os pesquisadores associados. do de pacientes com CEC da laringe. REFERÊNCIAS Primers 1. ALMADORI G., GALLI J., CADONI. Et al. Human papilomavirus infection and Código cyclin D1 gene amplification in laryngeal squamous cell carcinoma: biologic GP0 5/G P06 Paciente D8S 135 function and clinical significance. Head and Neck. 24 (6), p.597-604, jun. 2002. PCR convencional PCR em tempo real 2. BIBBO, M. & SILVA FILHO, A.M. Lesões relacionadas à infecção por HPV no trato anogenital. In Villa, L.L. (Eds). Aspectos moleculares da oncogênese por 085 -209 + papilomavírus. Revinter, 1998, p.51-58. 085 -213 + + 3. EINSTEIN, M.H.; GOLDBERG, G>L> Human Papillomavirus and cervical ne- oplasia. Cancer Invest, 20 (7-8), p.1080-5, 2002 085 -261 + 4. HA CUBIE, ALSEAGAR, Et al. Rapid real time PCR to distinguish beteween 085 -417 + + + hig risk human papillomavirus types 16 and 18. Clin Pothol: Mol Pothol 2001;54:24-29. 085 -429 + 5. MARTIN MORBERG< INGER GUSTAVSSON, AND ULF GYLLENSTEN. Real- 085 -438 + + + Time PCR-Based System For Simultaneous Quantification Of Human Papil- lomavirus Types Associated With High Risk Of Cervical Cancer Journal of 085 -434 + clinical Microbiology, july 2003, p. 3221-3228. 085 -476 + + 6. MCKAIG, R>G.; BARIC, R>S.; OLSHAN, A>F> Human papillomavirus and hed and neck câncer: epidemiology and molecular biology. Head and Neck, 085 -491 + 20 (3), p 250-65, maio 1998. 085 -597 + 7. SANTOS, O.S.N.; ROMANOS, V.T.M.; WIGG, D.M. Introdução à virologia hu- mana. In: ROMANOS, M.T.V.; SSANTOS, N.S.O.; MIRANDA, M.M.F.S. (Eds). 085 -600 + Virose oncogênicas. Guanabara Koogan, 2002. p. 204 085 -657 + + + 8. SOUTO, R, FALHARI,J.P.B.; DA CRUZ, A.D.; O Papilomaviírus Humano: Um 085 -659 + + + Fator Relacionado Com a formação de Neoplasias. Revista Brasileira de Cancerologia,2005; 51 (2): 155-160 085 -660 + ________________________________________ 085 -743 + + + ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: Núcleo de Pesquisas Replicon 085 -200 + Departamento de Biologia 085 -200 + Universidade Católica de Goiás Rua 235, 40 Bloco 4L – Área IV - Setor Universitário Tota l (%) 30 ( 5/15) 46, 7 (7/ 15) CEP 74605-010 Goiânia - GO +: A mp lifica çã o Fomento: PROPE – Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa / UCG RBAC, vol. 39(4): 255-257, 2007 257