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cromatografia. conceitos fundamentais ki
- 1. Química Analítica /JCM HPLC - Cromatografia líquida de alta eficiência HPLC High Performance (pressure) Liquid Chromatography ☺ nas colunas de enchimemto o fluxo é baixo mesmo para granulometrias elevadas (150-200 µ µ µ µm) granulometria HEPT - exige pressões muito elevadas ☺ mistura de nucleosidos - 1967 - 60 min / 10-20 psig 1969 - 24 min / 400 psig 1970 - 1,25 min / 5000 psig Condições actuais: ☺ colunas de 5 a 25 cm com enchimento de 3 a 10 µ µ µ µm ☺ 5000 - 10 000 psig / 40 000 - 100 000 pratos / m Constituíntes 1 psig = 108 kPa HPLC - tipo de cromatoografia que emprega uma fase móvel líquida e uma fase estacionária finamente dividida e que, para ter um fluxo razoável, opera a pressões elevadas Bombas Sistema de solventes Detector Coluna Injector Aquisição e trat. de dados
- 2. Química Analítica /JCM Validação Num laboratório de cromatografia com dois analistas foram realizados vários testes para verificar se o método em uso para a determinação por GC de etanol em hiclato de doxiciclina (valor teórico: 4,5%) poderia ser considerado válido. Foram obtidos os seguintes resultados: tempos de retenção relativos: metanol: 0,3 / acetona : 0,6 / etanol 1,0 ☺ Metanol e acetona são possíveis impurezas solução amostra: 12345 / 12450 / 11950 / 12456 / 12100 Soluções de etanol a: 20%: 3120 / 40%: 4980 / 60%: 7305 / 80%: 9850 / 100%: 12300 / 120%: 14650 solução amostra (repetição): 12245 / 12650 / 12405 / 12158 / 12250 solução amostra (outro dia /analista): 11900 / 13070 / 12347 / 11250 / 12440 ☺ Nota: as percentagens indicadas dizem respeito ao valor teórico: 4,5%. O método é selectivo? Qual o valor obtido? Que conclusões poderá tirar quanto à validade do método e à destreza dos analistas envolvidos na determinação? Que sugeria para melhorar a confiança no resultado? Enviar até 11.04.07 para: marques@uma.pt
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- 5. Química Analítica /JCM Resolução Desconhecendo a resolução dificilmente se pode dizer se um método é selectivo Se 4,5 % é a percentagem teórica, corresponde à solução a 100%!! Por isso se indicam soluções acima e abaixo deste valor Não se pode confundir o significado dos 4,5% e da % das soluções padrão A maioria dos alunos retirou a solução a 20% que neste caso não seria preciso A área foi mudada de 3500 para 3120 Claramente um dos analistas tem falta de formação Nota: os resultados de ambos os analistas são exactos mas um deles pouco preciso A repetibilidade pode ser boa mas não a reproductibilidade A solução não é colocar o bom analista a fazer sempre o método mas dar formação ao outro analista Resultado Quando se indica que o valor teórico é de 4,5 % significa que se admite que o erro esteja no 5! ☺ Não tem valor indicar um resultado com 3 algarismos significativos ☺ Seria diferente se o valor teórico fosse de 4,50 %
- 6. Química Analítica /JCM HPLC Sistema de solventes desgaseificação / vácuo - hélio (sparging) Bombas ☺ bombas de duplo pistão ☺ válvulas proporcionais ☺ câmara de mistura eluição isocrática - composição da FM é constante eluição de gradiente - composição da FM varia ao longo do cromatograma ☺ Bombas isocráticas ☺ Bombas binárias ☺ Bombas quaternárias
- 7. Química Analítica /JCM Bombas Bombas pressão elevada ( 6000 psig) - riscos de fugas saída contínua (sem pulsação) / pistão fluxos de 0,1 a 10 ml/min reproductibilidade de fluxo de 0,5% !!
- 8. Química Analítica /JCM Injector Injector o uso de septum é limitado a cerca de 1500 psig injecção em loop de volume fixo ( 5 - 500 µl) ☺ típico 20 µ µ µ µl Autoinjector ☺ Capacidade de preparação de amostras
- 9. Química Analítica /JCM HPLC - colunas Enchimento sílica (aglomeração de partículas altamente regulares ☺ eventualm. cobertas por filme orgânico alumina / polímeros porosos / resinas permutadoras de iões colunas de aço com 10 a 30 cm de comprimento e 4 a 10 mm de diâmetro interno enchimento de 5 a 10 µ µ µ µm / 5000 - 6 000 psig / 40 000 - 60 000 pratos / m colunas de aço com 10 a 30 cm de comprimento e 4 a 10 mm de diâmetro interno enchimento de 5 a 10 µ µ µ µm / 5000 - 6 000 psig / 40 000 - 60 000 pratos / m Micro: 3 a 7,5 cm de comprimento / DI = 1 a 4,6 mm / 10 000 psig / 3 ou 5 µ µ µ µm / até 100 000 pratos / m Vantagens: velocidade elevada e baixo consumo de solventes 3.0 and 4.6mm Standard Super-Link System™ HPLC Columns
- 10. Química Analítica /JCM HPLC - enchimentos A cromatografia de partição representa a maioria das aplicações líquido-líquido: fase estacionária é um solvente adsorvido no suporte (apenas usado ocasionalmente) fase ligada: fase estacionária orgânica está ligada à superfície do suporte por ligações covalentes ( estabilidade - uso) Enchimentos de fase ligada outros grupos funcionais: aminas alifáticas / éteres / nitrilos / hidroc. aromáticos maior estabilidade / apresenta alguma limitação na capacidade de amostra Cromatografia de fase normal fase estacionária polar / fase móvel não polar - o soluto menos polar elui primeiro ☺ água; trietilenoglicol; CN / hexano, éter isopropílico Cromatografia em fase reversa (+ de 75 % das aplicações) fase estacionária não polar / fase móvel polar / soluto mais polar elue primeiro ☺ C8; C18 / soluções aquosas de metanol, acetonitrilo, THF; soluções tamponadas / / CH3 / / CH3 - Si -- OH + Cl - Si -- R --Si -- O -- Si -- R ; R = octil (C(8) / octadecil (C18) CH3 CH3
- 11. Química Analítica /JCM Pré-colunas + forno Pré-colunas aumento da vida das colunas ☺ mesma (similar) composição da fase estacionária / maior granulometria ☺ remoção de partículas e contaminantes dos solventes ☺ saturação da fase móvel com a fase estacionária Forno de colunas TA - 150 C (temperatura ambiente - ou ligeiramente acima - na maioria das aplicações) ☺ Maior a temperatura menores os tempos de retenção ☺ Maiores temperaturas causam maior degradação da coluna para a quantificação a termostatização é essencial (± 0,1 C) ☺ A identificação é essencialmente feita com base nos tempos de retenção
- 12. Química Analítica /JCM HPLC
- 13. Química Analítica /JCM Detectores HPLC
- 14. Química Analítica /JCM Espectro electromagnético Espectro electromagnético Espectroscopia / espectrometria - informação geral / informação quantitativa a espectroscopia está na base do grande desenvolvimento da ciência actual, desde a química à astronomia A espectroscopia - estudo da interacção da radiação electromagnética com a matéria Espectro - representação bidimensional da força da interacção vs. energia transições nucleares excitação electrónica vibração molecular rotação molecular spin electrónico RMN raios cósmicos raios gama raios x UV VIS IV micro ondas ondas rádio λ, cm e- internos
- 15. Química Analítica /JCM Fenómenos associados à absorção da luz R - Relaxação vibracional A - Absorção F - Fluorescência (mesmo spin) P - Fosforescência (spins dif.) IC - Conversão Interna (mesmo spin) ISC - conversão intersistema (spins dif.) P aparece sempre a maiores comprimentos de onda ( E) que F Ambos os fenómenos são raros devido aos tempos de vida muito curtos
- 16. Química Analítica /JCM HPLC - detectores Os detectores de absorção (UV + Vis) são usados na maioria das aplicações células analíticas detector de foto-diodos (diode array) 0.98 - 1.02 Response Index 5 x 10-8 to 5 x 10-4 g/ml Linear Dynamic Range 5x 10-8 g/ml Sensitivity (toluene) 0.97 - 1.03 Response Index 5 x 10-7 to 5 x 10-4 g/ml Linear Dynamic Range 1 x 10-7 g/ml Sensitivity
- 17. Química Analítica /JCM UV – comprimento de onda 360nm
- 18. Química Analítica /JCM DAD
- 19. Química Analítica /JCM Comparação de espectros UV
- 20. Química Analítica /JCM Fluorescência vs. UV
- 21. Química Analítica /JCM HPLC Critérios de escolha uma boa separação representa sempre um balanço entre as forças intramoleculares que se estabelecem entre amostra e fases estacionária e móvel usar uma fase estacionária com polaridade semelhante à amostra e uma fase móvel de polaridade muito diferente ☺ o contrário é possível mas menos eficaz (tr geralmente muito curtos) ☺ polaridades idênticas (amostra e fase estacionária) pode levar a tr muito longos alterar a polaridade do solvente (mistura) de forma a melhorar a separação Aspectos experimentais temperatura estável para trr reproductíveis desgaseificação dos solventes 2-3 réplicas e soluções padrão ☺ limite de detecção - menor concentração detectável (3x acima do ruído de fundo) ☺ limite de quantificação - menor concentração determinada sem ambiguidade (10x vezes o ruído de fundo) ☺ Tailing - arrastamento do pico (coeficientes de partilha não lineares) Cs Cm Cs Cm Cs Cm
- 22. Química Analítica /JCM Trabalho Descreva de forma breve o funcionamento de um detector ELSD Entregar por mail até 11 de Maio
- 23. Química Analítica /JCM Tratamento de amostras Amostras puras apenas necessitam do solvente apropriado (solubilização seguida de filtração) ☺ o solvente deverá ser semelhante ou mais fraco que o usado na fase móvel ☺ usar THF ou metanol em fase reversa (água) pode provocar perdas de resolução ☺ a escolha do solvente pode ser condicionada pelo detector utilizado Amostras compostas a presença de impurezas não dissolvidas exige, no mínimo, uma filtração extração da matriz (excipientes) ☺ necessidade de determinar a % de recuperação uso de solventes diferentes do usado na injecção exige reconstituição da amostra ☺ extração / concentração / reconstituição pré-colunas / separação de componentes de diferentes polaridades (Sep-Pak) Amostras biológicas caracterizadas por concentrações muito baixas precipitação das proteínas (acetonitrilo + centrifugação) / concentração / reconstituição
- 24. Química Analítica /JCM SPE
- 25. Química Analítica /JCM LLE
- 26. Química Analítica /JCM Derivatização Aminoácidos ☺ Reagente:6-aminoquinolyl-N-hydrozysuccinimidyl carbamate Liberta: N-hydroxysuccinimide (NHS) ☺ Reacção completa num minuto ☺ Derivados estáveis (+ de 1 semana) ☺ Fluorescem a 395 nm AccQTag column 3.9 x 150mm (waters) Fluorescence detection with 250 nm excitation, 395 nm emission UV detection at 248 nm A 140mM NaAC, 6.9mM Triethylamine, EDTA (1ml of a 1mg/ml solution per liter) pH to 5.8 w / 5 - 10% phosphoric acid solution B Acetonitrile C Water
- 27. Química Analítica /JCM Cromatografia preparativa
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- 29. Química Analítica /JCM Aquisição e tratamento de dados Automação o uso de computadores veio aumentar a capacidade de utilização dos aparelhos preparação da amostra / injecção / controlo / aquisição / tratamento de dados ☺ sistemas de optimização de separações cromatográficas Aquisição de dados 20 - 200 Hz ( 8 pontos por pico) ☺ para definir um pico são precisos pelo menos 3 pontos a “subir” e 3 a “descer” armazenagem (identificação) Tratamento de dados acumulação / “smoothing” / integração / derivatização determinação de tempos (tr) e intensidades (áreas / alturas) ☺ integração - definição do princípio e fim do pico ☺ picos mal definidos (falta de resolução e “tailing”) correção da linha de base tratamento à posteriori ☺ utilizando novos parâmetros (“threshold” / integração) não melhora a separação!!