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Aula 01 introdução

O documento apresenta um resumo sobre cromatografia líquida e suas técnicas. Descreve os principais conceitos como fases móvel e estacionária, fatores de retenção, resolução e eficiência. Também explica os mecanismos de separação e fatores que influenciam a qualidade da separação cromatográfica.

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Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais MÉTODOS ANALÍTICOS EM QUÍMICA ORGÂNICA – II - CROMATOGRAFIA - Prof. Dr. Alberto J. Cavalheiro Instituto de Química de Araraquara – UNESP Departamento de Química Orgânica
Introdução às principais técnicas cromatográficas utilizadas na análise qualitativa e/ou quantitativa de substâncias orgânicas em mistura, com ênfase em cromatografia líquida (CL). Objetivo
Metodologia AULAS Expositivas Práticas AVALIAÇÕES (P) 2 Provas escritas (individuais) 45% (S) 2 Seminários (dupla) 30% (R) Relatórios das práticas (dupla) 20% (A) Avaliação de aproveitamento das aulas (“individual”) 5% Média = 0,45P + 0,3S + 0,2R + 0,05AMédia = 0,45P + 0,3S + 0,2R + 0,05A
INTRODUÇÃO À CROMATOGRAFIA 1. Braithwaite, A. Chromatographic Methods, 4ª ed. 1985. 2. Scott, R. P. W. Techiques and practice of chromatography. v. 70, 1995. 3. Miller, J. M. Chromatography, 1988. 4. Poole, C. F. and Poole, S. K. Chromatography today. 1991. 5. Sewell, P. A. Chromatographic separactions, 1987. 6. Collins, H. C. Introdução a métodos cromatográficos. Ed. Unicamp. 7ª ed. 1995. CLAE Snyder, L. R., Kirkland, J. J., Glajch, J. L. Practical HPLC Method Development. 2a. Ed. John Wiley. 1997. Bibliografia
Fase Extratora a + B A + b A + B Mistura HeterogêneaF1 F2 Mistura Homogênea (Amostra) a + b A + b a + B a + b A + b a + B n etapas [A]F2 [A]F1 KA= [B]F2 [B]F1 KB= Princípio Geral
Técnica de análise de substâncias em mistura, que envolve a distribuição diferencial dessas substâncias em um sistema heterogêneo bifásico. SISTEMA CROMATOGRÁFICO: Heterogêneo e bifásico Fase Móvel (FM) Fase Estacionária (FE) Configuração gás (CG) sólido ou líquido coluna líquido (CL) sólido ou líquido coluna/planar Cromatografia CC = cromatografia em coluna CCD = cromatografia em camada delgada (planar)
Técnica de análise de substâncias em mistura, que envolve a distribuição diferencial dessas substâncias em um sistema heterogêneo bifásico. Cromatografia Analítica: Análise qualitativa e/ou quantitativa de substâncias em mistura. Cromatografia Preparativa: Purificação de substâncias em mistura. Cromatografia
Fase Extratora a + B A + b A + B Mistura HeterogêneaF1 F2 Mistura Homogênea (Amostra) a + b A + b a + B a + b A + b a + B n etapas [A]F2 [A]F1 KA= [B]F2 [B]F1 KB= Princípio Geral
Cromatografia Processo dinâmico em que a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel. CC
Processo dinâmico em que a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel. Cromatografia
Processo dinâmico em que a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel. Cromatografia
Processo dinâmico em que a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel. Cromatografia
Processo dinâmico em que a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel. Cromatografia
Processo dinâmico em que a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel. Cromatografia
Processo dinâmico em que a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel. Cromatografia CC
Processo dinâmico em que a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel. Cromatografia Cromatograma Registro gráfico do processo cromatográfico Resolução (Rs) 21 12 ).(2 ww trtr Rs + − = CC
Cromatograma t0 = momento da aplicação da amostra na coluna tm = tempo morto tr = tempo de retenção w = largura do pico h = altura do pico
AMOSTRAAMOSTRAAMOSTRAAMOSTRAAMOSTRAAMOSTRAAMOSTRAAMOSTRA Rf = d/D 1,00 0,00 (ORIGEM) 0,73 0,36 0,08 D d 10,0 cm 7,3 cm 3,6 cm 0,8 cm Rf = fator de retenção D = distância percorrida pela FM D = distância percorrida pela mancha Origem = ponto de aplicação da amostra Cromatografia Cromatografia em Camada Delgada CCD ou TLC
Adsorção Absorção Permeação (dissolução) Líquido/gás sólido Líquido sólido + + + - - Líquido/gás líquido Líquido/gás gel/sólido INTERAÇÕES INTERMOLECULARES Iônicas Ponte de Hidrogênio van der Waals Keeson (dipolo/dipolo) Debye (dipolo/dipolo induzido) London (dipolo induzido/dipolo induzido) Mecanismos
Antes 1965 - Colunas de vidro Partículas > 100 µm Fase Normal (silica, alumina, etc.) Amostras pouco polares Fluxo induzido por gravidade Tempo: horas - dias Detecção: off-line (UV, pH, gravimetria, etc) 1965 a 1970 - Partículas 30-50 µm Bombas para impulsionar FM Primeiros detetores on-line: IR, UV. Depois 1975 - Fase Reversa (C18, C8, C2, etc.) Compatibilidade com amostra biológicas polares Tempo: minutos Depois 1980- Automação completa CC - Instrumentação
Micheal S. Tswett (ou Tsvett) Botânico Russo Pai da cromatografia 1906 - χρωµα γραφια croma grafia Separação de pigmentos vegetais Micheal S. Tswett (ou Tsvett) Botânico Russo Pai da cromatografia 1906 - χρωµα γραφια croma grafia Separação de pigmentos vegetais Kuhn, Wintertein e Lederer 1931 Reinvenção da técnica Separação de carotenóides e xantofilas A. J. P. Martin 1944 Cromatografia em papel Separação substâncias polares, como amino ácidos, carboidratos e pigmentos PRIMEIRAS APLICAÇÕES: ESTUDO DE METABÓLITOS VEGETAIS J. Chem. Ed. 1967, 44, 238.
Cromatografia em Coluna Aberta Algodão Disco de papel filtro Empacotamento: - Suspensão - Seco Análise das frações: - CCD 15 – 30 cm 60–200 µm Cromatografia
SOLVENTES BOMBA INJETOR COLUNA DETETOR COLETOR DESCARTE Cromatografo Líquido
CCD - Instrumentação Simplicidade Baixo custo Suporte sólido Adsorvente (FE) Espalhador Cuba Revelador
CCD - Instrumentação Até 31 canais diferentes (190-800 nm)
Cromatograma t0 = momento da aplicação da amostra na coluna tm = tempo morto tr = tempo de retenção w = largura do pico h = altura do pico
Fluxo (F): vazão da FM, geralmente em mL/min. Tempo morto (tm): tempo necessário para eluir uma substância que não interage com a FE. Volume morto (Vm): volume de FM necessário para preencher todos os interstícios e poros da FE, ou volume de FM necessário para eluir uma substância que não interage com a FE. tm = Vm/F Tempo de retenção (tR): tempo necessário para eluir uma substância de um determinado sistema cromatográfico. Volume de retenção (VR): volume de FM necessário para eluir uma substância de um determinado sistema cromatográfico. tR = VR/F DEFINIÇÕES Nomenclature for Chromatography. Pure & Appl. Chem. 65:819-872 (1993)
)( )( .2 21 12 ww trtr Rs + − = Resolução (Rs) Indica a qualidade da separação entre duas bandas cromatográficas. Para resolução completa, Rs > 1,25
Mapa de Resolução
Resolução (Rs) Fatores envolvidos na resolução cromatográfica: 2 2 1 2 .54,5ou.16         =      = w tr N w tr N N: Fator de eficiência Relação entre tempo de permanência do analito no sistema e alargamento da banda cromatográfica. Quanto mais difícil a separação (a pequeno), maior N necessário. k’: Fator de capacidade ou de retenção É a razão da distribuição do analito entre FE/FM Quanto maior, maior a afinidade do analito pela FE, em relação à FM. tm tmtr k n n k FM FE − == 'ou' 1 2 ' ' k k =α α: Fator de seletividade É a razão entre os fatores de retenção de dois analitos. Quanto maior, mais fácil a separação.
N: Fator de eficiência (Pratos Teóricos) Relação entre tempo de permanência do analito no sistema e alargamento da banda cromatográfica. Quanto mais difícil a separação (a pequeno), maior N necessário. Ajustar através de: comprimento da coluna ou placa tamanho e forma da partícula fluxo da FM volume da amostra quantidade de amostra 2 2 1 2 .54,5 ou.16         =       = w tr N w tr N Resolução (Rs)
k’: Fator de capacidade ou de retenção É a razão da distribuição do analito entre FE/FM Quanto maior k’, maior a afinidade do analito pela FE, em relação à FM. Ajustar através de: força de eluição da FM polaridade da FE tm tmtr k n n k FM FE − == 'ou' Resolução (Rs)
α: Fator de seletividade É a razão entre os fatores de retenção de dois analitos. Quanto maior, mais fácil a separação. Ajustar através de : tipo de componente da FM tipo de FE 1 2 ' ' k k =α Resolução (Rs)
)1'( ' . )1( . 4 2 2 + − = k kN Rs α α EFICIÊNCIA Depende da configuração do sistema SELETIVIDADE RETENÇÃO Dependem das características da FM e FE do sistema FATORES QUÍMICOS FATORES FÍSICOS Resolução (Rs)
0 2 4 6 8 10 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 InfluêncianaResolução n N NRs ∝ 0 2 4 6 8 10 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 (α-1/α) α α α 1− ∝Rs 0 2 4 6 8 10 12 14 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 K'/(1+K') K' 1' ' + ∝ k k Rs )1'( ' . )1( . 4 2 2 + − = k kN Rs α α κ (RETENÇÃO) TEMPO (SELETIVIDADE) α N (EFICIÊNCIA) Resolução (Rs)
Dificultar o espalhamento da banda Aumentar a área da FE Diminuir volume da FM ↑ N Diminuir tamanho das partículas (mm) Partículas esféricas Aumentar comprimento da coluna (L) Otimizar fluxo da FM Otimizar temperatura Otimizando a Resolução 1. Eficiência (N) .16 2       = w tr N
Coluna, tubulação, injetor, detetor ∑ 2 = Lh /σ µ µ C B Ah ++= A = Difusão de Eddy B = Difusão molecular na FM C = Efeitos da transferência de massas Otimizando a Resolução 1. Eficiência (N) Fatores que afetam o espalhamento da banda cromatográfica. h = N/L h: altura de um prato teórico ou
d L N .4,0max = Comprimento grande causa espalhamento e análise longa Partícula muito pequena necessita pressão muito alta 40 − 6 0 µm 5 µm DIÂMETRO PARTÍCULA L=15cm L=25 cm 60 − 200 µm (130 µm) ⇒ 460 770 40 - 60 µm (50 µm ) ⇒ 1.200 2.000 20 µm ⇒ 3.000 5.000 10 µm ⇒ 6.000 10.000 5 µm ⇒ 12.000 20.000 3 µm ⇒ 20.000 33.300 1. Eficiência (N) Fatores que afetam o espalhamento da banda cromatográfica. Otimizando a Resolução
Coluna, tubulação, injetor, detetor ∑ 2 = Lh /σ µ µ C B Ah ++= A = Difusão de Eddy B = Difusão molecular na FM C = Efeitos da transferência de massas 1. Eficiência (N) Fatores que afetam o espalhamento da banda cromatográfica. h = N/Lou Otimizando a Resolução
Coluna, tubulação, injetor, detetor ∑ 2 = Lh /σ µ µ C B Ah ++= A = Difusão de Eddy B = Difusão molecular na FM C = Efeitos da transferência de massas 1. Eficiência (N) Fatores que afetam o espalhamento da banda cromatográfica. h = N/Lou Otimizando a Resolução
µ µ C B Ah ++= Equação de van Demmter A = Difusão de Eddy B = Difusão molecular na FM C = Efeitos da transferência de massas mt L =µ F V t m m = L V F m .µ= 1. Eficiência (N) Fatores que afetam o espalhamento da banda cromatográfica. Otimizando a Resolução
Otimizando a Resolução 2. Retenção (k’) e Seletividade (α) Fatores que afetam a interação relativa entre analitos e fase estacionária (FE) e fase móvel (FM). Para otimizar esses fatores, é preciso conhecer as características dessas duas fases e a maneira como os analitos interagem com elas: FASE ESTACIONÁRIA FASE NORMAL FASE REVERSA FASE MÓVEL SOLVENTES, características e compatibilidade FORÇA DE ELUIÇÃO
Otimizando a Resolução 2.1 Cromatografia de Fase Normal (FN) FE mais polar que FM. Interações ANALITO X FE e FM X FM (em ordem decrescente de intensidade): - Iônica (indesejáveis) - Ponte de Hidrogênio - Van der Waals Dipolo – dipolo Dipolo – dipolo induzido ADSORVENTES p/ FN (exemplos): -Sílica -Alumina -Poliamida -Fases ligadas polares (CN, NH2, Diol) Superfície da FE é polar.
Otimizando a Resolução 2.1 Cromatografia de Fase Normal (FN) FE mais polar que FM. ORDEM DE ELUIÇÃO (crescente) APOLAR → POLAR SOLVENTES MAIS COMUNS: - Hexanos (éter de petróleo pe 60-80o C) - AcoEt ou acetona - Et2O ou MTBE - i-PrOH ou MeOH - CHCl3 ou CH2Cl2 (DCM) Superfície da FE é polar.
Sílica gel Si O OH O O H Si O CH 3 Si O CH 3 C H 3 Si O OH C H 3 Si O H CH 3 CH 3 O H SiH 3 O H H O H H Otimizando a Resolução Mecanismo de adsorção: -Si-OH: Interações polares por ponte de hidrogênio, como doador ou aceptor de H. -Si-OH e –Si-O-Si-: dipolo/dipolo ou dipolo/dipolo induzido Esféricas Irregulares Diâmetro: 3 a 200 µm Poro: 60 a 120Å Partículas
Sílica gel Si O OH O O H Si O CH 3 Si O CH 3 C H 3 Si O OH C H 3 Si O H CH 3 CH 3 O H SiH 3 O H H O H H Otimizando a Resolução Vantagens: • Elevada resistência mecânica • Grande porosidade e área superficial • Gel duro (intumescimento não varia em função do solvente). Esféricas Irregulares Diâmetro: 3 a 200 µm Poro: 60 a 120Å Partículas PAREI AQUI
Sílica gel Si O OH O O H Si O CH 3 Si O CH 3 C H 3 Si O OH C H 3 Si O H CH 3 CH 3 O H SiH 3 O H H O H H Otimizando a Resolução Influência do teor de água da FM sobre a eficiência (H) e retenção (k’). FE: Sílica FM: DCM Amostra: Fenilpropanol Desvantagens: • Difícil controle da atividade de água • Forte adsorção de substâncias polares • Forte adsorção de substâncias básicas • Limite operacional de pH (2 a 8) • Sítios com energia de adsorção diferentes.
Otimizando a Resolução Alumina Atividade: capacidade de adsorção em função do teor de água adsorvida Atividade, segundo escala de Brockmann & Schadder Ativ. % de água Alumina Sílica I - - II 3 10 III 6 12 IV 10 15 V 15 20 O Al AlO ClAlCH3 Cl CH3 Cl ÁCIDA pH 4,0 O Al AlO ONaAlCH3 ONa CH3 ONa BÁSICA pH 9,0 O Al 2+ AlO AlCH3 O NEUTRA pH 7,0 CLAE CCD Alumina 1100 C4000 C II ou IIII
Otimizando a Resolução Alumina O Al AlO ClAlCH3 Cl CH3 Cl ÁCIDA pH 4,0 O Al AlO ONaAlCH3 ONa CH3 ONa BÁSICA pH 9,0 O Al 2+ AlO AlCH3 O NEUTRA pH 7,0 Mecanismo de adsorção: Al3+ : campo positivo favorece interação com moléculas polarizáveis (p. ex. sistemas conjugados) O2- : sítios básicos favorecem a interação com doadores de H+ Vantagens: • Elevada resistência mecânica • Faixa operacional de pH maior (2 a 12) • Gel duro (intumescimento não varia em função do solvente). • Retenção menos pronunciada de substâncias básicas.
Otimizando a Resolução Alumina O Al AlO ClAlCH3 Cl CH3 Cl ÁCIDA pH 4,0 O Al AlO ONaAlCH3 ONa CH3 ONa BÁSICA pH 9,0 O Al 2+ AlO AlCH3 O NEUTRA pH 7,0 Desvantagens (em relação à Sílica): • Catalisa reações (p. ex. aldólicas) • Partículas irregulares e maiores (↓ N) • Menor reprodutibilidade • Retenção pronunciada de substâncias ácidas (p. ex. ác. carboxilicos).
Otimizando a Resolução Alumina O Al AlO ClAlCH3 Cl CH3 Cl ÁCIDA pH 4,0 O Al AlO ONaAlCH3 ONa CH3 ONa BÁSICA pH 9,0 O Al 2+ AlO AlCH3 O NEUTRA pH 7,0 Aplicações: • Análises em condições mais básicas que as suportadas por sílica (> 9); • Poliaromáticos, alcalóides, aminas e vitaminas lipossolúveis.
Otimizando a Resolução Esféricas Irregulares Diâmetro: 3 a 200 µm Poro: 60 a 120Å Partículas Fases Ligadas (BPC) Si O OH O O H Si O CH 3 Si O CH 3 C H 3 Si O OH C H 3 Si O H CH 3 CH 3 O H SiH 3 O H H O H H Si R CH3 Cl CH3 + Sílica
Otimizando a Resolução Esféricas Irregulares Diâmetro: 3 a 200 µm Poro: 60 a 120Å Partículas Fases Ligadas (BPC) Si O OH O O Si O CH 3 Si O CH 3 C H 3 Si O O C H 3 Si O H CH 3 CH 3 O H SiH 3 Si R CH3H3C Si R CH3H3C SILANOL RESIDUAL Si O Si Si O Si Si O Si Si O Si Si O Si N Si O Si NH2 Si O Si OH OH ODS, RP-18, C-18 RP-8, C-8 Fenil CN, Cianopropil NH2,Propilamino TMS, C-1 Diol APOLARES POLARES Si CH3 CH3 Cl CH3 + Cloreto de trimetilsilano Fase ligada
Otimizando a Resolução Esféricas Irregulares Diâmetro: 3 a 200 µm Poro: 60 a 120Å Partículas Fases Ligadas (BPC) Si O Si Si O Si Si O Si Si O Si Si O Si N Si O Si NH2 Si O Si OH OH ODS, RP-18, C-18 RP-8, C-8 Fenil CN, Cianopropil NH2,Propilamino TMS, C-1 Diol APOLARES POLARES Si O OH O O Si O CH 3 Si O CH 3 C H 3 Si O O C H 3 Si O CH 3 CH 3 O H SiH 3 Si R CH3H3C Si R CH3H3C Si CH3 CH3 CH3 Fase ligada capeada
Otimizando a Resolução Fases Ligadas (BPC) Si O OH O O Si O CH 3 Si O CH 3 C H 3 Si O O C H 3 Si O CH 3 CH 3 O H SiH 3 Si R CH3H3C Si R CH3H3C Si CH3 CH3 CH3 Fase ligada capeada Vantagens:Vantagens: - Equilíbrio mais rápido - Menor adsorção irreversível - Água não influi na reprodutibilidade - Sítios de adsorção mais homogêneos - Eluição em gradiente facilitada Esféricas Irregulares Diâmetro: 3 a 200 µm Poro: 60 a 120Å Partículas
Fases Ligadas (BPC) CH3 CH3 CH3 TOLUENO NAFTALENO BIFENILA ACENAFTENO 2,3-DIMETILNAFTALENO COLUNA 100 x 8 mm Fluxo: 2,0 mL/min Detetor UV 254 nm C18 – 10% carbono Esférica – 5 µm Não capeada C18 – 7% carbono Esférica – 5 µm Capeada C18 – 10% carbono Irregular – 10 µm Não capeada C8 5% carbono CN 2% carbono Fenil 5% carbono Para amostra APOLAR ↓ Polaridade da FE, ↓ retenção dos analitos FM: ACN/Água 70:30
Otimizando a Resolução Fases Ligadas Polares - FN Interações ANALITO X FE e FM X FM (em ordem decrescente de intensidade): - Iônica (indesejáveis) - Ponte de Hidrogênio - Van der Waals Dipolo – dipolo Dipolo – dipolo induzido ORDEM DE ELUIÇÃO (crescente) APOLAR → POLAR SOLVENTES MAIS COMUNS: -Hexanos (éter de petróleo pe 60-80o C) - AcoEt ou acetona - Et2O ou MTBE - i-PrOH ou MeOH - CHCl3 ou CH2Cl2 (DCM) S i O S i N S i O S i N H2 S i O S i OH OH CN, Cianopropil NH2, Propilamino Diol
Fase Ligada Amino (NH2) AMOSTRA: ESTERÓIDES O O CH3 CH3 OH 1. Desoxicorticosterona O O OH CH3 CH3 OH 2. Desoxicortisona O O CH3 OH CH3 OH 3. Corticosterona O O O OH CH3 CH3 OH 4. Cortisona O O OH CH3 OH CH3 OH 5. Hidrocortisona O O O OH CH3 CH3 OH 6. Prednisona FM quaternária MTBE 40% DCM 15% CHCL3 42% MeOH 3% COLUNA: Zorbax-NH2 10 µm 250 x 4,6 mm Fluxo 3,0 mL/min Detetor UV 254 nm 1 2 3 6 4 5
Fase Ligada Amino (NH2) Aplicação: análise de monossacarídeos – FASE NORMAL Coluna: Hypersil 5 APS 100 x 3,0 mm FM: ACN/Água 80:20 Fluxo: 0,5 mL/min Detector: RI O OHOH OH OH CH3 O OHOH OHOH O OH OH OHOH O OH OH OH OH O OH OH OH OH OH O OH OH OH OH OH O O O OH OH OH OH OH OH OH OH O O O OH OH OHOH OH OH OHOH O O O OH OH OHOH OH OH OHOH H H 1. Raminose 2. Ribose 3. Xilose 4. Arabinose 5. Frutose 6. Glicose 7. Sacarose 8. Maltose 9. Lactose
Aplicação: análise de monossacarídeos – FASE NORMAL Amostra: suco de frutas (tomate, uva, framboesa, etc) O OH OH OHOH 1. Xilose O OH OH OH OH OH 2. Frutose O OH OH OH OH OH 3. Glicose O O O OH OH OH OH OH OH OH OH 4. Sacarose O O O OH OH OHOH OH OH OHOH 5. Maltose Coluna: Hypersil 5 APS 100 x 3,0 mm FM: ACN/Água 80:20 Fluxo: 0,5 mL/min Detector: RI
Otimizando a Resolução 2.2 Cromatografia de Fase Reversa (FR) FE menos polar que FM. Superfície da FE é apolar. CH3 Si O Si O Si O Si O CH3 CH3 OH CH3 OH O CH3 CH3 CH3 CH3 ADSORVENTES p/ FR (exemplos): Si O Si Si O Si Si O Si Si O Si ODS, RP-18, C-18 RP-8, C-8 Fenil TMS, C-1 SOLVENTES MAIS COMUNS: - Água - Acetonitrila (ACN) - MeOH - Tetraidrofurano (THF)
Otimizando a Resolução 2.2 Cromatografia de Fase Reversa (FR) FE menos polar que FM. ORDEM DE ELUIÇÃO (crescente) POLAR → APOLAR Superfície da FE é apolar. CH3 Si O Si O Si O Si O CH3 CH3 OH CH3 OH O CH3 CH3 CH3 CH3 Interações ANALITO X FE e FM X FM (em ordem decrescente de intensidade): Van der Waals Dipolo – dipolo Dipolo – dipolo induzido Dipolo induzido – dipolo induzido Interações residuais: pte. H
Vantagens:Vantagens: - Equilíbrio mais rápido - Menor adsorção irreversível - Água não influi na reprodutibilidade - Sítios de adsorção mais homogêneos - Eluição em gradiente facilitada Otimizando a Resolução 2.2 Cromatografia de Fase Reversa (FR) FE menos polar que FM. Coluna Fase Reversa C18: Aplicação quase universal (~ 70% das aplicações na literatura) Permite análise desde substâncias hidrossolúveis e/ou iônicas até substâncias lipofílicas (NARP).
Supressão da Ionização Coluna: µBONDAPAK C18 30 cm X 3,9 mm FM: Água, com 5% HOAc Detecção: UV 254nm Tempo: 30 min. R-COOH R-COO- + H+ pKa 4-5 Φ-OH Φ-O- + H+ pKa 10-12 OHO HO OH OH OHO OH OH OHO OH OHO OH OH O OHO OH OH O OH OH OH O OH O OH HO OH OH OH 1. Ácido gálico 2. Ác. protocatecuico 3. Ác. p-OH-benzóico 6. Ác. salicílico 5. Ác. cafeico 7. Ác. p-coumárico 8. Ác. o-coumárico 9. Ác. ferúlico 10. Ác. cinâmico O OH OH OMe 4. d-CatequinaAmostra: Ácidos Carboxílicos Fenólicos
O N CH3 CH3 N NH CH3 N CH3 CH3 CH4 N N CH3 CH3 CH3 1 2 3 4 Coluna: Zorbax ODS 5µm, 150 x 0,46 mm FM: ACN/Tampão 30:70 + 0,2% TEA e 0,2% TFA Tampão Fosfato 25 mM pH 2,5 Fluxo: 1,0 mL/min Detector: UV C18 Aplicação: antidepressivos tricíclicos – FASE REVERSA
C18 Coluna: Inertisil ODS 250 x 4,6 mm FM: MeOH a 1,0 mL/min Detector: UV (λe: 295 nm) Coluna: Inertisil ODS 250 x 4,6 mm FM: MeOH a 1,0 mL/min Detector: UV (λe: 295 nm) O CH3 CH3 CH3 OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 3. α-tocoferol (vitamina E) O CH3 CH3 CH3 OH CH3 CH3 CH3 CH3 2. β-tocoferol O CH3 CH3 CH3 OH CH3 CH3 CH3 1. δ-tocoferol O CH3 CH3 CH3 O CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 O 4. Vitamina E - acetato Aplicação: análise de tocoferóis – FASE REVERSA
Coluna: Inertisil 5 Si 150 x 4,6 mm FM: EtOH 0,3% em n-Hexano Fluxo: 1,0 mL/min Detector: FLU (λex: 300 nm; λem:330 nm) Aplicação: análise de tocoferóis em margarina – FASE NORMAL Sílica gel O CH3 CH3 CH3 OH CH3 CH3 CH3 CH3 O CH3 CH3 CH3 OH CH3 CH3 CH3 O CH3 CH3 CH3 OH CH3 CH3 CH3 CH3 O CH3 CH3 CH3 OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 1. α-tocoferol (vitamina E) 2. β-tocoferol 3. γ-tocoferol 4. δ-tocoferol
AMOSTRA Sol. em Água Insol. em Água Iônica ou Ionizável Não-iônica PM ≠ Sol. em solv. orgânico PM ≠ APOLAR* POLAR** FASE NORMAL FASE REVERSA GPC Iônica ou Ionizável Não-iônica GPC FASE REVERSA ÍON-PAR ou TROCA IÔNICA ÍON-PAR ou TROCA IÔNICA FASE REVERSA SUPRESSÃO SUPRESSÃO FASE NORMAL Sephadex C1 8 C8 C18 C8 CN Si CN NH2 C1 8 C8 C18 C8 CN Si CN NH2 C1 8 C8 Sephadex - LH20 CHAVE PARA ESCOLHACHAVE PARA ESCOLHA DO ADSORVENTE (FE)DO ADSORVENTE (FE) * Hexano, CHCl* Hexano, CHCl33 ** AcOEt, MeOH** AcOEt, MeOH
♦ Substâncias com grupos funcionais diferentes Valor de α maior em Sílica do que em C18 Valor de α menos distinto entre fases ligadas FN e FR ♦ Homólogos ou substâncias que diferem no no . de carbonos Valor de α maior em FR ♦ Isômeros Valor de α maior em FN Otimizando a Resolução 2.2 Fase Normal (FN) X Fase Reversa (FR)
Cromatografia em Fase NormalCromatografia em Fase Normal VANTAGENS DESVANTAGENS 1. Permite grandes variações na seletividade através da variação da composição da FM . 1. Amostras iônicas são mais facilmente separadas por RPC. 2. Colunas são muito estáveis em FM não aquosa 2. Controle da força de eluição da FM é mais difícil do que em RPC . 3. Muitas substâncias orgânicas são mais solúveis nos solventes de NPC (vantagem em Crom. Prep.) 3. Menor p. e. dos solventes usados na FM causam formação de bolhas. 4. Pressão necessária é menor devido menor viscosidade dos solventes. 4. Retenção pode variar em função de água adsorvida pela FE. 5. Útil para análise de amostras que podem decompor em soluções aquosas. 5. Eluição em gradiente limitada pelo “demixing” da FM e pela adsorção de água. 6. Adsorventes mais baratos. 6. Solventes mais caros. Descarte mais caro.
Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais MÉTODOS ANALÍTICOS EM QUÍMICA ORGÂNICA – II - CROMATOGRAFIA - Prof. Dr. Alberto J. Cavalheiro Ms. Tamara R. Calvo Instituto de Química de Araraquara – UNESP Departamento de Química Orgânica
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Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais O NO O O O O O CH3 CH3 CH3 CH3 H H 2 N O O O O CH3 CH3 CH3 CH3 3 N N N N O O CH3 CH3 CH3 4 O N O O CH3 CH3 H CH3 O 5 O N OO OO CH3 CH3CH3 6 O N OHOH CH3 H 7
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EXPLICAR MELHOR FR E FN AMPLIAR OS TIPOS DE COLUNAS EXPLICAR MELHOR MECANISMO DE RETENÇAO NOS VARIOS TIPOS DE FE

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Aula 01 introdução

  • 1.
    Núcleo de Bioensaios, Biossíntese eEcofisiologia de Produtos Naturais MÉTODOS ANALÍTICOS EM QUÍMICA ORGÂNICA – II - CROMATOGRAFIA - Prof. Dr. Alberto J. Cavalheiro Instituto de Química de Araraquara – UNESP Departamento de Química Orgânica
  • 2.
    Introdução às principais técnicascromatográficas utilizadas na análise qualitativa e/ou quantitativa de substâncias orgânicas em mistura, com ênfase em cromatografia líquida (CL). Objetivo
  • 3.
    Metodologia AULAS Expositivas Práticas AVALIAÇÕES (P) 2 Provasescritas (individuais) 45% (S) 2 Seminários (dupla) 30% (R) Relatórios das práticas (dupla) 20% (A) Avaliação de aproveitamento das aulas (“individual”) 5% Média = 0,45P + 0,3S + 0,2R + 0,05AMédia = 0,45P + 0,3S + 0,2R + 0,05A
  • 4.
    INTRODUÇÃO À CROMATOGRAFIA 1.Braithwaite, A. Chromatographic Methods, 4ª ed. 1985. 2. Scott, R. P. W. Techiques and practice of chromatography. v. 70, 1995. 3. Miller, J. M. Chromatography, 1988. 4. Poole, C. F. and Poole, S. K. Chromatography today. 1991. 5. Sewell, P. A. Chromatographic separactions, 1987. 6. Collins, H. C. Introdução a métodos cromatográficos. Ed. Unicamp. 7ª ed. 1995. CLAE Snyder, L. R., Kirkland, J. J., Glajch, J. L. Practical HPLC Method Development. 2a. Ed. John Wiley. 1997. Bibliografia
  • 5.
    Fase Extratora a +B A + b A + B Mistura HeterogêneaF1 F2 Mistura Homogênea (Amostra) a + b A + b a + B a + b A + b a + B n etapas [A]F2 [A]F1 KA= [B]F2 [B]F1 KB= Princípio Geral
  • 6.
    Técnica de análisede substâncias em mistura, que envolve a distribuição diferencial dessas substâncias em um sistema heterogêneo bifásico. SISTEMA CROMATOGRÁFICO: Heterogêneo e bifásico Fase Móvel (FM) Fase Estacionária (FE) Configuração gás (CG) sólido ou líquido coluna líquido (CL) sólido ou líquido coluna/planar Cromatografia CC = cromatografia em coluna CCD = cromatografia em camada delgada (planar)
  • 7.
    Técnica de análisede substâncias em mistura, que envolve a distribuição diferencial dessas substâncias em um sistema heterogêneo bifásico. Cromatografia Analítica: Análise qualitativa e/ou quantitativa de substâncias em mistura. Cromatografia Preparativa: Purificação de substâncias em mistura. Cromatografia
  • 8.
    Fase Extratora a +B A + b A + B Mistura HeterogêneaF1 F2 Mistura Homogênea (Amostra) a + b A + b a + B a + b A + b a + B n etapas [A]F2 [A]F1 KA= [B]F2 [B]F1 KB= Princípio Geral
  • 9.
    Cromatografia Processo dinâmico emque a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel. CC
  • 10.
    Processo dinâmico emque a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel. Cromatografia
  • 11.
    Processo dinâmico emque a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel. Cromatografia
  • 12.
    Processo dinâmico emque a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel. Cromatografia
  • 13.
    Processo dinâmico emque a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel. Cromatografia
  • 14.
    Processo dinâmico emque a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel. Cromatografia
  • 15.
    Processo dinâmico emque a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel. Cromatografia CC
  • 16.
    Processo dinâmico emque a separação cromatográfica é obtida a partir de interações diferenciais entre os analitos componentes da mistura, fase estacionária e fase móvel. Cromatografia Cromatograma Registro gráfico do processo cromatográfico Resolução (Rs) 21 12 ).(2 ww trtr Rs + − = CC
  • 17.
    Cromatograma t0 = momentoda aplicação da amostra na coluna tm = tempo morto tr = tempo de retenção w = largura do pico h = altura do pico
  • 18.
    AMOSTRAAMOSTRAAMOSTRAAMOSTRAAMOSTRAAMOSTRAAMOSTRAAMOSTRA Rf = d/D 1,00 0,00(ORIGEM) 0,73 0,36 0,08 D d 10,0 cm 7,3 cm 3,6 cm 0,8 cm Rf = fator de retenção D = distância percorrida pela FM D = distância percorrida pela mancha Origem = ponto de aplicação da amostra Cromatografia Cromatografia em Camada Delgada CCD ou TLC
  • 19.
    Adsorção Absorção Permeação (dissolução) Líquido/gássólido Líquido sólido + + + - - Líquido/gás líquido Líquido/gás gel/sólido INTERAÇÕES INTERMOLECULARES Iônicas Ponte de Hidrogênio van der Waals Keeson (dipolo/dipolo) Debye (dipolo/dipolo induzido) London (dipolo induzido/dipolo induzido) Mecanismos
  • 20.
    Antes 1965 -Colunas de vidro Partículas > 100 µm Fase Normal (silica, alumina, etc.) Amostras pouco polares Fluxo induzido por gravidade Tempo: horas - dias Detecção: off-line (UV, pH, gravimetria, etc) 1965 a 1970 - Partículas 30-50 µm Bombas para impulsionar FM Primeiros detetores on-line: IR, UV. Depois 1975 - Fase Reversa (C18, C8, C2, etc.) Compatibilidade com amostra biológicas polares Tempo: minutos Depois 1980- Automação completa CC - Instrumentação
  • 21.
    Micheal S. Tswett(ou Tsvett) Botânico Russo Pai da cromatografia 1906 - χρωµα γραφια croma grafia Separação de pigmentos vegetais Micheal S. Tswett (ou Tsvett) Botânico Russo Pai da cromatografia 1906 - χρωµα γραφια croma grafia Separação de pigmentos vegetais Kuhn, Wintertein e Lederer 1931 Reinvenção da técnica Separação de carotenóides e xantofilas A. J. P. Martin 1944 Cromatografia em papel Separação substâncias polares, como amino ácidos, carboidratos e pigmentos PRIMEIRAS APLICAÇÕES: ESTUDO DE METABÓLITOS VEGETAIS J. Chem. Ed. 1967, 44, 238.
  • 22.
    Cromatografia em ColunaAberta Algodão Disco de papel filtro Empacotamento: - Suspensão - Seco Análise das frações: - CCD 15 – 30 cm 60–200 µm Cromatografia
  • 23.
  • 24.
    CCD - Instrumentação Simplicidade Baixocusto Suporte sólido Adsorvente (FE) Espalhador Cuba Revelador
  • 25.
    CCD - Instrumentação Até31 canais diferentes (190-800 nm)
  • 26.
    Cromatograma t0 = momentoda aplicação da amostra na coluna tm = tempo morto tr = tempo de retenção w = largura do pico h = altura do pico
  • 27.
    Fluxo (F): vazãoda FM, geralmente em mL/min. Tempo morto (tm): tempo necessário para eluir uma substância que não interage com a FE. Volume morto (Vm): volume de FM necessário para preencher todos os interstícios e poros da FE, ou volume de FM necessário para eluir uma substância que não interage com a FE. tm = Vm/F Tempo de retenção (tR): tempo necessário para eluir uma substância de um determinado sistema cromatográfico. Volume de retenção (VR): volume de FM necessário para eluir uma substância de um determinado sistema cromatográfico. tR = VR/F DEFINIÇÕES Nomenclature for Chromatography. Pure & Appl. Chem. 65:819-872 (1993)
  • 28.
    )( )( .2 21 12 ww trtr Rs + − = Resolução (Rs) Indica aqualidade da separação entre duas bandas cromatográficas. Para resolução completa, Rs > 1,25
  • 29.
  • 30.
    Resolução (Rs) Fatores envolvidosna resolução cromatográfica: 2 2 1 2 .54,5ou.16         =      = w tr N w tr N N: Fator de eficiência Relação entre tempo de permanência do analito no sistema e alargamento da banda cromatográfica. Quanto mais difícil a separação (a pequeno), maior N necessário. k’: Fator de capacidade ou de retenção É a razão da distribuição do analito entre FE/FM Quanto maior, maior a afinidade do analito pela FE, em relação à FM. tm tmtr k n n k FM FE − == 'ou' 1 2 ' ' k k =α α: Fator de seletividade É a razão entre os fatores de retenção de dois analitos. Quanto maior, mais fácil a separação.
  • 31.
    N: Fator deeficiência (Pratos Teóricos) Relação entre tempo de permanência do analito no sistema e alargamento da banda cromatográfica. Quanto mais difícil a separação (a pequeno), maior N necessário. Ajustar através de: comprimento da coluna ou placa tamanho e forma da partícula fluxo da FM volume da amostra quantidade de amostra 2 2 1 2 .54,5 ou.16         =       = w tr N w tr N Resolução (Rs)
  • 32.
    k’: Fator decapacidade ou de retenção É a razão da distribuição do analito entre FE/FM Quanto maior k’, maior a afinidade do analito pela FE, em relação à FM. Ajustar através de: força de eluição da FM polaridade da FE tm tmtr k n n k FM FE − == 'ou' Resolução (Rs)
  • 33.
    α: Fator deseletividade É a razão entre os fatores de retenção de dois analitos. Quanto maior, mais fácil a separação. Ajustar através de : tipo de componente da FM tipo de FE 1 2 ' ' k k =α Resolução (Rs)
  • 34.
    )1'( ' . )1( . 4 2 2 + − = k kN Rs α α EFICIÊNCIA Depende da configuração dosistema SELETIVIDADE RETENÇÃO Dependem das características da FM e FE do sistema FATORES QUÍMICOS FATORES FÍSICOS Resolução (Rs)
  • 35.
    0 2 46 8 10 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 InfluêncianaResolução n N NRs ∝ 0 2 4 6 8 10 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 (α-1/α) α α α 1− ∝Rs 0 2 4 6 8 10 12 14 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 K'/(1+K') K' 1' ' + ∝ k k Rs )1'( ' . )1( . 4 2 2 + − = k kN Rs α α κ (RETENÇÃO) TEMPO (SELETIVIDADE) α N (EFICIÊNCIA) Resolução (Rs)
  • 36.
    Dificultar o espalhamentoda banda Aumentar a área da FE Diminuir volume da FM ↑ N Diminuir tamanho das partículas (mm) Partículas esféricas Aumentar comprimento da coluna (L) Otimizar fluxo da FM Otimizar temperatura Otimizando a Resolução 1. Eficiência (N) .16 2       = w tr N
  • 37.
    Coluna, tubulação, injetor,detetor ∑ 2 = Lh /σ µ µ C B Ah ++= A = Difusão de Eddy B = Difusão molecular na FM C = Efeitos da transferência de massas Otimizando a Resolução 1. Eficiência (N) Fatores que afetam o espalhamento da banda cromatográfica. h = N/L h: altura de um prato teórico ou
  • 38.
    d L N .4,0max = Comprimento grandecausa espalhamento e análise longa Partícula muito pequena necessita pressão muito alta 40 − 6 0 µm 5 µm DIÂMETRO PARTÍCULA L=15cm L=25 cm 60 − 200 µm (130 µm) ⇒ 460 770 40 - 60 µm (50 µm ) ⇒ 1.200 2.000 20 µm ⇒ 3.000 5.000 10 µm ⇒ 6.000 10.000 5 µm ⇒ 12.000 20.000 3 µm ⇒ 20.000 33.300 1. Eficiência (N) Fatores que afetam o espalhamento da banda cromatográfica. Otimizando a Resolução
  • 39.
    Coluna, tubulação, injetor,detetor ∑ 2 = Lh /σ µ µ C B Ah ++= A = Difusão de Eddy B = Difusão molecular na FM C = Efeitos da transferência de massas 1. Eficiência (N) Fatores que afetam o espalhamento da banda cromatográfica. h = N/Lou Otimizando a Resolução
  • 40.
    Coluna, tubulação, injetor,detetor ∑ 2 = Lh /σ µ µ C B Ah ++= A = Difusão de Eddy B = Difusão molecular na FM C = Efeitos da transferência de massas 1. Eficiência (N) Fatores que afetam o espalhamento da banda cromatográfica. h = N/Lou Otimizando a Resolução
  • 41.
    µ µ C B Ah ++= Equação devan Demmter A = Difusão de Eddy B = Difusão molecular na FM C = Efeitos da transferência de massas mt L =µ F V t m m = L V F m .µ= 1. Eficiência (N) Fatores que afetam o espalhamento da banda cromatográfica. Otimizando a Resolução
  • 42.
    Otimizando a Resolução 2.Retenção (k’) e Seletividade (α) Fatores que afetam a interação relativa entre analitos e fase estacionária (FE) e fase móvel (FM). Para otimizar esses fatores, é preciso conhecer as características dessas duas fases e a maneira como os analitos interagem com elas: FASE ESTACIONÁRIA FASE NORMAL FASE REVERSA FASE MÓVEL SOLVENTES, características e compatibilidade FORÇA DE ELUIÇÃO
  • 43.
    Otimizando a Resolução 2.1Cromatografia de Fase Normal (FN) FE mais polar que FM. Interações ANALITO X FE e FM X FM (em ordem decrescente de intensidade): - Iônica (indesejáveis) - Ponte de Hidrogênio - Van der Waals Dipolo – dipolo Dipolo – dipolo induzido ADSORVENTES p/ FN (exemplos): -Sílica -Alumina -Poliamida -Fases ligadas polares (CN, NH2, Diol) Superfície da FE é polar.
  • 44.
    Otimizando a Resolução 2.1Cromatografia de Fase Normal (FN) FE mais polar que FM. ORDEM DE ELUIÇÃO (crescente) APOLAR → POLAR SOLVENTES MAIS COMUNS: - Hexanos (éter de petróleo pe 60-80o C) - AcoEt ou acetona - Et2O ou MTBE - i-PrOH ou MeOH - CHCl3 ou CH2Cl2 (DCM) Superfície da FE é polar.
  • 45.
    Sílica gel Si O OH O OH Si O CH 3 Si O CH 3 C H 3 Si O OH C H 3 Si O H CH 3 CH 3 O H SiH 3 O H H O H H Otimizando a Resolução Mecanismo de adsorção: -Si-OH: Interações polares por ponte de hidrogênio, como doador ou aceptor de H. -Si-OH e –Si-O-Si-: dipolo/dipolo ou dipolo/dipolo induzido Esféricas Irregulares Diâmetro: 3 a 200 µm Poro: 60 a 120Å Partículas
  • 46.
    Sílica gel Si O OH O OH Si O CH 3 Si O CH 3 C H 3 Si O OH C H 3 Si O H CH 3 CH 3 O H SiH 3 O H H O H H Otimizando a Resolução Vantagens: • Elevada resistência mecânica • Grande porosidade e área superficial • Gel duro (intumescimento não varia em função do solvente). Esféricas Irregulares Diâmetro: 3 a 200 µm Poro: 60 a 120Å Partículas PAREI AQUI
  • 47.
    Sílica gel Si O OH O OH Si O CH 3 Si O CH 3 C H 3 Si O OH C H 3 Si O H CH 3 CH 3 O H SiH 3 O H H O H H Otimizando a Resolução Influência do teor de água da FM sobre a eficiência (H) e retenção (k’). FE: Sílica FM: DCM Amostra: Fenilpropanol Desvantagens: • Difícil controle da atividade de água • Forte adsorção de substâncias polares • Forte adsorção de substâncias básicas • Limite operacional de pH (2 a 8) • Sítios com energia de adsorção diferentes.
  • 48.
    Otimizando a Resolução AluminaAtividade: capacidade de adsorção em função do teor de água adsorvida Atividade, segundo escala de Brockmann & Schadder Ativ. % de água Alumina Sílica I - - II 3 10 III 6 12 IV 10 15 V 15 20 O Al AlO ClAlCH3 Cl CH3 Cl ÁCIDA pH 4,0 O Al AlO ONaAlCH3 ONa CH3 ONa BÁSICA pH 9,0 O Al 2+ AlO AlCH3 O NEUTRA pH 7,0 CLAE CCD Alumina 1100 C4000 C II ou IIII
  • 49.
    Otimizando a Resolução Alumina OAl AlO ClAlCH3 Cl CH3 Cl ÁCIDA pH 4,0 O Al AlO ONaAlCH3 ONa CH3 ONa BÁSICA pH 9,0 O Al 2+ AlO AlCH3 O NEUTRA pH 7,0 Mecanismo de adsorção: Al3+ : campo positivo favorece interação com moléculas polarizáveis (p. ex. sistemas conjugados) O2- : sítios básicos favorecem a interação com doadores de H+ Vantagens: • Elevada resistência mecânica • Faixa operacional de pH maior (2 a 12) • Gel duro (intumescimento não varia em função do solvente). • Retenção menos pronunciada de substâncias básicas.
  • 50.
    Otimizando a Resolução Alumina OAl AlO ClAlCH3 Cl CH3 Cl ÁCIDA pH 4,0 O Al AlO ONaAlCH3 ONa CH3 ONa BÁSICA pH 9,0 O Al 2+ AlO AlCH3 O NEUTRA pH 7,0 Desvantagens (em relação à Sílica): • Catalisa reações (p. ex. aldólicas) • Partículas irregulares e maiores (↓ N) • Menor reprodutibilidade • Retenção pronunciada de substâncias ácidas (p. ex. ác. carboxilicos).
  • 51.
    Otimizando a Resolução Alumina OAl AlO ClAlCH3 Cl CH3 Cl ÁCIDA pH 4,0 O Al AlO ONaAlCH3 ONa CH3 ONa BÁSICA pH 9,0 O Al 2+ AlO AlCH3 O NEUTRA pH 7,0 Aplicações: • Análises em condições mais básicas que as suportadas por sílica (> 9); • Poliaromáticos, alcalóides, aminas e vitaminas lipossolúveis.
  • 52.
    Otimizando a Resolução EsféricasIrregulares Diâmetro: 3 a 200 µm Poro: 60 a 120Å Partículas Fases Ligadas (BPC) Si O OH O O H Si O CH 3 Si O CH 3 C H 3 Si O OH C H 3 Si O H CH 3 CH 3 O H SiH 3 O H H O H H Si R CH3 Cl CH3 + Sílica
  • 53.
    Otimizando a Resolução EsféricasIrregulares Diâmetro: 3 a 200 µm Poro: 60 a 120Å Partículas Fases Ligadas (BPC) Si O OH O O Si O CH 3 Si O CH 3 C H 3 Si O O C H 3 Si O H CH 3 CH 3 O H SiH 3 Si R CH3H3C Si R CH3H3C SILANOL RESIDUAL Si O Si Si O Si Si O Si Si O Si Si O Si N Si O Si NH2 Si O Si OH OH ODS, RP-18, C-18 RP-8, C-8 Fenil CN, Cianopropil NH2,Propilamino TMS, C-1 Diol APOLARES POLARES Si CH3 CH3 Cl CH3 + Cloreto de trimetilsilano Fase ligada
  • 54.
    Otimizando a Resolução EsféricasIrregulares Diâmetro: 3 a 200 µm Poro: 60 a 120Å Partículas Fases Ligadas (BPC) Si O Si Si O Si Si O Si Si O Si Si O Si N Si O Si NH2 Si O Si OH OH ODS, RP-18, C-18 RP-8, C-8 Fenil CN, Cianopropil NH2,Propilamino TMS, C-1 Diol APOLARES POLARES Si O OH O O Si O CH 3 Si O CH 3 C H 3 Si O O C H 3 Si O CH 3 CH 3 O H SiH 3 Si R CH3H3C Si R CH3H3C Si CH3 CH3 CH3 Fase ligada capeada
  • 55.
    Otimizando a Resolução FasesLigadas (BPC) Si O OH O O Si O CH 3 Si O CH 3 C H 3 Si O O C H 3 Si O CH 3 CH 3 O H SiH 3 Si R CH3H3C Si R CH3H3C Si CH3 CH3 CH3 Fase ligada capeada Vantagens:Vantagens: - Equilíbrio mais rápido - Menor adsorção irreversível - Água não influi na reprodutibilidade - Sítios de adsorção mais homogêneos - Eluição em gradiente facilitada Esféricas Irregulares Diâmetro: 3 a 200 µm Poro: 60 a 120Å Partículas
  • 56.
    Fases Ligadas (BPC) CH3 CH3 CH3 TOLUENO NAFTALENO BIFENILA ACENAFTENO 2,3-DIMETILNAFTALENO COLUNA100 x 8 mm Fluxo: 2,0 mL/min Detetor UV 254 nm C18 – 10% carbono Esférica – 5 µm Não capeada C18 – 7% carbono Esférica – 5 µm Capeada C18 – 10% carbono Irregular – 10 µm Não capeada C8 5% carbono CN 2% carbono Fenil 5% carbono Para amostra APOLAR ↓ Polaridade da FE, ↓ retenção dos analitos FM: ACN/Água 70:30
  • 57.
    Otimizando a Resolução FasesLigadas Polares - FN Interações ANALITO X FE e FM X FM (em ordem decrescente de intensidade): - Iônica (indesejáveis) - Ponte de Hidrogênio - Van der Waals Dipolo – dipolo Dipolo – dipolo induzido ORDEM DE ELUIÇÃO (crescente) APOLAR → POLAR SOLVENTES MAIS COMUNS: -Hexanos (éter de petróleo pe 60-80o C) - AcoEt ou acetona - Et2O ou MTBE - i-PrOH ou MeOH - CHCl3 ou CH2Cl2 (DCM) S i O S i N S i O S i N H2 S i O S i OH OH CN, Cianopropil NH2, Propilamino Diol
  • 58.
    Fase Ligada Amino(NH2) AMOSTRA: ESTERÓIDES O O CH3 CH3 OH 1. Desoxicorticosterona O O OH CH3 CH3 OH 2. Desoxicortisona O O CH3 OH CH3 OH 3. Corticosterona O O O OH CH3 CH3 OH 4. Cortisona O O OH CH3 OH CH3 OH 5. Hidrocortisona O O O OH CH3 CH3 OH 6. Prednisona FM quaternária MTBE 40% DCM 15% CHCL3 42% MeOH 3% COLUNA: Zorbax-NH2 10 µm 250 x 4,6 mm Fluxo 3,0 mL/min Detetor UV 254 nm 1 2 3 6 4 5
  • 59.
    Fase Ligada Amino(NH2) Aplicação: análise de monossacarídeos – FASE NORMAL Coluna: Hypersil 5 APS 100 x 3,0 mm FM: ACN/Água 80:20 Fluxo: 0,5 mL/min Detector: RI O OHOH OH OH CH3 O OHOH OHOH O OH OH OHOH O OH OH OH OH O OH OH OH OH OH O OH OH OH OH OH O O O OH OH OH OH OH OH OH OH O O O OH OH OHOH OH OH OHOH O O O OH OH OHOH OH OH OHOH H H 1. Raminose 2. Ribose 3. Xilose 4. Arabinose 5. Frutose 6. Glicose 7. Sacarose 8. Maltose 9. Lactose
  • 60.
    Aplicação: análise demonossacarídeos – FASE NORMAL Amostra: suco de frutas (tomate, uva, framboesa, etc) O OH OH OHOH 1. Xilose O OH OH OH OH OH 2. Frutose O OH OH OH OH OH 3. Glicose O O O OH OH OH OH OH OH OH OH 4. Sacarose O O O OH OH OHOH OH OH OHOH 5. Maltose Coluna: Hypersil 5 APS 100 x 3,0 mm FM: ACN/Água 80:20 Fluxo: 0,5 mL/min Detector: RI
  • 61.
    Otimizando a Resolução 2.2Cromatografia de Fase Reversa (FR) FE menos polar que FM. Superfície da FE é apolar. CH3 Si O Si O Si O Si O CH3 CH3 OH CH3 OH O CH3 CH3 CH3 CH3 ADSORVENTES p/ FR (exemplos): Si O Si Si O Si Si O Si Si O Si ODS, RP-18, C-18 RP-8, C-8 Fenil TMS, C-1 SOLVENTES MAIS COMUNS: - Água - Acetonitrila (ACN) - MeOH - Tetraidrofurano (THF)
  • 62.
    Otimizando a Resolução 2.2Cromatografia de Fase Reversa (FR) FE menos polar que FM. ORDEM DE ELUIÇÃO (crescente) POLAR → APOLAR Superfície da FE é apolar. CH3 Si O Si O Si O Si O CH3 CH3 OH CH3 OH O CH3 CH3 CH3 CH3 Interações ANALITO X FE e FM X FM (em ordem decrescente de intensidade): Van der Waals Dipolo – dipolo Dipolo – dipolo induzido Dipolo induzido – dipolo induzido Interações residuais: pte. H
  • 63.
    Vantagens:Vantagens: - Equilíbrio maisrápido - Menor adsorção irreversível - Água não influi na reprodutibilidade - Sítios de adsorção mais homogêneos - Eluição em gradiente facilitada Otimizando a Resolução 2.2 Cromatografia de Fase Reversa (FR) FE menos polar que FM. Coluna Fase Reversa C18: Aplicação quase universal (~ 70% das aplicações na literatura) Permite análise desde substâncias hidrossolúveis e/ou iônicas até substâncias lipofílicas (NARP).
  • 64.
    Supressão da Ionização Coluna:µBONDAPAK C18 30 cm X 3,9 mm FM: Água, com 5% HOAc Detecção: UV 254nm Tempo: 30 min. R-COOH R-COO- + H+ pKa 4-5 Φ-OH Φ-O- + H+ pKa 10-12 OHO HO OH OH OHO OH OH OHO OH OHO OH OH O OHO OH OH O OH OH OH O OH O OH HO OH OH OH 1. Ácido gálico 2. Ác. protocatecuico 3. Ác. p-OH-benzóico 6. Ác. salicílico 5. Ác. cafeico 7. Ác. p-coumárico 8. Ác. o-coumárico 9. Ác. ferúlico 10. Ác. cinâmico O OH OH OMe 4. d-CatequinaAmostra: Ácidos Carboxílicos Fenólicos
  • 65.
    O N CH3 CH3 N NH CH3 N CH3 CH3 CH4 N N CH3 CH3 CH3 1 2 3 4 Coluna:Zorbax ODS 5µm, 150 x 0,46 mm FM: ACN/Tampão 30:70 + 0,2% TEA e 0,2% TFA Tampão Fosfato 25 mM pH 2,5 Fluxo: 1,0 mL/min Detector: UV C18 Aplicação: antidepressivos tricíclicos – FASE REVERSA
  • 66.
    C18 Coluna: Inertisil ODS250 x 4,6 mm FM: MeOH a 1,0 mL/min Detector: UV (λe: 295 nm) Coluna: Inertisil ODS 250 x 4,6 mm FM: MeOH a 1,0 mL/min Detector: UV (λe: 295 nm) O CH3 CH3 CH3 OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 3. α-tocoferol (vitamina E) O CH3 CH3 CH3 OH CH3 CH3 CH3 CH3 2. β-tocoferol O CH3 CH3 CH3 OH CH3 CH3 CH3 1. δ-tocoferol O CH3 CH3 CH3 O CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 O 4. Vitamina E - acetato Aplicação: análise de tocoferóis – FASE REVERSA
  • 67.
    Coluna: Inertisil 5Si 150 x 4,6 mm FM: EtOH 0,3% em n-Hexano Fluxo: 1,0 mL/min Detector: FLU (λex: 300 nm; λem:330 nm) Aplicação: análise de tocoferóis em margarina – FASE NORMAL Sílica gel O CH3 CH3 CH3 OH CH3 CH3 CH3 CH3 O CH3 CH3 CH3 OH CH3 CH3 CH3 O CH3 CH3 CH3 OH CH3 CH3 CH3 CH3 O CH3 CH3 CH3 OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 1. α-tocoferol (vitamina E) 2. β-tocoferol 3. γ-tocoferol 4. δ-tocoferol
  • 68.
    AMOSTRA Sol. em Água Insol.em Água Iônica ou Ionizável Não-iônica PM ≠ Sol. em solv. orgânico PM ≠ APOLAR* POLAR** FASE NORMAL FASE REVERSA GPC Iônica ou Ionizável Não-iônica GPC FASE REVERSA ÍON-PAR ou TROCA IÔNICA ÍON-PAR ou TROCA IÔNICA FASE REVERSA SUPRESSÃO SUPRESSÃO FASE NORMAL Sephadex C1 8 C8 C18 C8 CN Si CN NH2 C1 8 C8 C18 C8 CN Si CN NH2 C1 8 C8 Sephadex - LH20 CHAVE PARA ESCOLHACHAVE PARA ESCOLHA DO ADSORVENTE (FE)DO ADSORVENTE (FE) * Hexano, CHCl* Hexano, CHCl33 ** AcOEt, MeOH** AcOEt, MeOH
  • 69.
    ♦ Substâncias comgrupos funcionais diferentes Valor de α maior em Sílica do que em C18 Valor de α menos distinto entre fases ligadas FN e FR ♦ Homólogos ou substâncias que diferem no no . de carbonos Valor de α maior em FR ♦ Isômeros Valor de α maior em FN Otimizando a Resolução 2.2 Fase Normal (FN) X Fase Reversa (FR)
  • 70.
    Cromatografia em FaseNormalCromatografia em Fase Normal VANTAGENS DESVANTAGENS 1. Permite grandes variações na seletividade através da variação da composição da FM . 1. Amostras iônicas são mais facilmente separadas por RPC. 2. Colunas são muito estáveis em FM não aquosa 2. Controle da força de eluição da FM é mais difícil do que em RPC . 3. Muitas substâncias orgânicas são mais solúveis nos solventes de NPC (vantagem em Crom. Prep.) 3. Menor p. e. dos solventes usados na FM causam formação de bolhas. 4. Pressão necessária é menor devido menor viscosidade dos solventes. 4. Retenção pode variar em função de água adsorvida pela FE. 5. Útil para análise de amostras que podem decompor em soluções aquosas. 5. Eluição em gradiente limitada pelo “demixing” da FM e pela adsorção de água. 6. Adsorventes mais baratos. 6. Solventes mais caros. Descarte mais caro.
  • 71.
    Núcleo de Bioensaios, Biossíntese eEcofisiologia de Produtos Naturais MÉTODOS ANALÍTICOS EM QUÍMICA ORGÂNICA – II - CROMATOGRAFIA - Prof. Dr. Alberto J. Cavalheiro Ms. Tamara R. Calvo Instituto de Química de Araraquara – UNESP Departamento de Química Orgânica
  • 78.
    Núcleo de Bioensaios, Biossíntese eEcofisiologia de Produtos Naturais
  • 79.
    Núcleo de Bioensaios, Biossíntese eEcofisiologia de Produtos Naturais
  • 80.
    Núcleo de Bioensaios, Biossíntese eEcofisiologia de Produtos Naturais
  • 81.
    Núcleo de Bioensaios, Biossíntese eEcofisiologia de Produtos Naturais
  • 82.
    Núcleo de Bioensaios, Biossíntese eEcofisiologia de Produtos Naturais O NO O O O O O CH3 CH3 CH3 CH3 H H 2 N O O O O CH3 CH3 CH3 CH3 3 N N N N O O CH3 CH3 CH3 4 O N O O CH3 CH3 H CH3 O 5 O N OO OO CH3 CH3CH3 6 O N OHOH CH3 H 7
  • 83.
    Núcleo de Bioensaios, Biossíntese eEcofisiologia de Produtos Naturais
  • 84.
    Núcleo de Bioensaios, Biossíntese eEcofisiologia de Produtos Naturais
  • 85.
    Núcleo de Bioensaios, Biossíntese eEcofisiologia de Produtos Naturais
  • 86.
    Núcleo de Bioensaios, Biossíntese eEcofisiologia de Produtos Naturais
  • 87.
    Núcleo de Bioensaios, Biossíntese eEcofisiologia de Produtos Naturais
  • 88.
    Núcleo de Bioensaios, Biossíntese eEcofisiologia de Produtos Naturais
  • 89.
    Núcleo de Bioensaios, Biossíntese eEcofisiologia de Produtos Naturais
  • 90.
    Núcleo de Bioensaios, Biossíntese eEcofisiologia de Produtos Naturais
  • 91.
    Núcleo de Bioensaios, Biossíntese eEcofisiologia de Produtos Naturais
  • 92.
    EXPLICAR MELHOR FRE FN AMPLIAR OS TIPOS DE COLUNAS EXPLICAR MELHOR MECANISMO DE RETENÇAO NOS VARIOS TIPOS DE FE

Notas do Editor

  • #2 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #3 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #4 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #5 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #6 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #7 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #8 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #9 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #10 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #11 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #12 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #13 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
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  • #15 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #16 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #17 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #18 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #19 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #20 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #21 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #22 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #23 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #24 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #25 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #26 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #27 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #28 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #29 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #30 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #31 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #32 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #33 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #34 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #35 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
  • #36 This presentation is all about our research on Cryptocarya moschata, conducted in Nucleus of Bioassays, Biosynthesis and Ecophysiology of Natural Products (NuBBE), in Chemistry Institute of Araraquara, Brazil. It’s part of pH. D. program of my student Claudia J. Nehme.
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