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UNIJUI – UNIVERSIDADE REGIONAL DO NOROESTE DO ESTADO DO RS
DBQ – DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA E QUÍMICA
CURSO - QUÍMICA INDUSTRIAL DE ALIMENTOS
INDICE
APRESENTAÇÃO........................................................................................................................... 1
INTRODUÇÃO A TECNOLOGIA DE FERMENTAÇÕES........................................................... 2
MICROORGANISMOS DE USO INDUSTRIAL ....................................................................... 9
ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTO, MEIOS DE CULTURA E AR..................................... 18
CRESCIMENTO CELULAR ........................................................................................................... 27
CLASSIFICAÇÃO DOS PROCESSOS............................................................................................37
EMPREGO DE CULTIVOS INICIADORES – STARTERS........................................................... 40
SISTEMAS DE FERMENTAÇÃO.................................................................................................. 48
INTRODUÇÃO AO ESTUDO DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA........................................... 54
SEPARAÇÃO DOS PRODUTOS DE FERMENTAÇÃO.............................................................. 66
SEPARAÇÃO DOS PRODUTOS OBTIDOS POR FERMENTAÇÃO COM LEVEDURAS....... 73
PRODUTOS OBTIDOS POR FERMENTAÇÃO COM BACTÉRIAS.......................................... 77
DIGESTÃO ANAERÓBICA (FERMENTAÇÃO METANOGÊNICA)......................................... 79
TECNOLOGIA DE PRODUÇÃO E UTILIZAÇÃO DE ENZIMAS.............................................. 89
Prof. Raul Vicenzi 1
APRESENTAÇÃO
A Biotecnologia é um ramo muito amplo da Tecnologia que se ocupa da
transformação ou tratamento de materiais de origem biológica. Spinks (1980) define
Biotecnologia como a utilização de organismos vivos ou sistemas biológicos para a
produção industrial e seu uso em serviços de saneamento.
A tendência atual de incluir no termo Biotecnologia, em seu aspecto mais
essencial, a Microbiologia Industrial, que trata do aproveitamento dos microrganismos
como agentes de degradação e síntese. Por semelhança dos conceitos fundamentais
que regem o tratamento biológico de efluentes, o cultivo de células animais e vegetais
e a produção de certos medicamentos. Assim, também devido ao seu amplo
significado, pode englobar também aspecto igualmente importante da Ciência,
Tecnologia e Engenharia de Alimentos.
De certa forma, os processos de fermentação representa uma elo que liga as
antigas artes de elaboração de alimentos (queijo, vinho, ...), mediante o uso de uma
flora microbiana natural com a moderna industria de fermentação de alimentos que
utilizava cultivos puros e sofisticados equipamentos de controle do processo. A
produção em larga escala de proteínas de organismos unicelulares, produção de
antibióticos, produção de células animais e vegetais e a produção compostos químicos
a partir de matérias-primas renováveis em substituição aos combustíveis fósseis, são
exemplos de outras áreas onde os processos fermentativos podem ser utilizados.
O componente curricular Biotecnologia de Alimentos pretende tem como
objetivo principal estudar alguns elementos essenciais e básicos dos processos
fermentativos: introdução a microbiologia industrial, sistemas de fermentações,
desenho de fermentadores, cinética de crescimento, metabolismo microbiano,
esterilização na indústria fementativa, produção de enzimas, cultivos starters.
Objetiva, também, abordar de forma mais detalhada alguns tipos de fermentação:
alcoólica, láctica, acética, metanogênica.
Introdução à biotecnologia de alimentos
Prof. Raul Vicenzi 2
INTRODUÇÃO A TECNOLOGIA DE FERMENTAÇÕES
O termo Fermentação deriva do latim fervere (ferver), devido ao aparecimento das bolhas
devido a produção de dióxido de carbono pela ação das leveduras sobre o extrato de frutas ou grãos
de malte;
⇒ Significado bioquímico: relata a geração de energia pelo catabolismo de compostos orgânicos;
⇒ Produção de vinho: 10.000 a.C. - provavelmente o vinagre foi descoberto na mesma época e as
bebidas alcoólicas destiladas surgiram a mais de 10.000 a.C. na China;
⇒ Cerveja: 5000 - 6000 a.C. - egípcios deixavam a cevada germinar em potes de barro, após
estrusavam e amassavam os grãos lavando-os após para obter a bebida, ainda, utilizavam as
leveduras da cerveja produzir CO2 para o crescimento de pães;
⇒ Leite e derivados lácteos: dados apontam que em 5000 a.C. se observou que o leite quando
retido no estômago de terneiros jovens coagulava-se (ação enzimática);
⇒ Produtos cárneos: conforme Erichsen (1983), cerca de 1500 a.C. o homem já sabia que a carne
finamente triturada e misturada com sal e especiarias poderia ser preservada, esta carne era seca
e enrolada (rolos) mantendo suas principais qualidades, como um flavor agradável
Este produto foi o precursor da lingüiça fermentada produzida atualmente.
O nome salame provém da cidade de Salamis, destruída a mais de 2000
anos, situada na costa oeste da ilha Grega de Cypros.
Exame microscópico do sedimento de cerveja escavado de urnas que datam de 3400 a 1440
a.C. demonstram claramente que na maioria das vezes continham leveduras, observando-se uma
pureza maior nos sedimentos mais recentes.
A necessidade de preservar a carne da caça e de animais domésticos abatidos durante o
inverno e consumidos no verão (summer sausage), fizeram com que o homem procurasse soluções
para a preservação do produto.
Assim, os produtos cárneos fermentados tornaram-se de grande importância no mercado
alimentar permitindo preservar a carne e atribuir a ela sabor e aroma característicos da tecnologia
usada.
Ø Antonie van Leeuwenhoek, um pioneiro no uso do microscópio, foi o primeiro a examinar em
1680 gotas de cerveja fermentada. Entretanto esta descoberta foi esquecida......
Ø 1856-1857: Louis Pasteur, após investigações detalhadas sobre as leveduras da cerveja e do
vinho, concluiu finalmente que leveduras vivas fermentavam o açúcar em etanol e CO2 quando em
anaerobiose.
Ø Pateur também observou muitas outras fermentações: Ex.: observou provavelmente um
Penicillium que fermentava D-tartarato de amônio em uma mistura racêmica de D e L-tartarato
(tartarato de Na, K);
Ø Observou também como uns microrganismos cilíndricos produziam ácido butírico somente em
condições anaeróbias e investigou a produção de ácido acético por fermentação;
Ø 1870 - Pasteur e outros pesquisadores observaram os efeitos antagonistas de um microrganismo
frente a outros e previram suas aplicações terapêuticas;
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Ø 1881 - Robert Kock estudou e desenvolveu técnicas de cultivo puro assim como outros métodos
bacteriológicos clássicos utilizados até hoje;
Ø Dois elementos vitais deram inicio a era moderna da tecnologia de fermentações industriais:
• Emprego de fungos e leveduras na modificação de alimentos e bebidas e os estudos
microbiológicos pioneiros de Pasteur e Kock.
Ø Desenvolvimento de fermentações em superfície ou semi-sólidas surgiu com o desenvolvimento
de alimentos orientais e durante as grandes navegações;
• Capacidade hidrolítica de determinados fungos em hidrolisar o amido e proteínas na produção
de molho de soja, este foi o inicio das fermentações industriais.
Ø Cultivo de algas e fungos deu inicio ao processo industrial de obtenção de proteínas alimentícias
microbianas (SCP - proteínas de organismos unicelulares) e de inóculos de microrganismos
Ø Produção de vinagre e os estudos de Pasteur sobre a produção de ácidos prepararam o caminho
para o desenvolvimento de fermentações que produzissem ácidos orgânicos;
Ø O desenvolvimento da metodologia de cultivos puros por Kock proporcionou o surgimento de
técnicas que permitiram estudar as aplicações industriais de espécies microbianas individuais,
iniciando-se o emprego de cultivos puros, meios esterilizados e condições assépticas nas
fermentações industriais.
FERMENTAÇÃO DE ALIMENTOS
Fermentação de pão, queijo e cerveja bem como bebidas alcoólicas desenvolveram-se para
satisfazer as exigências comerciais modernas de produção em grande escala, com qualidade elevada
e constante, custos competitivos e variedade de produtos.
Ø Produção de cultivos “Starters” para produtos lácteos e o emprego de enzimas industriais
melhoraram a eficiência dos processos, assim como a automação e controle da qualidade na
produção de pão e produtos lácteos.
• Fermentação de pão em temperaturas mais elevadas e com maior quantidade de inoculo;
• Uso de amilases microbianas na produção de açúcares fermentescíveis a partir de grãos de
amido, proporcionando açúcares as leveduras para que fermentem liberando CO2 (crescer a
massa de pão e produzir textura característica).
Técnicas de Pasteurização: permitiram a produção de cerveja em escala industrial fazendo com que
industrias artesanais de cerveja, vinhos, licores passassem rapidamente a grandes complexos
produzindo em grande escala.
Técnicas de controle de processo como: (Para garantir maior vida-de-prateleira aos alimentos)
Ø Controle da velocidade de inoculação;
Ø Viabilidade e condições de armazenamento das leveduras;
Ø Controle das condições de oxigênio dissolvido;
Ø Controle da concentração de Nitrogênio solúvel e de açúcares fermentescíveis no álcool;
Ø Controle da temperatura do processo;
Ø Fermentação em processos contínuos;
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Introdução de inovações tecnológicas como:
Ø Obtenção de cerveja com elevadas concentrações de mosto;
Ø Emprego de cereais não malteados e enzimas microbianas
Ø Produção de cervejas com baixos níveis de carboidratos
Ø Aplicação de técnicas genéticas convencionais para melhorar a qualidade das leveduras e
eliminar características indesejáveis.
LEVEDURAS DE PANIFICAÇÃO
Ø Século XVII os padeiros obtinham suas leveduras nas cervejarias locais;
• Devido ao seu sabor amargo e atividades de fermentação variáveis, foram gradualmente sendo
substituídas por leveduras procedentes de fábricas de bebidas alcoólicas.
Ø 1781 obtém-se as primeiras leveduras de panificação prensadas, obtidas através do processo
“Holandês” e posteriormente em 1846 mediante o processo denominado “Viena”
• Ambos obtinham rendimentos baixos, 5 a 14% respectivamente referente a matéria-prima e
30% de álcool.
• 1879-1919 - avanços substanciais nos processos fermentativos com uso de biomassa
permitindo a obtenção industrial de leveduras para panificação de forma independente de
bebidas alcoólicas;
• 1879 - Marquardt introduziu a aeração no processo fermentativo de cereais permitindo
aumentar o rendimento e diminuindo a produção de álcool a 20%.
INOVAÇÕES TECNOLÓGICAS:
Adição gradual de açúcar
Surge o primeiro processo de retro-alimentação
Permite elevar a eficiência do processo ate
próximo do máximo teórico sem a formação
conjunta de álcool.
Durante a Primeira Guerra Mundial a Alemanha desenvolve a produção de leveduras de
panificação usando melaço (todo resíduo dos processos industriais da época) como substrato, com a
finalidade de produzir proteína para o consumo humano - Primeiro processo moderno para produção
de SCP.
Durante a Segunda Guerra Mundial, também na Alemanha, inicia-se a produção de SCP para
consumo humano e animal a partir de Candida utilis, utilizando melaço procedente da produção de
papel e polpa de celulose, obtendo-se os açúcares (substrato) a partir da hidrólise ácida da madeira.
USA, Suíça, Taiwan e Rússia passam também a utilizar este processo.
ÁCIDOS ORGÂNICOS
Ø 1881 inicia-se a produção comercial de ácidos orgânicos sendo que até hoje 50% do ácido
láctico utilizado a nível industrial é produzido via fermentação usando Lactobacil1us delbrueckii.
Introdução à biotecnologia de alimentos
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• Ácido Cítrico extraído inicialmente a partir do suco de limão e posteriormente sintetizado a
partir do glicerol.
Ø 1923 - inicia-se a produção de Citrato via fermentação industrial, atualmente estima-se uma
demanda aproximada de 450.000 toneladas/mês produzidas exclusivamente por fermentação,
inicialmente:
• Empregava-se cultivo em superfície de Aspergilius niger como organismo produtor (citrato).
• Após a 2ª Guerra Mundial introduziu-se o processo de cultivo submerso. Entretanto em 1977
desenvolve-se o processo que utiliza Candida, muito mais eficiente.
Outros ácidos orgânicos são produzidos de forma econômica e rentável por fermentação:
Ex.: produção de Acido Glucônico e Acido Acético, este obtido pela oxidação do etanol
utilizando Acetobacter aceti. Entretanto, o Ácido Acético em escala industrial é produzido somente
por via química.
ÁLCOOL E CETONAS
Ø Durante Primeira Guerra Mundial a Alemanha impedida de importar azeites vegetais utilizados
na produção de glicerol, componente para produção de explosivos, desenvolve a primeiro processo
fermentativo de produção de glicerol, produzido por leveduras a partir do etanol em presença de
bissulfito de sódio;
Ø Durante a Primeira Guerra na Inglaterra é desenvolvido o processo de fermentação acetona-
butanol por via anaeróbia, utilizando Clostridium acetobutylicum, este foi o primeiro processo em
grande escala que necessitava métodos de cultivos puros para prevenir a contaminação.
• Após a Guerra a demanda deste produto diminuiu, entretanto aumentou a procura por n-butanol,
produzido por fermentação até os anos 50, sendo substituído pelo n-butanol produzido a partir do
petróleo, cujo preço era mais baixo que o preço do amido e dos substratos a base de açúcar utilizados
no processo fermentativo.
• 1941 - Inicia-se a implementação da indústria da fermentação alcoólica nos USA, após revogar-
se a proibição da produção de álcool por bioprocessos, sendo responsável então por 77% do álcool
industrial produzido
Ø 1973 - A crise do petróleo faz surgir projetos para produção de combustíveis alternativos.
• Surge o PROÁLCCOL no Brasil, projeto que em 1987 chegou a produzir 3 bilhões de galões de
etanol/ano, a partir da cana-de-açúcar.
• Nos USA inicia-se o “Gasohol Program” que destinava-se a produzir álcool a partir do milho,
adicionando cerca de 10% na gasolina. Este projeto fez surgir um número muito grande de plantas
industriais de pequena e grande escala utilizando processos contínuos e descontínuos.
AMINOÁCIDOS
Glutamato Monosódico e a Lisina são os que se produzem em maiores quantidades, cerca de
500.000 e 80.000 toneladas/mês, respectivamente.
A produção de aminoácidos é resultado do trabalho de pesquisa sobre os mecanismos
bioquímicos que regulam a biosíntese destes compostos por microrganismos, obtendo-se
superproduções a partir de mutações e do controle do processo de fermentação.
Introdução à biotecnologia de alimentos
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As novas técnicas passam a:
Ø Estimular as células para que usem substratos alternativos;
Ø Prevenção ou impedimento de reações laterais;
Ø Indução e ativação de enzimas biosintéticas;
Ø Redução ou inibição de atividades enzimáticas que poderiam degradar o produto e, finalmente
facilitar a excreção do aminoácido pelo microrganismo.
Ø As pesquisas que culminaram com o desenvolvimento do processo de fermentação para
produção de ácido glutâmico foram as responsáveis pelo grande avanço na produção de aminoácidos
por fermentação.
• Hoje a maioria dos aminoácidos comerciais são produzidos por fermentação. Assim como a
de monofosfatos de inosina e a guanosina utilizados como potencializadores de sabor.
BIOPOLIMEROS
Ø Goma Xantana - biopolímero mais importante atualmente em função do volume de produção,
utilizada como gelificante ou estabilizante de suspensões. Produzido por fermentação utilizando a
bactéria Xanthomonas campestris.
Outras gomas:
Ø Alginato produzido pelo Azetobacter vinelandii;
Ø Pululano produzido pelo Aureobasidium pullulans;
Ø Escleroglucana produzido pelo Sclerotinum;
Ø Gelano produzido pela Pseudomonas elodea
Gomas em geral possuem elevados pesos moleculares e altas viscosidades causando
problemas nos processos de mistura, transferência de massa e calor em fermentadores. Estes
aspectos devem ser levados em conta na hora de escolher ou desenhar um aparelho de fermentação.
POLIHIDROXIBUTIRATO (PHB) : poliéster termoplástico acumulado intracelularmente em
alguns tipos de bactérias (Bacillus subtilis, Pseudomonas oleovorans, Alcaligenes eutrophus, entre
outras) até um nível de 80% da massa seca celular, sua produção permite a fabricação de plásticos
biodegradáveis.
VITAMINAS
A maioria das vitaminas é produzida por métodos químicos. Entretanto algumas vitaminas
podem ser produzidas por fermentação. Ex.: vitaminas do grupo B como a tiamina, biotina, ácido
fólico, ácido pantotênico, piridoxamina, vitamina B12 e riboflavina.
• A síntese química da vitamina B12 é muito complexa sendo que sua produção comercial só é
viável por via fermentativa utilizando Pseudomonas.
Ø Riboflavina: sua produção por fermentação compete eficazmente com os métodos de síntese e
semi-síntese, sendo que 30% da demanda mundial é produzida por fermentação.
Introdução à biotecnologia de alimentos
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• Recentemente uma cepa recombinante de Bacillus subtilis foi patenteada, sendo capaz de
produzir 4,5g de riboflavina em 24 horas de fermentação, período muito inferior aos 5 dias
necessários quando se utiliza Ascomycetes.
ANTIBIÓTICOS
Pasteur identificou efeitos antagonistas de alguns microrganismos frente a outros e julgou
que poderiam ter efeito terapêutico.
Ø 1928 - Alexander Fleming observou que Penicillium notatum, contaminante dos cultivos de
Staphylococcus aureos, matava as bactérias, identificando o ingrediente ativo, a Penicilina, podia
inibir outras bactérias.
Ø Após a penicilina ter sido isolada na sua forma ativa, em 1940 nos USA, Florey e Chain
demonstraram sua destacada atividade antibacteriana desenvolvendo-se então um processo
fermentativo comercial para sua produção. Este fato marcou o início da indústria de antibióticos.
Ø Seguiu-se então a descoberta de
Ø Estreptomicina a partir de espécies de Streptomyces
Ø Cefalosporinas a partir de Cephalosporium acremonium
Com o desenvolvimento a partir de 1940 de técnicas de genética microbiana que implicaram
em técnicas de mutação e seleção de microrganismos, permitiu aumentar muito o rendimento da
produção de penicilina de poucas mg/L para até 20g/L de cultivo.
Iniciam-se também, nesta época, os estudos sobre a produção de metabólitos secundários,
pequenas moléculas como os antibióticos que não têm papel importante no crescimento e
manutenção das células.
TRANSFORMAÇÕES DE ESTERÓIDES
O uso de microrganismo, o domínio das técnicas microbiológicas e fermentativas permitiu
fazer transformações enzimáticas altamente seletivas e especificas, representando um grande avanço
na produção de fármacos, como os hormônios esteróides.
Ø 1940 - descobriu-se que a cortisona, esteróide secretado pela glândula adrenal, aliviava a dor de
pacientes com artrite reumática, o que fez desenvolver-se um processo de síntese química para
sua produção que requeria 37 etapas, a um custo de 200 U$/g;
Ø 1952 - cientistas descobrem que uma cepa de Rhizopus arrhizus hidroxilava a progesterona,
produzindo 11á-hidroxiprogesterona, permitindo que o custo da síntese de cortisona caísse para
11 etapas e o custo reduzisse para U$ 16/g.
Ø 1980 - Introduziram-se modificações no processo e os custos foram diminuindo gradativamente
de forma que hoje estes custos estão próximos de U$ 0,46/g.
Técnicas semelhantes de biotransformação microbiana permitiram a síntese de outros
esteróides como a aldosterona, prednisona e prednisolona, assim como de outros fármacos
importantes na medicina.
Introdução à biotecnologia de alimentos
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ETAPAS DO PROCESSO FERMENTATIVO
1) Formulação do meio de cultura a ser usado no processo;
2) Esterilização do meio de cultura, fermentadores e equipamentos auxiliares;
3) Produção de uma cultura pura e ativa em suficiente quantidade para inocular no fermentador;
4) Crescimento dos organismos no fermentador sob condições ótimas para a formação do
produto
5) Extração do produto e sua purificação;
6) Disposição dos efluentes produzidos no processo.
ÁREAS DE APLICAÇÃO DA FERMENTACÃO INDUSTRIAL
A) ALIMENTOS
v Massas fermentadas (pão, panetone);
v Carnes fermentadas (salame, lingüiça);
v Bebidas fermentadas (cerveja, vinho ...);
v Bebidas destiladas (conhaque, aguardente ...);
v Leite fermentado (iogurte, queijo ...);
v Enzimas (proteases, amilases, glicose oxidase ...);
v Condimentos (vinagre, glutamato...)
v Aminoácidos (lisina, ácido glutâmico);
v Polissacarídeos (dextrano)
B) PRODUTOS AGROINDUSTRIAIS
v Álcool (industrial e carburante);
v Antibióticos de uso veterinário;
v Biogás;
v Hormônios de crescimento vegetal.
C) MEDICAMENTOS
v Antibióticos;
v Vacinas;
v Vitaminas;
v Hormônios de consumo humano (insulina);
v Aminoácidos.
D) ÁCIDOS ORGÂNICOS E SOLVENTES
v Ácido cítrico;
v Ácido acético;
v Etanol;
v Propanol;
v Butanol;
v Ácido láctico.
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INTER-RELAÇÕES ENTRE MICRORGANISMOS E ENZIMAS
As relações existentes entre microrganismos e as enzimas neles contidos são muito
importantes quando se deseja explorar as enzimas que levam a determinadas reações químicas
especificas.
As enzimas podem ser isoladas e assim a biotecnologia enzimática pode convenientemente
ser manipulada em bio-reatores apropriados.
Por outro lado as células microbianas quando encontram-se imobilizadas em um suporte
sólido, atuam como catalizadores que levam a reações químicas concretas, da mesma maneira que as
enzimas isoladas, o que denota menos trabalho preparativo.
Desta maneira uma grande parte da tecnologia de fermentações se refere ao cultivo de
microrganismos em grande escala.
A seleção e aplicação dos princípios da engenharia genética aplicada a microrganismos
apropriados permitem manipular o conteúdo enzimático destes em determinadas condições. Também
o crescimento de microrganismos em um substrato apropriado provocará a indução da enzima
necessária para a degradação desse substrato de crescimento dentro da célula.
Ex.: o cultivo de levedura sobre maltose induzirá a biossíntese da enzima maltase, (uma á -
glucosidase) que degrada maltose a glicose, que é necessária para a produção de energia química em
forma de ATP dentro da levedura.
MICROORGANISMOS DE USO INDUSTRIAL
Introdução – Os produtos comercialmente importantes das fermentações industriais são de 4
categorias: células microbianas, moléculas grandes como enzimas e polissacarídeos, produtos básicos
e metabólitos secundários que não são necessários para o crescimento celular. A produção comercial
dos produtos de fermentação tem utilizado principalmente diversas espécies de bactérias, leveduras e
fungos, ainda que os avanços recentes no desenvolvimento de técnicas de cultivos têm permitido
utilizar células mais complexas nos processos de fermentação.
Microrganismos Industriais – Na natureza existem duas classes principais de células, ambas
utilizadas nos processo de fermentação industrial:
procariontes - células bacterianas;
eucariontes -leveduras, fungos, células animais e vegetais.
Os microrganismos também se diferenciam em função de suas exigências de oxigênio,
podendo dividir-se em estritamente aeróbias, como os Streptomyces e a maioria dos fungos
filamentosos, que podem desenvolver-se unicamente em presença de O2 e os estritamente
anaeróbios, como os Clostridios, que unicamente podem crescer na ausência de O2 e os
microorganismos facultativos, entre eles as leveduras industriais, que podem crescer em situação de
aerobiose e anaerobiose.
As bactérias utilizadas nos processos fermentativos são principalmente quimiorganotróficos,
isto é, podem obter sua energia e seu carbono por oxidação dos compostos orgânicos. As bactérias
podem dividir-se em Gram positiva e Gram negativa, em função de suas resposta a coloração de
Gram. A reprodução se dá por divisão assexuada. Os esporos são produzidos usualmente em resposta
Microbiologia industrial
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as condições adversas do meio, porque são mais resistentes ao calor e aos compostos tóxicos que as
células vegetativas e posteriormente germinam em condições apropriadas. As bactérias são
desprovidas de clorofila, mas podem possuir outros pigmentos fotossintéticos
Os fungos (bolores) também são quimiorganotróficos e os mais importantes utilizados nas
fermentações se classificam principalmente em dois grupos: os Zigomycotina, asseptados dos
gêneros Mucor e Rhizophus e os Deuteromycotina, septados dos gêneros Thicotherma, Aspergillus,
Penicillium Fusarium e Aureobasidium. Os fungos são desprovidos de clorofila ou outros pigmentos
fotossintéticos. Sua reprodução pode ser assexuada (esporulação) ou sexuada.
As leveduras são fungos geralmente unicelulares e que se reproduzem de forma assexuada
(por gemação ou divisão binária) ou sexuada. A levedura mais utilizada nos processos fementativos
industriais é a Saccharomyces cerevisiae, principalmente para produção de álcool e nas panificações.
Esta levedura não degrada a lactose, por isso para produzir álcool e biomassa a partir de soro de leite
é utilizada Kluyveromyces lactis, que possuem as enzimas necessárias para degradar lactose. Outras
leveduras importantes são: Candida utilis e Endomycopsis fibuliger
Os vírus não têm estrutura celular alguma, possui o material genético (DNA ou RNA) contido
por uma camada de proteína. Não possuem atividade metabólica e, portanto, não sintetizam
protoplasma nem crescem. Em conseqüência disto sua multiplicação não pode ser feita por um
processo de divisão, como nos microrganismos celulares. Novos vírus são “produzidos” pelas células
nas quais penetram, de acordo com as informações contidas no seu ácido nucléico. São agentes
submicroscópicos que infecta as plantas, animais e bactérias. Os vírus bacterianos (bacteriófagos)
infectam os processos de fermentação de cepas microbianas e causa sérios problemas,
particularmente nos cultivos “starter” utilizados no processamento de alimentos.
Células animais e células vegetais também podem ser utilizadas nos processos fermentativos
industriais, principalmente para a produção de antibióticos e hormônios vegetais. Necessitam de um
meio muito nutritivo e são sensíveis a flutuações de fatores externos como temperatura, pH, O2 e CO2
dissolvidos.
FONTES NUTRICIONAIS PARA OS MICRORGANISMOS
Basicamente as necessidades nutricionais dos microorganismos são as mesmas de todos os
seres vivos, que para renovarem seu protoplasma e exercerem suas atividades, exigem fontes de
energia e fonte de material plástico. Nos seres superiores encontra-se apenas dois tipos nutritivos:
a) os vegetais são fotossintéticos (obtém energia da luz solar) e autotróficos, se nutrem
exclusivamente de substâncias inorgânicas;
b) os animais são quimiotróficos, pois obtém energia as custas de reações químicas e heterotróficos,
por exigirem fontes orgânicas de carbono.
Entre os microrganismos há uma grande variedade de tipos intermediários.
FONTES DE ENERGIA
a) Algumas bactérias realizam fotossíntese, porém não produzem oxigênio. Podem utilizar fontes
inorgânicas (liotróficas) ou compostos orgânicos (organotróficas) como doadores de elétrons.
b) Os fungos, leveduras e a grande maioria das bactérias são quimiossintéticas, obtendo energia as
Microbiologia industrial
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custas de reações químicas, nas quais substratos adequados são oxidados com desprendimento de
energia. Estes substratos podem ser inorgânicos (litotróficos) ou orgânicos (organotróficos). No
primeiro grupo encontramos apenas bactérias, como por exemplo, Thiobacillus, capazes de
oxidar enxofre, produzindo ácido sulfúrico, podem ser utilizados na lixiviação de metais, como
cobre e urânio. A grande maioria das bactérias e a totalidade de fungos, leveduras e, também, os
protozoários são quimiorganotróficos.
FONTES DE MATERIAL PLÁSTICO
MATÉRIAS–PRIMAS COMO FONTE DE CARBONO
Para os autotróficos a única fonte de carbono necessária é o CO2. Para os heterotróficos, há
necessidade de suprir o meio com outras fontes de carbono, naturais ou sintéticas:
• Celulose, Amido, Sacarose, Lactose, Glicose (alto custo), Óleos, Metanol, Etanol;
• Melaço de cana-de-açúcar – Composição variável (rico em aminoácidos, vitaminas, minerais,
vários açúcares); corrigir deficiências (N, P, S);
• Extrato de Malte –cevada malteada; 90-95% de CHO; rico em aminoácidos.
MATÉRIAS–PRIMAS COMO FONTE DE NITROGÊNIO
Quanto às necessidades de nitrogênio há três categorias principais de microrganismos:
Alguns microrganismos, especialmente bactérias, retiram o nitrogênio diretamente da atmosfera e o
converte em nitrogênio orgânico. Muitos fungos e quase totalidade das bactérias utilizam compostos
inorgânicos de nitrogênio, como amônio e nitratos. Algumas bactérias exigem fontes orgânicas de
nitrogênio. De um modo geral, adicionar aminoácidos ou hidrolisados de proteínas favorece o
crescimento da maioria dos heterotróficos.
o Sais de Amônio, Sais (nitratos); Uréia
o Líquido da maceração do milho (± 4% N);
o Extrato de levedura e Peptonas (laboratório)
o Ar atmosférico
ÍONS INORGÂNICOS ESSENCIAIS
Além de nitrogênio, os microrganismos exigem uma série de outros elementos, sob a forma de
compostos inorgânicos, alguns em quantidade bem maiores que outros.
o Macronutrientes – P, S, K, Mg, Ca, Fe
o Micronutrientes – Cu, Zn, Co, B, ...
FATORES DE CRESCIMENTO
São os compostos orgânicos indispensáveis a um determinado microorganismo, que ele não
consegue sintetizar. Tais fatores devem estar presentes no meio para que o microrganismo possa
crescer, como por exemplo vitaminas (especialmente do complexo B), aminoácidos, nucleotídios,
ácidos graxos, entre outros.
Aspecto importante dessa exigência resulta do fato que, quando um microrganismo exige um
determinado fator, seu crescimento será limitado pela quantidade desse fator presente no meio.
Microbiologia industrial
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Dentro de certos limites, o crescimento será proporcional ao teor do composto limitante. Isso
permite a elaboração de um método de dosagem de certos compostos, baseados na medida do
crescimento microbiano. Essa é a base da dosagem microbiana de uma série de substâncias,
principalmente aminoácidos e vitaminas.
AGUA
A água não constitui um nutriente, mas é absolutamente indispensável para o crescimento dos
microrganismos. Seu papel é múltiplo. Os microrganismos se nutrem pela passagem de substâncias
em solução através da membrana citoplasmática. Exerce função na regulação da pressão osmótica e
regulação térmica. A maior parte dos microrganismos morre rapidamente pela dessecação, a não ser
quando esta é precedida pelo congelamento brusco (liofilização)
OXIGÊNIO ATMOSFÉRICO
Como a água o oxigênio não é um nutriente e funciona apenas como receptor de hidrogênio
nos processos de respiração aeróbica. Os microrganismos se comportam diferentemente em presença
de O2 livre:
Aeróbios – exigem oxigênio livre; alguns, porém, em pequenas quantidades não tolerando as
pressões normais de O2 atmosférico;
Anaeróbios – não toleram a presença de O2 livre;
Facultativos – crescem na presença ou ausência de O2.
Entre as bactérias encontra-se os três tipos de comportamento. Os fungos (bolores) são estritamente
aeróbios, enquanto as leveduras são aeróbias ou facultativas.
CLASSIFICAÇÃO DOS MOSTOS
SINTÉTICO: composição conhecida quantitativamente e qualitativamente é usado em pesquisas
quando se quer controlar exatamente o curso de uma fermentação. O objetivo é saber a rota de
fermentação, saber quanto e quando e quais os substratos que estão sendo utilizados pelos
Microorganismos. Tem um alto custo.
COMPLEXO: composição não é bem definida, estão enquadrados os meios naturais tais como:
caldo de cana, melaço, suco de uva, extrato de leveduras, enquadram-se todos os mostos naturais.
CARACTERISTICAS DO MOSTO
Requerimentos básicos:
1) Proporcionar o máximo rendimento de produto ou biomassa por grama de substrato usado;
2) Produzir a máxima concentração de biomassa ou produto;
3) Permitir o máximo rendimento na formação do produto;
4) Produzir o mínimo de subprodutos indesejáveis;
5) Ser de uma qualidade permanente e estar disponível durante o ano todo
6) Não sofrer degradação durante a esterilização
7) Não deverá causar problemas em outras etapas do processo fermentativo particularmente:
aeração, agitação, extração, purificação e tratamentos dos efluentes.
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SUBSTRATOS UTILIZADOS NA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA
a) Açucaradas: neste grupo temos as diretamente fermentescíveis (contém monossacarídeos: Ex.:
glicose, frutose, suco de uva, maçã, pêra, etc.).
Principal substrato é um monossacarídeo (glicose) e este é metabolizado diretamente até
piruvato.
As matérias-primas indiretamente fermentescíveis são aquelas que contém dissacarídeos,
predominando a maltose e sacarose. Ex.: caldo de cana-de-açúcar e melaço.
A composição do melaço de cana-de-açúcar varia em função de fatores como:
• qualidade da matéria-prima (variedade, idade, sanidade, maturação, queimada ou não, etc);
• métodos de extração do açúcar (moagem, clarificação, cozimento, etc);
• condições técnicas das regiões açucareiras;
• condições e tempo de armazenamento.
b) Amiláceas: contêm em sua composição polissacarídeos (amido) utilizada para produção de
vodka, rum, whisky (tem que sofrer sacarificação).
PREPARO DA MATÉRIA-PRIMA
a) Melaço: deve sofrer uma preparação prévia (de 82 ºBrix 18 -20 ºBrix)
CRUZ DE COBENGE: regra das misturas, utilizada para calcular os volumes para diluição do
melaço.
B M - b = Quantidade de melaço em peso d = volume litros)
M
b B - M = Quantidade de água em peso d = volume (litros)
B = Brix do melaço
b = Brix da água (zero)
M = Brix desejado (18 –20º)
d = densidade
Ex.: melaço: 80 ºBrix
Água; 0 ºBrix
M = 20 ºBrix
dmelaço = 1,6284
dágua = 1,0000
80 20 – 0 = 20 Kg melaço = 12,31 Litros
1,6284
20
0 80 – 20 = 60 kg de água = 60 litros
1,0000
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No tanque de diluição controla-se:
pH: entre 4,5 – 5,5
Nutrientes: Sulfato de amônio (1 g/L); fosfato (1 g/L) sulfato de Mg (0,1 g/L) {ativador enzimático}
b) Caldo de cana-de-açúcar: não necessita diluição pois a cana sofre adição de água por aspersão na
moenda para extração do açúcar, neste ponto o brix deve ficar entre 18-20
D = Brix do caldo x Volume do caldo - volume do caldo = Voluma de H2O a ser adicionada
Brix desejado
Ex.: Brix do caldo = 20
Volume = 50.000 L
Brix desejado = 16º
D = 20 x 50.000 – 50.000 = 12.500 L de H2O a ser adicionada para ter 16º Brix
16
Após fazer a diluição corrige-se o pH para 4,5 - 5,5 usando ácido sulfúrico, cítrico ou ainda suco de
limão (caseiro) e colocam-se os nutrientes.
DETERMINAÇÃO DE SÓLIDOS SOLÚVEIS TOTAIS POR REFRATOMETRIA
1) Preparo do mosto:
a) Determinação de sólidos solúveis por refratometria
- Para cada grau acima de 20 ºC subtrai-se 0,06 por grau;
- Para cada grau abaixo de 20 ºC soma-se 0,06 por grau:
Ex.: 20 ºBrix a 25ºC 5 x 0,06 = 0,3 20 ºBrix – 0,3 = 19,7 ºBrix
20 ºBrix a 15ºC 5 x 0,06 = 0,3 20 ºBrix + 0,3 = 20,3 ºBrix
Um mosto inicialmente com 76 ºBrix preparar 300 ml de mosto com 16% de SST.
100 g melaço -------- 76 g SST
X g --------------------- 16 g SST X = 21,05 g/100mL
Para 300 mL = 63,15 g de mosto + 236,85 g de água
RELACÃO ENTRE DIFERENTES GRAUS DE MEDIDA.
1 ºBrix corresponde a 0,54 ºBaumé
1 ºBaumé corresponde a 1,8 ºBrix
1 ºBrix corresponde a 0,85 ºBabo
BRIX = % de sólidos solúveis existentes em uma solução de sacarose quimicamente pura.
Fermentadores
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ELEMENTOS DE UM FERMENTÁDOR (BIOREATOR)
O coração de qualquer processo fermentativo é sem dúvida o fermentador. Uma definição
funcional para um fermentador seria dizer que consiste em um recipiente em que se mantém um
ambiente favorável para que se desenvolva um determinado processo biológico.
A palavra fermentador nos faz visualizar um recipiente de grande tamanho de aço inoxidável
brilhante e com uma instrumentação muito sofisticada. Ainda que muitos fermentadores industriais
são assim, outros importantes processos biológicos industriais, desenvolvidos em grande escala, são
conduzidos em equipamentos muito menos sofisticados.
Em alguns processos um fermentador pode consistir em um simples recipiente aberto,
embora para processos cujas condições são muito sensíveis será necessário um sistema fechado e
muito bem controlado capaz de manter um ambiente favorável.
MEIO AMBIENTE
As condições ambientais existentes dentro de um fermentador podem considerar-se sob três
aspectos diferentes: condições biológicas, químicas e físicas.
MEIO BIOLÓGICO
Unicamente os microrganismos que contribuem para o processo em questão encontram-se
presentes, enquanto que os não produtivos, destrutivos ou não desejáveis estejam excluídos do
processo. Do ponto de vista de produção é importante também que os microrganismos desejados
estejam presentes em quantidades suficientes para que o processo se desenvolva a um ritmo rentável.
Um sistema que contenha somente o microrganismo desejado diz-se um sistema asséptico.
A assepsia consegue-se, primeiro, esterilizando o meio, eliminando todos os organismos
vivos, diz-se então esterilizado, segundo introduzindo o microrganismo desejado. O ato de introduzir
o microrganismo desejado denomina-se inoculação.
MEIO QUÍMICO
Implica na composição do meio de crescimento microbiano, que deverá conter as
concentrações adequadas de substratos ou nutrientes microbiológicos, assim como dos precursores
sintéticos, livres de substâncias inibidoras e mantidas a um pH adequado.
MEIO FÍSICO
Refere-se fundamentalmente a temperatura do sistema cujo controle é muito importante
quando se projeta um fermentador.
Este parâmetro e a necessidade de manter a uniformidade das condições ao longo da
fermentação, exigem um bom sistema de agitação, o que pode provocar por sua vez a ruptura dos
organismos e de seus agregados.
Quando se mantém um ambiente favorável os parâmetros ambientais não têm que
necessariamente permanecerem constantes ao longo do tempo.
Fermentadores
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Fermentação por batelada - características:
v Diferentes fases de crescimento;
v Diferentes condições ótimas;
v Fermentação parece estar programada de acordo com a disponibilidade de nutrientes;
v pH e temperatura oscilam ao longo do tempo, para que apareçam de acordo com estas trocas as
sucessivas fases de crescimento
PRINCIPAIS TIPOS DE FERMENTADORES
Os fermentadores classificam-se em dois grandes grupos:
v Fermentadores de cultivo disperso: neste sistema os microrganismos estão imersos no meio
de cultivo e seguem os movimentos dos nutrientes líquidos. O fermentador mais simples consiste em
um tanque aberto no qual o microrganismo se dispersa no meio líquido.
Estes fermentadores forma utilizados de geração em geração com muito êxito na indústria
cervejeira já que ao formar-se na fase anaeróbica da fermentação, uma capa de espuma que contém
CO2 e leveduras, impedindo que o ar penetre no interior do tanque. Para controlar a temperatura
durante a fermentação se pode colocar tubos refrigerantes. São muito utilizados no tratamento
biológico de águas residuais em fluxo lento, onde a superfície do líquido permite que se dissolva o
O2 do ar e libere o CO2. Estes efeitos podem ser acelerados com a agitação do líquido que aumenta a
transferência de gases e mantém a homogeneidade. Nos sistemas anaeróbios os próprios gases da
fermentação podem proporcionar a agitação, através do desenho do fermentador (cônico/cerveja) ou
por meio mecânico (bombas de recirculação).
v Fermentadores de cultivo imobilizado: nos sistemas imobilizados o microrganismo se
desenvolve sob forma de uma lâmina ou capa disposta sobre uma superfície que está em contato com
o meio nutritivo. Em laboratórios se utiliza o “cultivo em superfície” (placas). Inicialmente a
produção de penicilina era feira em garrafas que eram introduzidas em uma incubadora. Atualmente
se utilizada o cultivo em superfície na fermentação do ácido cítrico (Aspergillus niger), que se
cultiva em uma superfície com um meio adequado contendo melaço em bandejas de pouca
profundidade, colocadas em estantes à temperatura constante e com circulação de ar freqüente.
Também e pode desenvolver películas microbianas sobre uma superfície de meio sólida adequada.
Este meio pode ser de leito fixo, em pedras, plástico particulado, lâminas de plástico onduladas,
através dos quais se faz passar o meio líquido sobre a capa de microbiana da superfície.
v Na prática, porém, ocorre que nos sistemas de cultivo disperso também aparece uma capa sobre
a superfície do recipiente, e no cultivo imobilizado existe um certo numero de microrganismos
dispersos no meio de cultivo.
Fermentadores
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Qualquer processo fermentativo divide-se em uma etapa puramente fermentativa e outra de
recuperação do(s) produto(s), conforme o esquema abaixo:
Esterilizador
Refrigeração
Com ou sem ruptura celular
Formulação
Armazena,mento de
Matérias-primas
Inóculo
Volume: 1 a 2 litros
Preparação de
Meios
Fermentador
de produção
Tanque de
Semeadura
(pé-de-cuba)
Separação de
células
Etapas de
Recuperação do
Produto
Envasamento e
Armazenamento
PRODUTO
Tratamento de
Efluentes
Utilização de
Subprodutos
- água
- ar
- vapor
Água do
Processo
Ar Estéril Vapor Energia Inóculo
Preparado
1:10
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ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTO, MEIOS DE CULTURA E AR
Introdução
A esterilização implica a destruição, inativação ou remoção de toda forma de vida
microbiana. Isso quer dizer que a esterilização provoca nos microrganismos uma perda irreversivel
da capacidade de reprodução no ambiente considerado. Não implica, entretanto, a inativação total
das enzimas celulares, toxinas, etc.
Antes de entrarmos na discussão dos métodos, é conveniente fazermos algumas
considerações em torno dos mecanismos de esterilização e das características das populações
microbianas.
O mecanismo letal varia conforme o processo de esterilização empregado. O efeito final,
entretanto, é o mesmo. Deve ocorrer a destruição e/ou inativação da(s) enzimaas) envolvida(s) em
processos vitais para o microrganismo. Teoricamente, basta que o agente esterilizante bloqueie uma
reação enzimática essencial ou destrua uma molécula vital. Na prática, entretanto, agentes com ação
tão especifica não encontram aplicação como esterilizantes, por vários motivos: A heterogeneidade
da população microbiana; a possibilidade da existência de microrganismos com capacidade de
utilizar outras “rotas metabólicas” para vencer o bloqueio estabelecido; a dificuldade do agente em
atingir um alvo muito específico; etc., podem ser mencionados como fatores que justificam a
utilização de agentes capazes de atingir o microrganismo de um modo mais grosseiro e inespecífico.
Principalmente no caso da esterilização de equipamentos industriais, procura-se utilizar processos
capazes de danificar generalizadamente a célula, em vez de se procurar um ponto específico de sua
estrutura metabólica.
Outra consideração importante, no caso da esterilização de equipamentos, é a cessação do
efeito esterilizante no final do processo de esterilização. Em outras palavras, o agente ou condição
esterilizante deve atuar eficientemente durante o processo de esterilização. Terminada a
esterilização, não deve haver ação residual. No caso de fermentação industrial, por exemplo, uma
possível ação residual pode ser tão ou mais prejudicial que a presença de certos contaminantes.
Essas considerações ajudam a apontar os processos físicos como os métodos de escolha na
esterilização de equipamentos.
MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO
Físicos Químicos
Calor:
- Seco: Flambagem ; ar quente
- Úmido: vapor fluente, vapor sob pressão;
tindalização.
Radiação:
- Ultravioleta
- Ionizantes (RX e ã)
Filtração : Membranas
Líquidos, Gases e vapores
Esterilizantes gasosos: Óxido de etileno (mais
eficiente que os demais; utilizado em câmaras
de esterilização)
Formaldeído – mais comum
â-propiolactona- carcinogência
Ácido peracético
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A escolha do método depende das características dos produtos a serem esterilizado e do custo
do processo.
Quando se usa agentes químicos: tempo de contato
Quando se usa calor: tempo e a temperatura de contato
OBS.: O vapor direto acarreta um aumento no volume do mosto
MECANISMOS DE ESTERILIZACÃO
Se bem que os métodos usuais de esterilização tenham uma ação generalizada sobre a célula,
o mecanismo pelo qual isso é conseguido varia conforme o agente empregado. No caso do calor,
sabe-se, desde os tempos de Koch, que o mecanismo de destruição dos microrganismos pelo calor
seco não é o mesmo que ocorre quando se utiliza vapor.
Exceto em casos em que haja uma destruição física do microrganismo, como é o caso da
flambagem do equipamento a ser esterilizado, o mecanismo de esterilização não está bem elucidado.
Em alguns casos, a ruptura da parede celular e a vacuolização da célula são aparentes e poderiam ser
interpretadas como oriundas da atuação de forças osmóticas.
A adsorção de corantes pelas células, a incapacidade de reprodução e, no caso de
microrganismos móveis e a perda da motilidade, são características que auxiliam na constatação da
perda de viabilidade de células individuais.
Enquanto que a inativação pelo calor seco é, essencialmente, um processo oxidativo, o uso de
vapor causa uma coagulação das proteínas celulares com prejuízo para a organização estrutural do
microrganismo, afetando a sua competência fisiológica.
TABELA 1 - Efeito da temperatura sobre o tempo necessário para destruir esporos bacterianos de
fermentação simples em meio com concentração inicial de 1,6 x 105
esporos/mL
TEMPERATURA (ºC) TEMPO (minutos)
100 1200
105 600
110 190
115 7
120 19
125 7
130 3
135 1
Tempo de esterilização corresponde ao tempo em que o material foi submetido aquela
temperatura específica e não ao tempo total do processo, que deve incluir o tempo de aquecimento e
resfriamento.
DESNATURAÇÃO DE PROTEÍNAS
Além das estruturas primária, secundária e terciária, as moléculas de proteína podem ser
constituídas por mais de uma cadeia de polipeptídios. A conformação estrutural da molécula protéica
Esterilização na indústria fermentativa
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é estabilizada por ligações covalentes e não-covalentes. Essas ligações reduzem a flexibilidade das
cadeias polipeptídicas, garantindo sua disposição de uma forma ordenada, compacta e,
conseqüentemente, de baixa entropia, em vez de uma associação ao acaso. Entre as ligações
covalentes, o tipo de ocorrência mais geral é a ligação dissulfeto As ligações não-covalentes podem
ser pontes de hidrogênio, ligações hidrofóbicas e iônicas. As ligações hidrofóbicas são as que mais
contribuem para a estabilização da estrutura protéica, pois de um modo geral, 40% dos resíduos de
aminoácidos de uma proteína possuem ramificações não-polares.
Uma alteração estrutural da molécula de proteína é, normalmente, acompanhada de uma
perda de atividade biológica, pois a ação de enzimas pode ser explicada por uma perturbação
conformacional especifica induzida pelo substrato no centro ativo da enzima.
Considerando-se que as células de microrganismos podem conter, normalmente, de 40 a 60%
de seu peso seco em proteínas, e considerando-se, ainda, as funções metabólicas e/ou estruturais
desempenhadas por essas proteínas na célula microbiana, pode-se perceber, com facilidade, o efeito
que agentes ou condições capazes de desorganizar estruturalmente as proteínas poderão exercer
sobre a célula.
ALTERAÇÃO DNA
Se, de um lado, agentes que atuam sobre as proteínas são capazes de comprometer
diretamente a competência fisiológica, agentes capazes de causar alterações no material genético do
microrganismo podem provocar o aparecimento de mutações letais. Donde a possibilidade de se
utilizarem, na esterilização, substâncias ou condições que apresentem maior afinidade pelo ácido
desoxirribonucléico (DNA).
- Agentes químicos como propionolactona, ácido nitroso, etc., agem sobre o material genético das
células, causando alterações que terão conseqüências sobre as características fisiológicas do
microrganismo.
- Radiações – Fazendo-se incidir uma radiação sobre microrganismos, os componentes celulares
poderão absorver energia radiante. O efeito letal das radiações é uma demonstração da presença, na
célula viva, de moléculas capazes de absorvera energia radiante. Proteínas e ácidos nucléicos,
constituintes essenciais da matéria viva possuem estruturas que absorvem principalmente luz
ultravioleta. As alterações fotoquímicas que ocorrem, em virtude da absorção de luz ultravioleta, são
muito prejudiciais ás células.
POPULAÇÃO MICROBIANA
Ao tratar de esterilização, temos de levar em conta, também, as características dos
microrganismos contaminantes do equipamento a esterilizar. No caso de existirem no equipamento
apenas formas vegetativas de microrganismos, e se o meio em que se encontram for um meio que
não as abrigue e proteja da ação do agente esterilizante, e mais ainda, se pudermos estar certos de
que o agente esterilizante será capaz de atuar sobre as células microbianas em condições favoráveis e
por tempo suficiente, então o problema de esterilização será relativamente simples.
Esterilização na indústria fermentativa
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FIGURA 1 - Esterilização de um meio de cultura em autoclave a 121 ºC por 20 minutos. O tempo
total de esterilização é 100 minutos.
ESTERILIZAÇÃO POR AGENTES FÍSICOS
CALOR SECO
Ø calor seco mata os microrganismos por oxidação dos componentes celulares. O ar seco não é um
bom condutor de calor e sua ação não é tão enérgica quanto a do vapor. Por esse motivo é necessário
uma temperatura e tempo maiores de esterilização.
Ø o emprego do calor seco ou ar quente, é recomendado quando o contato direto ou completo do
vapor sobre pressão com o material é indesejável ou improvável, que é o caso de vidraria, óleos, pós
e substâncias similares.
A esterilização pelo calor seco consiste em submeter o equipamento a ser esterilizado a uma
temperatura tal que, durante o período de aquecimento, haja inativação dos microrganismos
presentes.
A maior resistência demonstrada por microrganismos ao calor seco parece depender de um
endurecimento da camada mais externa da célula por meio de coagulação das protemas, dificultando
a penetração do calor no interior da célula propriamente dita e ulterior coagulação das proteínas
plasmáticas. Devido à muito menor capacidade de penetração do calor seco, é necessário aquecer o
equipamento a ser esterilizado a temperaturas mais altas por tempo mais prolongado, o que torna
esse método inadequado quando materiais como papel, algodão, plásticos, etc., estão presentes.
Populações homogêneas de esporos apresentam uma relação linear de inativação com relação
ao tempo de exposição a 125 ºC. A não-linearidade que ocorre com populações naturais, pode ser
atribuída a uma heterogeneidade da população. As relações não-lineares obtidas com populações
naturais podem ser reproduzidas por misturas adequadas de esporos com resistências térmicas
diferentes, isolados daquelas mesmas populações. Aliás, essa heterogeneidade das populações
Esterilização na indústria fermentativa
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naturais pode ser devida não só à presença de esporos de espécies diferentes como também a
diferentes graus de resistência térmica entre esporos de uma mesma espécie.
A temperatura empregada tem sido 125 ºC e é comum cotar-se a resistência térmica de um
microrganismo em relação ao D125. A desorganização molecular que ocorre nas células, devido à
exposição a temperaturas elevadas, pode se dar dos seguintes modos:
a) ativação direta das moléculas pela energia térmica, com alteração conformacional por quebra de
ligações intramoleculares e intervenção subseqüente de outras moléculas;
b) reação de moléculas complexas com oxigênio, água ou vapor de água (no caso de esterilização
pelo calor úmido).
A exigência básica da esterilização pelo calor seco é que todo o material seja sujeito à
temperatura esterilizante. As únicas causas possíveis de fracasso na esterilização são o controle
defeituoso da temperatura; a não penetração do calor; e a presença de microrganismos com
resistência térmica superior á esperada.
CALOR ÚMIDO
Ø calor úmido mata os microrganismos por desnaturação protéica, ou seja: pela coagulação das
proteínas e enzimas celulares, e também a fusão dos lipídeos da membrana celular;
Ø quanto maior a temperatura menor o tempo necessário;
Ø Para destruir esporos temos que submeter este vapor de água a uma pressão positiva para
alcançarmos as temperaturas de trabalho;
Sempre que possível usa-se vapor para a esterilização, pelo seu alto conteúdo de calor por
unidade de peso ou de volume; porque cede facilmente calor a uma temperatura constante e
controlável; por ser de fácil produção e distribuição; e porque, mesmo sendo de aquecimento rápido,
a velocidade de aquecimento e a temperatura final do equipamento podem ser controladas.
TABELA 2 - Relação entre a pressão de vapor de água em diferentes pressões
Pressão de vapor da água (atm) Temperatura
0 100,0
0,34 109,0
0,68 115,0
1,00 121,0
1,36 126,5
Obs.:
- Para assegurar a temperatura pela pressão de trabalho precisamos ter certeza de que todo o ar foi
expulso, primeiro porque o ar não é bom condutor de calor, logo o calor não penetra no material a
ser esterilizado. Segundo a temperatura do ar aquecido a uma pressão é inferior a temperatura do
vapor aquecido a mesma pressão.
Causas da inativação térmica de bactérias pelo calor úmido
Os mecanismos propostos para explicar a influência letal do calor úmido sobre as bactérias
são: (a) coagulação de proteínas; (b) inativação de enzimas; (c) desorganização dos lipídeos
celulares; (d) desorganização do aparelho genético; (e) ruptura do RNA.
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A morte das células expostas ao calor é exponencial. A base bioquímica desse fenômeno é
difícil de ser explicada em termos de acontecimentos específicos na célula. O calor úmido age sobre
vários componentes celulares e, na célula, pode-se observar uma série de efeitos.
Inativação térmica dos esporos
Os esporos são dotados de uma camada interna de mucopeptídeo recoberta por uma capa
protéica rica em cisteína. As seguintes teorias tentam explicar a termorresistência dos esporos:
impermeabilidade do esporo; enzimas em formas inativas estabilizadas; desidratação do material
protéico, com estabilização conseqüente da maior interaproximação dos radicais hidrofóbicos e
imobilização iônica.
A inativação dos esporos em presença de vapor de água deve-se à atividade da água e não
propriamente ao calor latente do vapor. Esse fato mostra que os altos coeficientes de temperatura,
característicos da inativação térmica de esporos. só podem ser devidos a processos de coagulação de
proteínas
ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS POR RADIAÇÕES UV E IONIZANTES
Os princípios básicos da utilização da radiação UV são a redução de microrganismos
presentes no ar e a destruição de células depositadas na superfície do equipamento e expostas à
radiação. A radiação UV tem sido empregada como agente auxiliar para diminuir os níveis de
contaminação.
A ação de radiações ionizantes (raios gama) sobre os microrganismos se manifesta como um
uma inibição do poder de multiplicação dos mesmos.
ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS POR AGENTES QUÍMICOS
Apresenta a vantagem de ser feita a temperatura inferior a 50ºC. Os fatores que influenciam
na eficiência da esterilização são: tempo de contato, temperatura, pH, matéria orgânica, estabilidade
ao oxigênio umidade, etc. detergentes, líquidos (ácidos e álcalis, glutaraldeído, formaldeído, iodófors,
ácido peracético) Gases e vapores (ozônio, brometo de metila, formaldeído, â-propionolactona, óxido
de etileno, ácido peracético)
ESTERILIZAÇÃO DO MEIO DE CULTURA
De acordo com um conceito bem amplo, a esterilização de um meio é a operação que tem por
finalidade remover ou destruir todas as formas de vida, animal ou vegetal, macro ou microscópicas,
saprófita ou não, existentes no meio considerado.
O grau de esterilização dos meios de fermentação varia conforme o processo a que se destina.
Algumas vezes é totalmente dispensável (fermentação láctica de hortaliças e polvilho; tratamento
biológicos de resíduos); realizada de forma incipiente (fermentação alcoólica; produção de leveduras
para panificação; fermentação acética do vinagre); realizada com alto grau de exigência (produção de
antibióticos, enzimas, vitaminas, acetona, butanol). Em ensaios laboratoriais sempre é necessário
(devido ao uso de culturas puras)
• Em plantas industriais o calor úmido é a principal forma de se efetuar a esterilização. Pode
Esterilização na indústria fermentativa
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ser feita nos próprios recipientes destinados a fermentação (processo descontínuo) ou em separado
(processo contínuo)
Ø ESTERILIZAÇÃO EM BATELADA:
• Vários meios de cultura são esterilizados no fermentador a 121 ºC (para destruir esporos), o
tempo é calculado em função dos constituintes do mosto(pH, material em suspensão, etc) e do
tamanho do fermentador.
• Esterilizar ás válvulas e eletrodos e outros equipamentos que entram em contato direto com o
fermentador
• Método indireto - injetar vapor no fermentador através de camisa ou da serpentina;
• Método direto - injetar vapor direto na solução nutriente, assim o vapor deve estar livre de aditivos
químicos
OBS.: O vapor gerado pela indústria normalmente contém substâncias potencialmente tóxicas aos
microrganismos, derivadas de anticorrosivos utilizados no processo de geração de vapor. Com
injeção direta de vapor no meio de cultura o volume deste aumentará, pois uma parte do vapor se
condensa aumentando o volume do líquido dentro do fermentados.
Vantagem
a) tem a vantagem de esterilizar o fermentador e o meio simultaneamente, evitando perigos de
contaminações;
Desvantagem
a) Manutenção de temperaturas altas por períodos longos, favorecendo possíveis alterações no meio;
b) Consumo elevado de vapor e água de resfriamento;
c) Problemas de corrosão pelo contato do equipamento com o meio aquecido.
d) Elevado tempo ocioso do equipamento;
e) interações químicas com nutrientes
Ø ESTERILIZAÇÃO CONTINUA
• As principais desvantagens apresentas podem ser evitadas pela esterilização contínua; melhor
controle de temperatura; temperaturas mais elevadas diminui o tempo da operação; Fornece meio
esterilizados para fermentadores de vários tamanhos
• Etapa preliminar obrigatória nos processos fermentativos contínuos, também tem valor nos
processos em batelada, pois diminui o tempo de esterilização e a área física necessária para o
processo, devido a relação exponencial entre taxa de morte e temperatura tomando bem menor o
tempo necessário para a destruição de todos os microrganismos quando temperaturas maiores são
utilizadas;
• Na esterilização em batelada são necessários 30 a 60 minutos a 121 ºC, a esterilização contínua
normalmente é realizada em 30 a 120 segundos a 140 ºC;
• Meio de cultura torna-se diluído pois a condensação do vapor aumenta o volume do líquido,
para resolver este problema o meio aquecido é bombeado através de uma válvula de expansão eo
condensado é removido por uma bomba de vácuo até que o meio de cultura fique com a mesma
concentração de antes da esterilização.
Esterilização na indústria fermentativa
Prof. Raul Vicenzi 25
• Pode se feita pela injeção direta de vapor ou por meio de trocadores de calor.
• Em certos casos a pasteurização já pé suficiente para eliminar grande parte do flora microbiana.
É uma operação rápida utilizando temperaturas próximas de 100 ºC seguida de resfriamento. Em
meio ácidos equivale a uma esterilização
• Para pequenas quantidade de meio pode-se lançar mão da tindalização.
FIGURA 2 - Esquema de esterilização contínua do meio de cultura em trocadores de calor
DESTRUIÇÃO DE NUTRIENTES
A esterilização do meio pelo calor acarreta alterações na sua composição química. A
experiência mostra que, quanto mais elevada for a temperatura de esterilização de um dado meio,
menor será a destruição de nutrientes e, conseqüentemente, melhores serão os resultados da
fermentação posterior. Esta menor destruição de nutrientes é uma conseqüência de fato – observada
experimentalmente – de ser a energia de ativação de destruição térmica dos microrganismos maior
do que a de destruição térmica dos nutrientes. Essa afirmativa é de importância prática, tanto na
esterilização de meios de fermentação como na esterilização de alimentos.
ESTERILIZAÇÃO DO AR
As fermentações aeróbias, com o microrganismo em suspensão, constituem os processos
fermentativos de maior importância industrial atualmente. Em tais fermentações a quantidade de ar
introduzida no sistema é grande e é perfeitamente aceitável, que haja grande preocupação quanto a
esterilização do ar a ser admitido nos fermentadores. Tais cuidados devem ser tomados
principalmente nas horas iniciais da fermentação.
- A maior parte dos processos fermentativos é conduzido com agitação vigorosa, e o ar fornecido
ao fermentador deve ser estéril.
- O número de partículas e microrganismos depende da localização da indústria, do movimento do
ar e do tratamento prévio que o ar foi submetido.
Esterilização na indústria fermentativa
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MÉTODOS PARA ESTERILIZAÇÃO DO AR
Calor seco - normalmente antieconômica ou de difícil realização;
Radiações – Apenas as radiações UV poderiam ter aplicação prática, porém pouco usada devido ao
grande tempo de exposição. Pode ser usada em pequenas instalações (laboratórios, pesquisa). Atua
mais como desinfetante.
Filtração –É sem dúvida o processo mais importante por ser o de maior aplicação na industria.
Filtros feitos de lã de vidro, acetato de celulose, etc
Os filtros pode ser de dois tipos principais:
Filtros que apresentam poros - retenção mecânica dos microrganismos (cartuchos de membranas de
ésteres de celulose, nylon);
Filtros de camadas de material fibroso (lã-de-vidro, ) - Atua na combinação de vários efeitos
físicos: inércia, bloqueio, difusão, separação por gravidade e atração eletrostática.
Metabolismo e cinética de crescimento microbiano
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CRESCIMENTO CELULAR
O crescimento dos microrganismos é uma parte integral de quase todos os processos de
fermentação. Sabe-se que as bactérias se reproduzem por divisão binária, produzindo duas células de
mesmo tamanho, entretanto a reprodução de muitas leveduras se dá por gemação;os mofos crescem
por extensão das hifas e a morfologia de seu micélio pode variar em função do meio ambiente.
quando um fungo cresce na superfície de um meio sólido produz uma rede miceliana , cuja natureza
reflete a natureza do meio. Nos cultivos submersos, as células fúngicas podem crescer unidas a
partículas de nutrientes suspensas na forma de micélio filamentoso difuso ou como massa densa. A
morfologia e crescimento influem na velocidade de crescimento e na formação de produtos
Quando um microrganismo é inoculado em um meio de volume e composição conhecidos, o
cultivo passa por uma série de fases, como se pode observar na figura 1. Depois da inoculação,
existe uma fase de latência, em que o microrganismo se adapta as condições do meio. Após um certo
período de tempo em que a velocidade de crescimento das células aumenta gradualmente, as células
crescem a uma velocidade constante máxima ; esta fase se denomina exponencial ou logarítmica. À
medida que o crescimento continua, os nutrientes se vão esgotando e os produtos vão sendo
excretados pelo organismo, a velocidade de crescimento diminui e finalmente o crescimento cessa,
devido freqüentemente ao esgotamento de um nutriente ou pelo acumulo de algum produto tóxico;
esta fase se denomina estacionária.
FIGURA 3 – Crescimento de um microorganismo em um cultivo desontínuo
FATORES QUE INFLUEM NA VELOCIDADE DE CRESCIMENTO
A velocidade de crescimento varia com o tipo de célula microbiana e também em função das
condições físico-químicas do meio ambiente. Em geral, o tempo para que se duplique a biomassa
aumenta com a complexidade do microrganismo, de forma que os tempos de duplicação médio para
as células animais e vegetal são substancialmente maiores que os de mofos e leveduras, que por sua
vez são maiores que das bactérias.
Metabolismo e cinética de crescimento microbiano
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O crescimento celular varia com a temperatura. A maioria dos microrganismos cresce entre
25 e 35 ºC. Dentro deste espaço o crescimento aumenta com o aumento da temperatura até um valor
máximo, acima do qual a velocidade cai rapidamente devido ao incremento da taxa de morte
microbiana.
O pH influi no crescimento da mesma forma que na atividade enzimática. A maioria dos
microrganismos cresce em uma escala de pH variando de 3 a 4.
A velocidade de crescimento da célula microbiana depende da atividade de água (Aw) e da
umidade relativa. As bactérias necessitam uma Aw 0,95 enquanto os mofos podem crescer em
valores de atividade de água menores, de até 0,7 como mínimas.
Como em qualquer reação química, a velocidade de crescimento depende da concentração de
nutrientes químicos, e pode ser descrita pela equação de Monod. Os valores típicos de Ks para as
diversas fontes de carbono estão compreendidos entre 1 e 10 mg/dm3
. As células podem crescer a
velocidades próxima as ìmax quando a fonte de carbono limitante é maior que 10 Ks ou 10 a 100
mg/dm3
. As concentrações de carboidratos elevadas podem inibir o crescimento devido ao efeito
osmótico que tem uma influencia maior sobre as bactérias do que sobre os mofos
Foi comprovado que a quantidade de massa celular total, formada durante o crescimento
celular, é freqüentemente proporcional a quantidade de substrato utilizado.
Biomassa produzida (g)
ãx/s = ------------------------------ ãx/s =coeficiente de rendimento de biomassa
Substrato consumido (g)
METABOLISMO MICROBIANO
O crescimento microbiano depende da capacidade da célula para utilizar os nutrientes de
meio ambiente e sintetizar os compostos macromoleculares das estruturas celulares e também os
principais compostos de baixo peso molecular, necessário para a atividade celular. O metabolismo
intermediário inclui as reações que transformam os compostos de carbono e nitrogênio que entram
na célula em novo material celular ou em produtos que são excretados. A síntese desses compostos
necessita energia e a maioria das células utilizada nas fermentações, são heterotróficas e obtém sua
energia a partir da quebra de compostos orgânicos. Nos processos respiratórios ou aeróbios, os
microrganismos são capazes de oxidar completamente alguns dos substratos a CO2 e H2O, obtendo o
máximo de energia para a conversão dos substratos remanescentes em nova massa celular. No
metabolismo fermentativo ou anaeróbio, as células são menos eficazes para converter os substratos
orgânicos em material celular e usualmente excretam intermediários degradados parcialmente.
O crescimento de urna cultura microbiana pode ser dividido em fases ou estágios. Após a
inoculação de uma cultura em um meio nutriente existe um período durante o qual o crescimento
parece não ocorrer; este período refere-se à fase lag e pode ser considerado como uma fase de
adaptação. Seguindo um período durante o qual a taxa de crescimento das células aumenta
gradualmente, as células crescem a uma taxa constante, este período é conhecido como fase
exponencial. Quando o crescimento diminui ou cessa e as células entram fase estacionária. Após um
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longo período de tempo o número de células viáveis decresce e a cultura entra na fase de morte ou
declínio. Tanto quanto esta cinética de crescimento, o comportamento de uma cultura pode ser
descrito de acordo com os produtos, os quais são gerados durante os estágios da curva de
crescimento.
Quando um microrganismo é inoculado em um meio rico em nutrientes, a velocidade da
divisão celular, e portanto a produção de biomassa, varia de acordo com uma seqüência
característica. A fase lag pode virtualmente ser eliminada aumentando o tamanho do inóculo e
otimizando as condições físicas dentro do fermentador. Em um processo industrial a duração da
fermentação contribui pra o custo do produto, logo uma fase lag mínima é aconselhável.
FIGURA 4. Curva de crescimento de biomassa e consumo de glicose em um cultivo em batelada.
Quando um microrganismo cresce em um ambiente no qual todos os seus nutrientes
essenciais estão em excesso, esses nutrientes se transformam em produtos finais do metabolismo
energético, em calor, ou em compostos requeridos para a reprodução de novas células. Durante a
fase exponencial de crescimento a divisão celular ou velocidade de aumento da biomassa chega a ser
máxima e os produtos gerados são essencialmente para o crescimento das células e incluem:
aminoácidos, nucleotídeos, proteínas, ácidos nucléicos, lipídios, carboidratos, etc. Estes produtos são
conhecidos como os primeiros produtos do metabolismo ou METABOLITOS PRIMÁRIOS e a
fase a qual eles são produzidos (fase log ou exponencial) como trofofase. Também se inclui nesta
categoria a biomassa celular que pode ser considerada como o metabólito mais primário.
Muitos produtos do metabolismo primário são considerados economicamente importantes e
são produzidos por fermentação.
Durante a desaceleração e na fase estacionária, algumas culturas microbianas sintetizam
compostos os quais não são produzidos durante a trofofase e os quais parecem não ter nenhuma
função óbvia no metabolismo celular. A estes compostos nos referimos como METABÔLITOS
SECUNDÁRIOS e a fase na qual eles são produzidos (equivalente à fase estacionária) como
idiofase. É importante salientar que os metabólitos secundários ocorrem em cultivos contínuos a
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baixas taxas de crescimento sendo uma propriedade destas, baixas taxas de crescimento, e também,
da fase onde não tem crescimento celular.
TABELA 3. Produtos do metabolismo primário microbiano e sua significância comercial.
Metabolismo Primário Significância Comercial
Etanol Ingrediente ativo em bebidas alcoólicas, usado como combustível em
motores quando misturado ao petróleo
Ácido Cítrico Vários usos na indústria alimentar
Ácido glutâmico Intensificador de Flavor
Lisina Suplemento alimentar
Nucleotídeos Intensificador de Flavor
Fenilalanina Precursor do Aspartame - Adoçante
Polissacarídeos Aplicação na indústria alimentar
Vitaminas Suplementa Alimentar
Fonte: Stanbury, Whitaker & Hall in Principles of Fermentation Technology. 1995.
Os metabólitos secundários são compostos que não são necessários para a biossíntese celular,
não tendo um papel direto no metabolismo energético. A biossíntese destes compostos está
intimamente ligada com o metabolismo primário das células que os produzem, já que normalmente
seus precursores são metabólitos primários ou modificados, como ácidos orgânicos, aminoácidos,
derivados de açúcares e bases nitrogenadas. Um conceito apropriado para os metabólitos secundários
é “são os compostos não essenciais para o crescimento exponencial” (Wiseman, A.)
Os metabólitos secundários mais importantes do ponto de vista comercial são os antibióticos,
entre eles a Penicilina, cuja produção anual chega a 10.000 ton/ano. As toxinas e os alcalóides
representam o resto dos metabólitos secundários de importância industrial.
Quando se observa que microrganismos crescem a taxas relativamente baixas de crescimento
no seu meio ambiente natural, isto sugere indicio de que é a idiofase que prevalece sobre a trofofase,
a qual pode ser mais uma das propriedades da cultura de microrganismos.
METABOLISMO ENERGÉTICO
A energia necessária aos microrganismos pode ser fornecida pela luz (organismos
fototróficos), ou pela oxidação de substâncias químicas (organismos quimiorganotróficos). Nos dois
casos a energia vai ser estocada pela forma de energia de ligação química, biologicamente utilizável.
Trata-se essencialmente da ligação anidridofosfórica do trifosfato de adenosina (ATP), formada pela
fosforilação do difosfato de adenosina (ADP).
ORGANISMOS QUIMIORGANOTRÓFICOS
A maioria das bactérias, leveduras e mofos são incapazes de efetuar a fotossíntese, utilizam a
energia liberada no decorrer das reações químicas de oxidação. São chamadas quimiorganotróficas.
As reações de oxidação podem ser efetuadas de vários modos:
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- Perda de elétron:
Fe++
Fe+++
+ e-
+ energia
- Desidrogenação:
R-CH2OH R-CHO + 2H+
+ 2e-
+ energia
- Hidratação-desidrogenação:
R-CHO + H2O R-COOH + 2H+
2e-
+ Energia
- Descarboxilação-desidrogenação:
R-CO-COOH + H20 R-COOH + CO2 + 2H+
+ 2e-
+ Energia
Em todos os casos há perda de elétrons freqüentemente acoplada a uma perda de prótons.
Estes elétrons e prótons, após transferência mais ou menos longa, feita por intermédio de uma cadeia
de oxiredução, vão reduzir um aceptor final. Os microrganismos quimiorganotróficos tiram sua
energia da oxidação de substâncias orgânicas elaboradas, as quais devem obrigatoriamente
encontrar-se no meio, logo, trata-se de microrganismos heterotróficos. A grande maioria dos
microrganismos que intervém na biotecnologia faz parte deste grupo.
ACEPTOR FINAL DE ELÉTRONS
O sistema de transporte de elétrons é mais ou menos complexo e recorre as enzimas
(desidrogenases, citocromos redutases, etc.) e co-enzimas (FAD, NAD, NADP, citocromos, etc.) que
são intermediários aceptores de elétrons (e de prótons); trata-se de um seguimento de reações
acopladas com oxiredução. No final desta cadeia, elétrons (e prótons) servem para reduzir um
aceptor final que pode ser de diversas naturezas: Oxigênio molecular, composto mineral oxidado ou
composto intermediário do metabolismo. Existe, também, um mecanismo de eliminação de elétrons
e prótons próprio de numerosas bactérias anaeróbias, sob a forma de hidrogênio, devido a
hidrogenase.
Se o substrato for completamente oxidado, diz-se que há respiração (fala-se às vezes, de via
oxidativa). Se o substrato for parcialmente oxidado e, por isso, incompletamente degradado, o que
acarreta a formação de metabólitos, diz-se que há fermentação. A fermentação traz geralmente o
nome da(s) substância(s) produzida(s) ou da mais abundante se a produção for complexa.
RESPIRAÇÃO AERÓBIA
Existem vários mecanismos de respiração aeróbia. O fato comum entre eles é que o aceptor
final de prótons é o oxigênio do ar e não podem intervir senão quando os microrganismos são
cultivados em condições de aerobiose. Para cada par de prótons transformados em água, há formação
de 3 moléculas de ATP, podendo às vezes haver uma oxidação direta. Esta via leva a formação de
peróxido de hidrogênio (H202) que é tóxico para célula; exceto se esta possuir catalase, enzima capaz
de decompor o H2O2. Quando um microrganismo possui esta via, e não tem catalase, é morto pelo
oxigênio do ar, sendo portanto, um anaeróbio estrito.
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FERMENTAÇÃO / RESPIRAÇÃO
Na fermentação propriamente dita, uma substância orgânica originária da degradação do
substrato serve como aceptor de elétrons (e de prótons). De fato, pode-se considerar que é a mesma
substância que serve, ao mesmo tempo, de doador e aceptor. Numerosas fermentações podem ser
efetuadas em anaerobiose, pois todos os prótons liberados servem para reduzir um substrato
orgânico; outras devem ser efetuadas em aerobiose, pois pelo menos uma parte dos prótons liberados
servem para reduzir o oxigênio.
CINÉTICA DO CRESCIMENTO MICROBIANO
Na fase logarítmica podemos dizer que dobram por intervalo de tempo:
• O número de células (bactérias e leveduras):
• A biomassa (actomicetos e fungos).
Ø A velocidade de crescimento se mantém constante durante a fase logarítmica, ainda que o meio
se altere pelo consumo de substrato e excreção de metabólitos.
Ø A velocidade de crescimento independe da concentração do substrato, pois um excesso de
substrato está presente.
• O substrato limitante é a substância que pela mudança de sua concentraçao promove:
• mudanças na velocidade de crescimento do microrganismo
• mudanças na velocidade de consumo do substrato
• mudança na velocidade de formação do produto.
Na pratica podemos dizer que todo o substrato é limitante.
O processo industrial é interrompido ao final da fase logarítmica ou antes da fase de
declínio, depende se o processo é associado ou não associado.
A taxa de aumento da biomassa está relacionada com a velocidade específica de crescimento
(ì) e a concentração da biomassa (X) expressa em g/L.
dx
------- = ìX , onde
dt
ì = velocidade máxima da biomassa
X = concentração de biomassa
Ø A taxa do aumento do número de células está relacionada com a velocidade específica de
crescimento e com a densidade celuIar (N) expressa em células/L.
dN
------- = ìN , onde N = densidade celular
dt
Ø O tempo de geração (G) é uma constante da cepa da célula e depende das condições de cultivo. É
o espaço de tempo necessário para que uma célula se duplique. Quando o microrganismo está na fase
exponencial o tempo de geração é constante e dado por:
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t t
G = --- = --------------------
z 3,322 log Nf/Ni
METABOLISMO MICROBIANO
A síntese do produto se dá no interior da célula, para que o substrato seja convertido em
produto, ele deve entrar na célula e ser biotransformado por uma seqüência específica de enzimas.
Quanto mais complexo o produto, maior será o número de enzimas envolvidas no metabolismo.
Esquema simplificado do metabolismo celular.
S ⇒ [ X – P ] ⇒ P
ENTRADA DO PROCESSO: transporte do substrato para dentro da célula
METABOLISMO - TRANSFORMACÃO: é o que diferencia o processo químico do fermentativo.
Às vezes X =P.
SAIDA DO PROCESSO: liberação do produto da enzima, podendo ficar intra ou extracelular.
S = concentração do substrato em g/L
X = concentração de células em g/L
P = concentração do produto em g/L ou mg/L
VELOCIDADE DE FORMAÇÃO DE CÉLULAS
A velocidade de formação de células e dada pela variação da concentração de células em
função do tempo, na fase exponencial de crescimento (fase log), a velocidade é constante e pode ser
calculada pelo numero de células (N) por contagem direta dos microrganismos ou por contagem em
placas e ainda pela massa seca de células (X). Ela é chamada velocidade especifica de crescimento,
calculada por:
ln Nf – ln Ni ln Xf – ln Xi ln DOf – ln DOi
ì = ------------------- ou -------------------- ou ---------------------
tf – ti tf - ti tf - ti
para [ ] de células para Biomassa para densidade ótica
FIGURA 5- Variação da Concentração Celular em Função do Tempo
OBS.: Para microrganismos não filamentosos é preferível utilizar número de células e para
microrganismos filamentosos, a massa seca de células.
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VELOCIDADE DE CONSUMO DE SUBSTRATO
A medida que a célula está se reproduzindo os substratos estão sendo consumidos, a
velocidade de consumo do substrato será teoricamente constante, enquanto for constante o
crescimento celular, isto quase nunca acontece, uma vez que o substrato não é só utilizado para o
crescimento celular, mas também para formação de metabólitos, em alguns processos o substrato
pode ter uma velocidade de consumo quase linear por um período de tempo, e a velocidade é
chamada de velocidade específica de consumo do substrato e é calculada por:
ln Sf – ln Si
ì = ------------------- Sf = concentração de substrato
tf – ti
FIGURA 6 - Variação da Concentração de Substrato em Função do Tempo
VELOCIDADE DE FORMAÇÃO DO PRODUTO
A velocidade de formação do produto tende a ser constante durante um período de tempo. É
chamada de velocidade especifica de formação do produto e calculada por:
ln Pf – ln Pi
ì = ------------------- Pf = Produto final
tf – ti
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FIGURA 7 - Variação da Concentração de Produto em Função do Tempo
VELOCIDADE ESPECÍFICA DE CRESCIMENTO
É função de três parâmetros:
- Concentração de substrato limitante (S)
- Velocidade máxima de crescimento (ì max)
- Constante especifica do substrato (ks), equivale a concentração em ì = 0,5 ìmax
É a concentração de substrato que dá a metade da velocidade máxima de crescimento. E dada
pela equação de MONOD, que equivale a equação de Henri-Michaelis-Menten para cinética
enzimática.
S
ì = ìmax --------------- Ks = corresponde a metade do ìmax
Ks + S
FIGURA 8 - Relação entre a Velocidade de crescimento e Concentração de Substrato
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Existindo vários substratos limitantes, podemos estender a equação de Monod para:
K1.S1 K2.S2 Kn.Sn
ì = ìmax . --------- + --------- + + .......+ -----------
K1 + S1 K2 + S2 Kn + Sn
- Se existir um excesso de todos os substrato, então ì = ìmax e a cultura está na fase log, na sua
velocidade máxima de crescimento.
Se o primeiro substrato for exaurido e outro substrato estiver presente, teremos uma segunda
fase lag e log com outro tempo de geração que caracteriza a metabolização deste segundo substrato,
este fenômeno é chamado de DIAUXIA. Isto ocorre porque um dos substratos, geralmente a glicose,
é catabolizada preferencialmente e inibe a quebra de outros substratos. As enzimas que catabolizam
os outros substratos são induzidas (durante a segunda fase lag) após a metabolização completa do
primeiro substrato.
TABELA 4 - Efeito do comprimento da cadeia de glicose na velocidade máxima de crescimento de
Fusarium graminearum a 30ºC
AÇÚCAR Nº de UNIDADE de
GLICOSE
ìmax (h-1
) G (h)
Glicose 1 0,28 2,48
Maltose 2 0,22 3,15
Maltotriose 3 0,18 3,85
FIGURA 9 – Crescimento triáuxico de Fusarium graminearum
Com isto chegamos a conclusão que o ì máximo depende do:
• microrganismo;
• condições de cultivo;
• composição do meio de cultura;
• temperatura de incubação;
• outros fatores (pH, oxigênio, etc.)
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CLASSIFICAÇÃO DOS PROCESSOS
TIPO 1 - ASSOCIADO
No processo associado o produto é derivado diretamente do metabolismo primário, usado
para a produção de energia. O crescimento, o catabolismo de carboidratos e a formação do produto
ocorrem ao mesmo tempo. A TROFOFASE (fase de crescimento) e a IDIOFASE (fase de formação
do produto) não são separadas.
Ex. produção de biomassa, etanol e ácido glucônico. Sendo A, B, e C, produtos
intermediários do metabolismo primário, a formação do produto pode ser considerada:
A ⇒ B ⇒ C ⇒ PRODUTO
FIGURA 10 - Relação entre Crescimento Celular e Formação de Produto em um Processo
Associado
TIPO 2- SEMI-ASSOCIADO
O Produto é derivado de um substrato usado no metabolismo primário, mas segue uma rota
colateral. A tropofase e a idiofase são separadas. Em fermentação em batelada este tipo de cinética
possui dois pontos importantes:
1) crescimento celular acompanhado de alto consumo de substrato e pouca ou nenhuma formação
de produto;
2) O crescimento diminui e a formação do produto começa acompanhada de um alto consumo de
substrato.
Ex.: produção de ácido cítrico e de alguns aminoácidos. A reação de formação do produto pode ser
exemplificada como:
A B C Metabolismo Primário
D E Produto
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FIGURA 11 - Relação entre Crescimento Celular e Formação de Produto em um
Processo Semi-Associado
TIPO 3 - NÃO ASSOCIADO
O metabolismo primário e a formação do produto ocorrem em tempos separados. O produto
não é derivado do catabolismo, mas de rotas anfibólicas. Neste tipo de fermentação, o metabolismo
primário ocorre acompanhado do consumo de substrato, após isto o produto é formado por reações
do metabolismo intermediário.
Ex.: muitos antibióticos e vitaminas. Nesse tipo de processo freqüentemente condições ótimas para o
crescimento celular não são as mesmas para a formação do produto e a fermentação pode ser
dividida em duas etapas, onde na primeira se dá condições às células crescerem e após altera-se a
temperatura, pH, quantidade de oxigênio ou concentração de nutrientes para favorecer a formação do
produto.
FIGURA 12 - Relação Entre Crescimento Celular e Formação de Produto em um
Processo Não associado
A classificação dos processos depende da produção do metabólito, da composição do meio de
cultura e da regulação da cepa utilizada. Podem ocorrer formas intermediárias:
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- Produção de ácido láctico: tipo 1 e 2
- Produção de antibióticos aminonoglicosídicos: tipo 2 e 3
Um processo pode se comportar de duas formas distintas, conforme os parâmetros de
fermentação. Por exemplo, a produção de etanol é um processo associado, mas pela modificação das
condições de fermentação, pode ser forçado a se comportar como não-associado.
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EMPREGO DE CULTIVOS INICIADORES - STARTERS
Os cultivos starters são utilizados atualmente no processamento de alimentos para induzir
diversas mudanças em suas propriedades, tais como a modificação da textura, a conservação, o
desenvolvimento de aromas ou melhora nutricional, e na produção de enzimas.
As principais aplicações de cultivos starters se encontram nas indústrias de panificação,
cárnea e leiteira, ainda que existam leveduras starters destinadas a fermentação de bebidas alcoólicas
e a produção de álcool industrial.
Atualmente está se impondo o emprego de starters preparados com cepas de microrganismos
mais adequados para elaboração de cada produto.
As culturas starters usadas nos produtos cárneos curados consistem, normalmente de um
organismo tipicamente acidificante como Lactobacillus ou Pediococcus para estabilizar o produto
biologicamente e um organismo com características nitrato redutoras que, por uma série de reações
produzirá uma atrativa cor avermelhada associada com o tipo de produto, sendo que o organismo
nitrato redutor normalmente é Micrococcus ou Staphylococcus coagulase negativa.
1. DEFINIÇAO:
Starters são grupos de microrganismos selecionados com características bioquímicas
desejadas e definidas produzidos sob rigorosas e controladas condições (pH, temperatura, acidez,
substrato, etc.) e são usados na elaboração de produtos fermentados.
2. OBJETIVOS DO USO DE STARTERS.
Ø Incorporar um número desejado de microrganismos no meio de modo que estes possam
crescer, multiplicar-se e produzir as alterações desejáveis no meio e no produto final;
Ø Superar o desenvolvimento de qualquer agente contaminante, competindo com estes pelos
substratos e pela produção de substâncias que inibam os contaminantes;
Ø Ajustar uma escala de produção, permitindo uma produção programada de produtos (se
inocular, pode-se ter certeza do que será o produto final e o tempo que leva a produção);
Ø Obter uma maior uniformidade em diferentes lotes de produção;
PARA UMA CULTURA MICROBIANA SER UTILIZADA COMO STARTER DEVE
POSSUIR ALGUNS REQUISITOS FUNDAMENTAIS COMO:
• ser tolerante ao sal (salmoura de 6 a 10%);
• ser tolerante a presença de nitritos (50 a 100 ppm)
• ter crescimento na faixa de 26 a 43 ºC e temperatura ótima de crescimento entre 32 a 35 ºC;
• ser homofermentativo (produzir somente ácido láctico);
• não ser proteolítico;
• não ser lipolítico;
• não produzir sabores e aromas atípicos ao produto final;
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• não ser patogênico;
• apresentar destruição térmica a 57-60 ºC.
Os cultivos starters não devem ser patogênicos, toxigênicos nem formar antibióticos, além
disso não devem degradar os aminoácidos a aminas farmacologicamente ativas (ex. histamina)
ou a ácido sulfidrico. As bactérias lácticas devem formar muito pouco ou nenhum peróxido de
hidrogênio, não formar gás e pouco ou nenhum ácido acético.
3. PRODUÇÃO DE CULTURAS PARA FERMENTAÇAO EM ALIMENTOS
Selecão:
Selecionar cepas ou microorganismos que vão produzir a característica ideal.
• O microorganismo deve ser geneticamente estável.
Manutenção:
Uma vez obtido o cultivo satisfatório devemos mantê-lo puro e ativo.
Mantêm-se a cultura ativa por transferência ou repicagem em meio de cultura apropriado. O meio de
cultura de repicagem deve ser o mesmo da atuação, de preferência;
No ponto médio da fase exponencial de crescimento, guardar sob refrigeração para paralisar
o crescimento. Neste ponto temos o maior número de células viáveis e mais saudáveis de uma
cultura, se a usarmos como inoculante de um processo.
O nível de sobrevivência depende do ambiente: cuidar a temperatura, culturas mantidas a
altas temperaturas (ou mesmo ambiente) continuarão metabolizando e suas enzimas podem ser
descaracterizadas.
Usar sempre a mesma porcentagem de inóculo.
Usar culturas que estão com o seu crescimento no ponto médio da fase exponencial. Se o
inóculo for uma cultura mais resistente, podemos usar a cultura até o final da fase estacionária.
4. PUREZA DA CULTURA
Evitar a presença de contaminantes. Os métodos de controle usados para checar a pureza do
inóculo vão depender do tipo de microrganismo em questão:
Exame microscópico é um método utilizado para identificação de contaminantes desde que se
conheça a morfologia do microrganismo que estamos trabalhando e que o contaminante tenha uma
morfologia diferente
A detecção de substâncias produzidas pelos contaminantes e que não são produzidas pelos
starters.
Ex.: culturas lácticas são todas catalase negativa, enquanto que a grande maioria dos contaminantes
são catalase positiva.
Repicar uma amostra para o meio onde o contaminante cresce bem e de preferência tenha
colônias características.
Em caso de a contaminação retornar para a cultura estoque, ou se houver a suspeita de que
esta está contaminada, fazer a repurificação estriando a cultura em meio seletivo para a cultura
desejada e proceder a purificação.
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5. CARACTERÍSTICAS DAS BACTÉRIAS ÁCIDO LÁCTICAS
São anaeróbias facultativas: crescem melhor com baixa tensão de oxigênio;
São basicamente sacarolíticas: outros componentes são pouco alterados
Produzem grande quantidade de ácido láctico: são ineficientes quanto a produção de energia
Divisão quanto a fermentação da lactose: homo e heterofermentativas;
Mecanismos biossintéticos pobres: é necessário o suprimento de carboidratos, aminoácidos,
lipídios, minerais, etc, para que se desenvolvam:
Não usam O2 no seu metabolismo, por isto não decompõem completamente o alimento e seus
metabólitos básicos acumulam no meio.
A única forma de metabolismo energético é a fermentação:
São gram-positivas.
6. FERMENTAÇÃO POR STARTERS
É alteração da matéria-prima, formando alimentos com características sensoriais agradáveis e
proporcionando uma maior vida-de-prateleira.
Os primeiros produtos fermentados foram descobertos empiricamente e serviam apenas para
conservar. Após desenvolveu-se um certo gosto por produtos fermentados, hoje fabricados para obter
propriedades de conservação e atender a demanda do mercado.
E considerada como um método de preservação provocando modificações das características
químicas da matéria-prima e pelo fato de que os agentes conservadores se formam como produto da
mesma, por ação dos microrganismos são, no entanto alterações dirigidas.
As transformações mais importantes de produtos alimentícios tem como principal substrato
os carboidratos.
Quase todos os conservantes produzidos por ação microbiana são ácidos (ácido láctico) e
álcool.
O efeito conservante dessas substâncias geralmente é complementado pela aplicação de
outros métodos: baixas temperaturas, calor, anaerobiose, sal, açúcar, adição de um ácido (vinagre).
As bactérias lácticas são utilizadas em uma série de produtos como: queijos, leites
fermentados, vegetais e produtos cárneos produzem substâncias inibidoras (ácidos, álcool, H2O2 e
antibióticos (bacteriocinas)).
7. TIPOS DE FERMENTAÇÃO
Os microrganismos lácticos utilizados na indústria de alimentos uns são homo e outros
heterofermentativos, ou seja, alguns produzem apenas ácido láctico (homofermentativos) como
produto da transformação do substrato em questão e, outros produzem ácido láctico e uma gama de
outros ácidos que ficam incorporados ao produto.
Láctica: picles, chucrute, azeitonas verdes, queijo, leites fermentados, produtos cárneos, etc..
Alcoólica: vinho, cerveja, sucos de frutas fermentadas, licores, destilados. etc...
Acética: maionese, vinagre, etc.
Propiônica: ácido propiônico.
Cultivos starters na industria de alimentos
Prof. Raul Vicenzi 43
8. IMPORTÂNCIA DO DESENVOLVIMENTO DA ACIDEZ
a) Controle de contaminações indesejáveis, antagonismo (patogênicos);
b) Ajuda na eliminação de umidade. Ex. queijos.
c) Formação do sabor;
d) Formação de corpo e textura;
e) Facilita a ação de outros aditivos. Ex. a renina atua melhor em pH ácido;
f) Ajuste do pH adequado para os diversos processos fermentativos;
g) Conservação dos produtos (aumenta a vida útil ou vida-de-prateleira dos produtos.);
h) Produção de bacteriocinas (proteínas que são produzidas a partir de seu metabolismo)
9. IMPORTANCIA DO ÁCIDO LACTICO NOS PRODUTOS FERMENTADOS
a) Preservação do produto;
b) Seleção da flora microbiana, evitando contaminações;
c) Contribui para o sabor, aroma e flavor dos produtos fermentados;
d) Melhora a digestibilidade de alguns produtos: Ex.: a precipitação de proteínas em partículas
finas facilita a digestão enzimática;
e) Melhora a utilização do Cálcio, Fósforo e Ferro no organismo (são melhores absorvidos em
pH ácido);
f) Estimula a secreção do suco gástrico.
10 FATORES IMPORTANTES NO DESENVOLVIMENTO DA FERMENTAÇÃO
A presença de antibióticos constitui um sério problema para obtenção de starters lácticos. A
penicilina, muito utilizada para combater mamites, e a aureomicina em concentrados da dieta. Os
resíduos desses antibióticos no leite produzem inibição dos microrganismos lácticos ate 96 horas
após a aplicação ter sido feita no animal.
Níveis de 0,05 a 0,10 U.I. de penicilina/mL inibem o desenvolvimento da maioria dos
Streptococcus e 0,5 U.I./mL inibe por completo a fermentação.
Os Lactobacillus são mais resistentes, embora algumas espécies são inibidas por completo
com 5 U.I./mL de penicilina no leite.
Presença de resíduos de sanitizantes (iodóforos e amonioquaternários), os iodóforos em
baixas concentrações estimula a presença de ácidos enquanto que em níveis maiores (50 a 100 ppm)
a reduzem. Geralmente o cloro ativo em concentrações entre 25 e 200 ppm impedem a fermentação
láctica. Amonioquaternários, níveis entre 25 e 75 ppm causam diminuição da velocidade ou detenção
da fermentação.
11. IMPORTÂNCIA DAS CULTURAS STARTERS PARA INDÚSTRIA
As formas de obtenção e estocagem de culturas starters tem proporcionado o aparecimento
de culturas em melhores condições de uso do que as tradicionalmente usadas. O estoque das culturas
é mantido em plantas de processamento via sub culturas em laboratório
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  • 1. UNIJUI – UNIVERSIDADE REGIONAL DO NOROESTE DO ESTADO DO RS DBQ – DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA E QUÍMICA CURSO - QUÍMICA INDUSTRIAL DE ALIMENTOS
  • 2. INDICE APRESENTAÇÃO........................................................................................................................... 1 INTRODUÇÃO A TECNOLOGIA DE FERMENTAÇÕES........................................................... 2 MICROORGANISMOS DE USO INDUSTRIAL ....................................................................... 9 ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTO, MEIOS DE CULTURA E AR..................................... 18 CRESCIMENTO CELULAR ........................................................................................................... 27 CLASSIFICAÇÃO DOS PROCESSOS............................................................................................37 EMPREGO DE CULTIVOS INICIADORES – STARTERS........................................................... 40 SISTEMAS DE FERMENTAÇÃO.................................................................................................. 48 INTRODUÇÃO AO ESTUDO DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA........................................... 54 SEPARAÇÃO DOS PRODUTOS DE FERMENTAÇÃO.............................................................. 66 SEPARAÇÃO DOS PRODUTOS OBTIDOS POR FERMENTAÇÃO COM LEVEDURAS....... 73 PRODUTOS OBTIDOS POR FERMENTAÇÃO COM BACTÉRIAS.......................................... 77 DIGESTÃO ANAERÓBICA (FERMENTAÇÃO METANOGÊNICA)......................................... 79 TECNOLOGIA DE PRODUÇÃO E UTILIZAÇÃO DE ENZIMAS.............................................. 89
  • 3. Prof. Raul Vicenzi 1 APRESENTAÇÃO A Biotecnologia é um ramo muito amplo da Tecnologia que se ocupa da transformação ou tratamento de materiais de origem biológica. Spinks (1980) define Biotecnologia como a utilização de organismos vivos ou sistemas biológicos para a produção industrial e seu uso em serviços de saneamento. A tendência atual de incluir no termo Biotecnologia, em seu aspecto mais essencial, a Microbiologia Industrial, que trata do aproveitamento dos microrganismos como agentes de degradação e síntese. Por semelhança dos conceitos fundamentais que regem o tratamento biológico de efluentes, o cultivo de células animais e vegetais e a produção de certos medicamentos. Assim, também devido ao seu amplo significado, pode englobar também aspecto igualmente importante da Ciência, Tecnologia e Engenharia de Alimentos. De certa forma, os processos de fermentação representa uma elo que liga as antigas artes de elaboração de alimentos (queijo, vinho, ...), mediante o uso de uma flora microbiana natural com a moderna industria de fermentação de alimentos que utilizava cultivos puros e sofisticados equipamentos de controle do processo. A produção em larga escala de proteínas de organismos unicelulares, produção de antibióticos, produção de células animais e vegetais e a produção compostos químicos a partir de matérias-primas renováveis em substituição aos combustíveis fósseis, são exemplos de outras áreas onde os processos fermentativos podem ser utilizados. O componente curricular Biotecnologia de Alimentos pretende tem como objetivo principal estudar alguns elementos essenciais e básicos dos processos fermentativos: introdução a microbiologia industrial, sistemas de fermentações, desenho de fermentadores, cinética de crescimento, metabolismo microbiano, esterilização na indústria fementativa, produção de enzimas, cultivos starters. Objetiva, também, abordar de forma mais detalhada alguns tipos de fermentação: alcoólica, láctica, acética, metanogênica.
  • 4. Introdução à biotecnologia de alimentos Prof. Raul Vicenzi 2 INTRODUÇÃO A TECNOLOGIA DE FERMENTAÇÕES O termo Fermentação deriva do latim fervere (ferver), devido ao aparecimento das bolhas devido a produção de dióxido de carbono pela ação das leveduras sobre o extrato de frutas ou grãos de malte; ⇒ Significado bioquímico: relata a geração de energia pelo catabolismo de compostos orgânicos; ⇒ Produção de vinho: 10.000 a.C. - provavelmente o vinagre foi descoberto na mesma época e as bebidas alcoólicas destiladas surgiram a mais de 10.000 a.C. na China; ⇒ Cerveja: 5000 - 6000 a.C. - egípcios deixavam a cevada germinar em potes de barro, após estrusavam e amassavam os grãos lavando-os após para obter a bebida, ainda, utilizavam as leveduras da cerveja produzir CO2 para o crescimento de pães; ⇒ Leite e derivados lácteos: dados apontam que em 5000 a.C. se observou que o leite quando retido no estômago de terneiros jovens coagulava-se (ação enzimática); ⇒ Produtos cárneos: conforme Erichsen (1983), cerca de 1500 a.C. o homem já sabia que a carne finamente triturada e misturada com sal e especiarias poderia ser preservada, esta carne era seca e enrolada (rolos) mantendo suas principais qualidades, como um flavor agradável Este produto foi o precursor da lingüiça fermentada produzida atualmente. O nome salame provém da cidade de Salamis, destruída a mais de 2000 anos, situada na costa oeste da ilha Grega de Cypros. Exame microscópico do sedimento de cerveja escavado de urnas que datam de 3400 a 1440 a.C. demonstram claramente que na maioria das vezes continham leveduras, observando-se uma pureza maior nos sedimentos mais recentes. A necessidade de preservar a carne da caça e de animais domésticos abatidos durante o inverno e consumidos no verão (summer sausage), fizeram com que o homem procurasse soluções para a preservação do produto. Assim, os produtos cárneos fermentados tornaram-se de grande importância no mercado alimentar permitindo preservar a carne e atribuir a ela sabor e aroma característicos da tecnologia usada. Ø Antonie van Leeuwenhoek, um pioneiro no uso do microscópio, foi o primeiro a examinar em 1680 gotas de cerveja fermentada. Entretanto esta descoberta foi esquecida...... Ø 1856-1857: Louis Pasteur, após investigações detalhadas sobre as leveduras da cerveja e do vinho, concluiu finalmente que leveduras vivas fermentavam o açúcar em etanol e CO2 quando em anaerobiose. Ø Pateur também observou muitas outras fermentações: Ex.: observou provavelmente um Penicillium que fermentava D-tartarato de amônio em uma mistura racêmica de D e L-tartarato (tartarato de Na, K); Ø Observou também como uns microrganismos cilíndricos produziam ácido butírico somente em condições anaeróbias e investigou a produção de ácido acético por fermentação; Ø 1870 - Pasteur e outros pesquisadores observaram os efeitos antagonistas de um microrganismo frente a outros e previram suas aplicações terapêuticas;
  • 5. Introdução à biotecnologia de alimentos Prof. Raul Vicenzi 3 Ø 1881 - Robert Kock estudou e desenvolveu técnicas de cultivo puro assim como outros métodos bacteriológicos clássicos utilizados até hoje; Ø Dois elementos vitais deram inicio a era moderna da tecnologia de fermentações industriais: • Emprego de fungos e leveduras na modificação de alimentos e bebidas e os estudos microbiológicos pioneiros de Pasteur e Kock. Ø Desenvolvimento de fermentações em superfície ou semi-sólidas surgiu com o desenvolvimento de alimentos orientais e durante as grandes navegações; • Capacidade hidrolítica de determinados fungos em hidrolisar o amido e proteínas na produção de molho de soja, este foi o inicio das fermentações industriais. Ø Cultivo de algas e fungos deu inicio ao processo industrial de obtenção de proteínas alimentícias microbianas (SCP - proteínas de organismos unicelulares) e de inóculos de microrganismos Ø Produção de vinagre e os estudos de Pasteur sobre a produção de ácidos prepararam o caminho para o desenvolvimento de fermentações que produzissem ácidos orgânicos; Ø O desenvolvimento da metodologia de cultivos puros por Kock proporcionou o surgimento de técnicas que permitiram estudar as aplicações industriais de espécies microbianas individuais, iniciando-se o emprego de cultivos puros, meios esterilizados e condições assépticas nas fermentações industriais. FERMENTAÇÃO DE ALIMENTOS Fermentação de pão, queijo e cerveja bem como bebidas alcoólicas desenvolveram-se para satisfazer as exigências comerciais modernas de produção em grande escala, com qualidade elevada e constante, custos competitivos e variedade de produtos. Ø Produção de cultivos “Starters” para produtos lácteos e o emprego de enzimas industriais melhoraram a eficiência dos processos, assim como a automação e controle da qualidade na produção de pão e produtos lácteos. • Fermentação de pão em temperaturas mais elevadas e com maior quantidade de inoculo; • Uso de amilases microbianas na produção de açúcares fermentescíveis a partir de grãos de amido, proporcionando açúcares as leveduras para que fermentem liberando CO2 (crescer a massa de pão e produzir textura característica). Técnicas de Pasteurização: permitiram a produção de cerveja em escala industrial fazendo com que industrias artesanais de cerveja, vinhos, licores passassem rapidamente a grandes complexos produzindo em grande escala. Técnicas de controle de processo como: (Para garantir maior vida-de-prateleira aos alimentos) Ø Controle da velocidade de inoculação; Ø Viabilidade e condições de armazenamento das leveduras; Ø Controle das condições de oxigênio dissolvido; Ø Controle da concentração de Nitrogênio solúvel e de açúcares fermentescíveis no álcool; Ø Controle da temperatura do processo; Ø Fermentação em processos contínuos;
  • 6. Introdução à biotecnologia de alimentos Prof. Raul Vicenzi 4 Introdução de inovações tecnológicas como: Ø Obtenção de cerveja com elevadas concentrações de mosto; Ø Emprego de cereais não malteados e enzimas microbianas Ø Produção de cervejas com baixos níveis de carboidratos Ø Aplicação de técnicas genéticas convencionais para melhorar a qualidade das leveduras e eliminar características indesejáveis. LEVEDURAS DE PANIFICAÇÃO Ø Século XVII os padeiros obtinham suas leveduras nas cervejarias locais; • Devido ao seu sabor amargo e atividades de fermentação variáveis, foram gradualmente sendo substituídas por leveduras procedentes de fábricas de bebidas alcoólicas. Ø 1781 obtém-se as primeiras leveduras de panificação prensadas, obtidas através do processo “Holandês” e posteriormente em 1846 mediante o processo denominado “Viena” • Ambos obtinham rendimentos baixos, 5 a 14% respectivamente referente a matéria-prima e 30% de álcool. • 1879-1919 - avanços substanciais nos processos fermentativos com uso de biomassa permitindo a obtenção industrial de leveduras para panificação de forma independente de bebidas alcoólicas; • 1879 - Marquardt introduziu a aeração no processo fermentativo de cereais permitindo aumentar o rendimento e diminuindo a produção de álcool a 20%. INOVAÇÕES TECNOLÓGICAS: Adição gradual de açúcar Surge o primeiro processo de retro-alimentação Permite elevar a eficiência do processo ate próximo do máximo teórico sem a formação conjunta de álcool. Durante a Primeira Guerra Mundial a Alemanha desenvolve a produção de leveduras de panificação usando melaço (todo resíduo dos processos industriais da época) como substrato, com a finalidade de produzir proteína para o consumo humano - Primeiro processo moderno para produção de SCP. Durante a Segunda Guerra Mundial, também na Alemanha, inicia-se a produção de SCP para consumo humano e animal a partir de Candida utilis, utilizando melaço procedente da produção de papel e polpa de celulose, obtendo-se os açúcares (substrato) a partir da hidrólise ácida da madeira. USA, Suíça, Taiwan e Rússia passam também a utilizar este processo. ÁCIDOS ORGÂNICOS Ø 1881 inicia-se a produção comercial de ácidos orgânicos sendo que até hoje 50% do ácido láctico utilizado a nível industrial é produzido via fermentação usando Lactobacil1us delbrueckii.
  • 7. Introdução à biotecnologia de alimentos Prof. Raul Vicenzi 5 • Ácido Cítrico extraído inicialmente a partir do suco de limão e posteriormente sintetizado a partir do glicerol. Ø 1923 - inicia-se a produção de Citrato via fermentação industrial, atualmente estima-se uma demanda aproximada de 450.000 toneladas/mês produzidas exclusivamente por fermentação, inicialmente: • Empregava-se cultivo em superfície de Aspergilius niger como organismo produtor (citrato). • Após a 2ª Guerra Mundial introduziu-se o processo de cultivo submerso. Entretanto em 1977 desenvolve-se o processo que utiliza Candida, muito mais eficiente. Outros ácidos orgânicos são produzidos de forma econômica e rentável por fermentação: Ex.: produção de Acido Glucônico e Acido Acético, este obtido pela oxidação do etanol utilizando Acetobacter aceti. Entretanto, o Ácido Acético em escala industrial é produzido somente por via química. ÁLCOOL E CETONAS Ø Durante Primeira Guerra Mundial a Alemanha impedida de importar azeites vegetais utilizados na produção de glicerol, componente para produção de explosivos, desenvolve a primeiro processo fermentativo de produção de glicerol, produzido por leveduras a partir do etanol em presença de bissulfito de sódio; Ø Durante a Primeira Guerra na Inglaterra é desenvolvido o processo de fermentação acetona- butanol por via anaeróbia, utilizando Clostridium acetobutylicum, este foi o primeiro processo em grande escala que necessitava métodos de cultivos puros para prevenir a contaminação. • Após a Guerra a demanda deste produto diminuiu, entretanto aumentou a procura por n-butanol, produzido por fermentação até os anos 50, sendo substituído pelo n-butanol produzido a partir do petróleo, cujo preço era mais baixo que o preço do amido e dos substratos a base de açúcar utilizados no processo fermentativo. • 1941 - Inicia-se a implementação da indústria da fermentação alcoólica nos USA, após revogar- se a proibição da produção de álcool por bioprocessos, sendo responsável então por 77% do álcool industrial produzido Ø 1973 - A crise do petróleo faz surgir projetos para produção de combustíveis alternativos. • Surge o PROÁLCCOL no Brasil, projeto que em 1987 chegou a produzir 3 bilhões de galões de etanol/ano, a partir da cana-de-açúcar. • Nos USA inicia-se o “Gasohol Program” que destinava-se a produzir álcool a partir do milho, adicionando cerca de 10% na gasolina. Este projeto fez surgir um número muito grande de plantas industriais de pequena e grande escala utilizando processos contínuos e descontínuos. AMINOÁCIDOS Glutamato Monosódico e a Lisina são os que se produzem em maiores quantidades, cerca de 500.000 e 80.000 toneladas/mês, respectivamente. A produção de aminoácidos é resultado do trabalho de pesquisa sobre os mecanismos bioquímicos que regulam a biosíntese destes compostos por microrganismos, obtendo-se superproduções a partir de mutações e do controle do processo de fermentação.
  • 8. Introdução à biotecnologia de alimentos Prof. Raul Vicenzi 6 As novas técnicas passam a: Ø Estimular as células para que usem substratos alternativos; Ø Prevenção ou impedimento de reações laterais; Ø Indução e ativação de enzimas biosintéticas; Ø Redução ou inibição de atividades enzimáticas que poderiam degradar o produto e, finalmente facilitar a excreção do aminoácido pelo microrganismo. Ø As pesquisas que culminaram com o desenvolvimento do processo de fermentação para produção de ácido glutâmico foram as responsáveis pelo grande avanço na produção de aminoácidos por fermentação. • Hoje a maioria dos aminoácidos comerciais são produzidos por fermentação. Assim como a de monofosfatos de inosina e a guanosina utilizados como potencializadores de sabor. BIOPOLIMEROS Ø Goma Xantana - biopolímero mais importante atualmente em função do volume de produção, utilizada como gelificante ou estabilizante de suspensões. Produzido por fermentação utilizando a bactéria Xanthomonas campestris. Outras gomas: Ø Alginato produzido pelo Azetobacter vinelandii; Ø Pululano produzido pelo Aureobasidium pullulans; Ø Escleroglucana produzido pelo Sclerotinum; Ø Gelano produzido pela Pseudomonas elodea Gomas em geral possuem elevados pesos moleculares e altas viscosidades causando problemas nos processos de mistura, transferência de massa e calor em fermentadores. Estes aspectos devem ser levados em conta na hora de escolher ou desenhar um aparelho de fermentação. POLIHIDROXIBUTIRATO (PHB) : poliéster termoplástico acumulado intracelularmente em alguns tipos de bactérias (Bacillus subtilis, Pseudomonas oleovorans, Alcaligenes eutrophus, entre outras) até um nível de 80% da massa seca celular, sua produção permite a fabricação de plásticos biodegradáveis. VITAMINAS A maioria das vitaminas é produzida por métodos químicos. Entretanto algumas vitaminas podem ser produzidas por fermentação. Ex.: vitaminas do grupo B como a tiamina, biotina, ácido fólico, ácido pantotênico, piridoxamina, vitamina B12 e riboflavina. • A síntese química da vitamina B12 é muito complexa sendo que sua produção comercial só é viável por via fermentativa utilizando Pseudomonas. Ø Riboflavina: sua produção por fermentação compete eficazmente com os métodos de síntese e semi-síntese, sendo que 30% da demanda mundial é produzida por fermentação.
  • 9. Introdução à biotecnologia de alimentos Prof. Raul Vicenzi 7 • Recentemente uma cepa recombinante de Bacillus subtilis foi patenteada, sendo capaz de produzir 4,5g de riboflavina em 24 horas de fermentação, período muito inferior aos 5 dias necessários quando se utiliza Ascomycetes. ANTIBIÓTICOS Pasteur identificou efeitos antagonistas de alguns microrganismos frente a outros e julgou que poderiam ter efeito terapêutico. Ø 1928 - Alexander Fleming observou que Penicillium notatum, contaminante dos cultivos de Staphylococcus aureos, matava as bactérias, identificando o ingrediente ativo, a Penicilina, podia inibir outras bactérias. Ø Após a penicilina ter sido isolada na sua forma ativa, em 1940 nos USA, Florey e Chain demonstraram sua destacada atividade antibacteriana desenvolvendo-se então um processo fermentativo comercial para sua produção. Este fato marcou o início da indústria de antibióticos. Ø Seguiu-se então a descoberta de Ø Estreptomicina a partir de espécies de Streptomyces Ø Cefalosporinas a partir de Cephalosporium acremonium Com o desenvolvimento a partir de 1940 de técnicas de genética microbiana que implicaram em técnicas de mutação e seleção de microrganismos, permitiu aumentar muito o rendimento da produção de penicilina de poucas mg/L para até 20g/L de cultivo. Iniciam-se também, nesta época, os estudos sobre a produção de metabólitos secundários, pequenas moléculas como os antibióticos que não têm papel importante no crescimento e manutenção das células. TRANSFORMAÇÕES DE ESTERÓIDES O uso de microrganismo, o domínio das técnicas microbiológicas e fermentativas permitiu fazer transformações enzimáticas altamente seletivas e especificas, representando um grande avanço na produção de fármacos, como os hormônios esteróides. Ø 1940 - descobriu-se que a cortisona, esteróide secretado pela glândula adrenal, aliviava a dor de pacientes com artrite reumática, o que fez desenvolver-se um processo de síntese química para sua produção que requeria 37 etapas, a um custo de 200 U$/g; Ø 1952 - cientistas descobrem que uma cepa de Rhizopus arrhizus hidroxilava a progesterona, produzindo 11á-hidroxiprogesterona, permitindo que o custo da síntese de cortisona caísse para 11 etapas e o custo reduzisse para U$ 16/g. Ø 1980 - Introduziram-se modificações no processo e os custos foram diminuindo gradativamente de forma que hoje estes custos estão próximos de U$ 0,46/g. Técnicas semelhantes de biotransformação microbiana permitiram a síntese de outros esteróides como a aldosterona, prednisona e prednisolona, assim como de outros fármacos importantes na medicina.
  • 10. Introdução à biotecnologia de alimentos Prof. Raul Vicenzi 8 ETAPAS DO PROCESSO FERMENTATIVO 1) Formulação do meio de cultura a ser usado no processo; 2) Esterilização do meio de cultura, fermentadores e equipamentos auxiliares; 3) Produção de uma cultura pura e ativa em suficiente quantidade para inocular no fermentador; 4) Crescimento dos organismos no fermentador sob condições ótimas para a formação do produto 5) Extração do produto e sua purificação; 6) Disposição dos efluentes produzidos no processo. ÁREAS DE APLICAÇÃO DA FERMENTACÃO INDUSTRIAL A) ALIMENTOS v Massas fermentadas (pão, panetone); v Carnes fermentadas (salame, lingüiça); v Bebidas fermentadas (cerveja, vinho ...); v Bebidas destiladas (conhaque, aguardente ...); v Leite fermentado (iogurte, queijo ...); v Enzimas (proteases, amilases, glicose oxidase ...); v Condimentos (vinagre, glutamato...) v Aminoácidos (lisina, ácido glutâmico); v Polissacarídeos (dextrano) B) PRODUTOS AGROINDUSTRIAIS v Álcool (industrial e carburante); v Antibióticos de uso veterinário; v Biogás; v Hormônios de crescimento vegetal. C) MEDICAMENTOS v Antibióticos; v Vacinas; v Vitaminas; v Hormônios de consumo humano (insulina); v Aminoácidos. D) ÁCIDOS ORGÂNICOS E SOLVENTES v Ácido cítrico; v Ácido acético; v Etanol; v Propanol; v Butanol; v Ácido láctico.
  • 11. Microbiologia industrial Prof. Raul Vicenzi 9 INTER-RELAÇÕES ENTRE MICRORGANISMOS E ENZIMAS As relações existentes entre microrganismos e as enzimas neles contidos são muito importantes quando se deseja explorar as enzimas que levam a determinadas reações químicas especificas. As enzimas podem ser isoladas e assim a biotecnologia enzimática pode convenientemente ser manipulada em bio-reatores apropriados. Por outro lado as células microbianas quando encontram-se imobilizadas em um suporte sólido, atuam como catalizadores que levam a reações químicas concretas, da mesma maneira que as enzimas isoladas, o que denota menos trabalho preparativo. Desta maneira uma grande parte da tecnologia de fermentações se refere ao cultivo de microrganismos em grande escala. A seleção e aplicação dos princípios da engenharia genética aplicada a microrganismos apropriados permitem manipular o conteúdo enzimático destes em determinadas condições. Também o crescimento de microrganismos em um substrato apropriado provocará a indução da enzima necessária para a degradação desse substrato de crescimento dentro da célula. Ex.: o cultivo de levedura sobre maltose induzirá a biossíntese da enzima maltase, (uma á - glucosidase) que degrada maltose a glicose, que é necessária para a produção de energia química em forma de ATP dentro da levedura. MICROORGANISMOS DE USO INDUSTRIAL Introdução – Os produtos comercialmente importantes das fermentações industriais são de 4 categorias: células microbianas, moléculas grandes como enzimas e polissacarídeos, produtos básicos e metabólitos secundários que não são necessários para o crescimento celular. A produção comercial dos produtos de fermentação tem utilizado principalmente diversas espécies de bactérias, leveduras e fungos, ainda que os avanços recentes no desenvolvimento de técnicas de cultivos têm permitido utilizar células mais complexas nos processos de fermentação. Microrganismos Industriais – Na natureza existem duas classes principais de células, ambas utilizadas nos processo de fermentação industrial: procariontes - células bacterianas; eucariontes -leveduras, fungos, células animais e vegetais. Os microrganismos também se diferenciam em função de suas exigências de oxigênio, podendo dividir-se em estritamente aeróbias, como os Streptomyces e a maioria dos fungos filamentosos, que podem desenvolver-se unicamente em presença de O2 e os estritamente anaeróbios, como os Clostridios, que unicamente podem crescer na ausência de O2 e os microorganismos facultativos, entre eles as leveduras industriais, que podem crescer em situação de aerobiose e anaerobiose. As bactérias utilizadas nos processos fermentativos são principalmente quimiorganotróficos, isto é, podem obter sua energia e seu carbono por oxidação dos compostos orgânicos. As bactérias podem dividir-se em Gram positiva e Gram negativa, em função de suas resposta a coloração de Gram. A reprodução se dá por divisão assexuada. Os esporos são produzidos usualmente em resposta
  • 12. Microbiologia industrial Prof. Raul Vicenzi 10 as condições adversas do meio, porque são mais resistentes ao calor e aos compostos tóxicos que as células vegetativas e posteriormente germinam em condições apropriadas. As bactérias são desprovidas de clorofila, mas podem possuir outros pigmentos fotossintéticos Os fungos (bolores) também são quimiorganotróficos e os mais importantes utilizados nas fermentações se classificam principalmente em dois grupos: os Zigomycotina, asseptados dos gêneros Mucor e Rhizophus e os Deuteromycotina, septados dos gêneros Thicotherma, Aspergillus, Penicillium Fusarium e Aureobasidium. Os fungos são desprovidos de clorofila ou outros pigmentos fotossintéticos. Sua reprodução pode ser assexuada (esporulação) ou sexuada. As leveduras são fungos geralmente unicelulares e que se reproduzem de forma assexuada (por gemação ou divisão binária) ou sexuada. A levedura mais utilizada nos processos fementativos industriais é a Saccharomyces cerevisiae, principalmente para produção de álcool e nas panificações. Esta levedura não degrada a lactose, por isso para produzir álcool e biomassa a partir de soro de leite é utilizada Kluyveromyces lactis, que possuem as enzimas necessárias para degradar lactose. Outras leveduras importantes são: Candida utilis e Endomycopsis fibuliger Os vírus não têm estrutura celular alguma, possui o material genético (DNA ou RNA) contido por uma camada de proteína. Não possuem atividade metabólica e, portanto, não sintetizam protoplasma nem crescem. Em conseqüência disto sua multiplicação não pode ser feita por um processo de divisão, como nos microrganismos celulares. Novos vírus são “produzidos” pelas células nas quais penetram, de acordo com as informações contidas no seu ácido nucléico. São agentes submicroscópicos que infecta as plantas, animais e bactérias. Os vírus bacterianos (bacteriófagos) infectam os processos de fermentação de cepas microbianas e causa sérios problemas, particularmente nos cultivos “starter” utilizados no processamento de alimentos. Células animais e células vegetais também podem ser utilizadas nos processos fermentativos industriais, principalmente para a produção de antibióticos e hormônios vegetais. Necessitam de um meio muito nutritivo e são sensíveis a flutuações de fatores externos como temperatura, pH, O2 e CO2 dissolvidos. FONTES NUTRICIONAIS PARA OS MICRORGANISMOS Basicamente as necessidades nutricionais dos microorganismos são as mesmas de todos os seres vivos, que para renovarem seu protoplasma e exercerem suas atividades, exigem fontes de energia e fonte de material plástico. Nos seres superiores encontra-se apenas dois tipos nutritivos: a) os vegetais são fotossintéticos (obtém energia da luz solar) e autotróficos, se nutrem exclusivamente de substâncias inorgânicas; b) os animais são quimiotróficos, pois obtém energia as custas de reações químicas e heterotróficos, por exigirem fontes orgânicas de carbono. Entre os microrganismos há uma grande variedade de tipos intermediários. FONTES DE ENERGIA a) Algumas bactérias realizam fotossíntese, porém não produzem oxigênio. Podem utilizar fontes inorgânicas (liotróficas) ou compostos orgânicos (organotróficas) como doadores de elétrons. b) Os fungos, leveduras e a grande maioria das bactérias são quimiossintéticas, obtendo energia as
  • 13. Microbiologia industrial Prof. Raul Vicenzi 11 custas de reações químicas, nas quais substratos adequados são oxidados com desprendimento de energia. Estes substratos podem ser inorgânicos (litotróficos) ou orgânicos (organotróficos). No primeiro grupo encontramos apenas bactérias, como por exemplo, Thiobacillus, capazes de oxidar enxofre, produzindo ácido sulfúrico, podem ser utilizados na lixiviação de metais, como cobre e urânio. A grande maioria das bactérias e a totalidade de fungos, leveduras e, também, os protozoários são quimiorganotróficos. FONTES DE MATERIAL PLÁSTICO MATÉRIAS–PRIMAS COMO FONTE DE CARBONO Para os autotróficos a única fonte de carbono necessária é o CO2. Para os heterotróficos, há necessidade de suprir o meio com outras fontes de carbono, naturais ou sintéticas: • Celulose, Amido, Sacarose, Lactose, Glicose (alto custo), Óleos, Metanol, Etanol; • Melaço de cana-de-açúcar – Composição variável (rico em aminoácidos, vitaminas, minerais, vários açúcares); corrigir deficiências (N, P, S); • Extrato de Malte –cevada malteada; 90-95% de CHO; rico em aminoácidos. MATÉRIAS–PRIMAS COMO FONTE DE NITROGÊNIO Quanto às necessidades de nitrogênio há três categorias principais de microrganismos: Alguns microrganismos, especialmente bactérias, retiram o nitrogênio diretamente da atmosfera e o converte em nitrogênio orgânico. Muitos fungos e quase totalidade das bactérias utilizam compostos inorgânicos de nitrogênio, como amônio e nitratos. Algumas bactérias exigem fontes orgânicas de nitrogênio. De um modo geral, adicionar aminoácidos ou hidrolisados de proteínas favorece o crescimento da maioria dos heterotróficos. o Sais de Amônio, Sais (nitratos); Uréia o Líquido da maceração do milho (± 4% N); o Extrato de levedura e Peptonas (laboratório) o Ar atmosférico ÍONS INORGÂNICOS ESSENCIAIS Além de nitrogênio, os microrganismos exigem uma série de outros elementos, sob a forma de compostos inorgânicos, alguns em quantidade bem maiores que outros. o Macronutrientes – P, S, K, Mg, Ca, Fe o Micronutrientes – Cu, Zn, Co, B, ... FATORES DE CRESCIMENTO São os compostos orgânicos indispensáveis a um determinado microorganismo, que ele não consegue sintetizar. Tais fatores devem estar presentes no meio para que o microrganismo possa crescer, como por exemplo vitaminas (especialmente do complexo B), aminoácidos, nucleotídios, ácidos graxos, entre outros. Aspecto importante dessa exigência resulta do fato que, quando um microrganismo exige um determinado fator, seu crescimento será limitado pela quantidade desse fator presente no meio.
  • 14. Microbiologia industrial Prof. Raul Vicenzi 12 Dentro de certos limites, o crescimento será proporcional ao teor do composto limitante. Isso permite a elaboração de um método de dosagem de certos compostos, baseados na medida do crescimento microbiano. Essa é a base da dosagem microbiana de uma série de substâncias, principalmente aminoácidos e vitaminas. AGUA A água não constitui um nutriente, mas é absolutamente indispensável para o crescimento dos microrganismos. Seu papel é múltiplo. Os microrganismos se nutrem pela passagem de substâncias em solução através da membrana citoplasmática. Exerce função na regulação da pressão osmótica e regulação térmica. A maior parte dos microrganismos morre rapidamente pela dessecação, a não ser quando esta é precedida pelo congelamento brusco (liofilização) OXIGÊNIO ATMOSFÉRICO Como a água o oxigênio não é um nutriente e funciona apenas como receptor de hidrogênio nos processos de respiração aeróbica. Os microrganismos se comportam diferentemente em presença de O2 livre: Aeróbios – exigem oxigênio livre; alguns, porém, em pequenas quantidades não tolerando as pressões normais de O2 atmosférico; Anaeróbios – não toleram a presença de O2 livre; Facultativos – crescem na presença ou ausência de O2. Entre as bactérias encontra-se os três tipos de comportamento. Os fungos (bolores) são estritamente aeróbios, enquanto as leveduras são aeróbias ou facultativas. CLASSIFICAÇÃO DOS MOSTOS SINTÉTICO: composição conhecida quantitativamente e qualitativamente é usado em pesquisas quando se quer controlar exatamente o curso de uma fermentação. O objetivo é saber a rota de fermentação, saber quanto e quando e quais os substratos que estão sendo utilizados pelos Microorganismos. Tem um alto custo. COMPLEXO: composição não é bem definida, estão enquadrados os meios naturais tais como: caldo de cana, melaço, suco de uva, extrato de leveduras, enquadram-se todos os mostos naturais. CARACTERISTICAS DO MOSTO Requerimentos básicos: 1) Proporcionar o máximo rendimento de produto ou biomassa por grama de substrato usado; 2) Produzir a máxima concentração de biomassa ou produto; 3) Permitir o máximo rendimento na formação do produto; 4) Produzir o mínimo de subprodutos indesejáveis; 5) Ser de uma qualidade permanente e estar disponível durante o ano todo 6) Não sofrer degradação durante a esterilização 7) Não deverá causar problemas em outras etapas do processo fermentativo particularmente: aeração, agitação, extração, purificação e tratamentos dos efluentes.
  • 15. Microbiologia industrial Prof. Raul Vicenzi 13 SUBSTRATOS UTILIZADOS NA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA a) Açucaradas: neste grupo temos as diretamente fermentescíveis (contém monossacarídeos: Ex.: glicose, frutose, suco de uva, maçã, pêra, etc.). Principal substrato é um monossacarídeo (glicose) e este é metabolizado diretamente até piruvato. As matérias-primas indiretamente fermentescíveis são aquelas que contém dissacarídeos, predominando a maltose e sacarose. Ex.: caldo de cana-de-açúcar e melaço. A composição do melaço de cana-de-açúcar varia em função de fatores como: • qualidade da matéria-prima (variedade, idade, sanidade, maturação, queimada ou não, etc); • métodos de extração do açúcar (moagem, clarificação, cozimento, etc); • condições técnicas das regiões açucareiras; • condições e tempo de armazenamento. b) Amiláceas: contêm em sua composição polissacarídeos (amido) utilizada para produção de vodka, rum, whisky (tem que sofrer sacarificação). PREPARO DA MATÉRIA-PRIMA a) Melaço: deve sofrer uma preparação prévia (de 82 ºBrix 18 -20 ºBrix) CRUZ DE COBENGE: regra das misturas, utilizada para calcular os volumes para diluição do melaço. B M - b = Quantidade de melaço em peso d = volume litros) M b B - M = Quantidade de água em peso d = volume (litros) B = Brix do melaço b = Brix da água (zero) M = Brix desejado (18 –20º) d = densidade Ex.: melaço: 80 ºBrix Água; 0 ºBrix M = 20 ºBrix dmelaço = 1,6284 dágua = 1,0000 80 20 – 0 = 20 Kg melaço = 12,31 Litros 1,6284 20 0 80 – 20 = 60 kg de água = 60 litros 1,0000
  • 16. Microbiologia industrial Prof. Raul Vicenzi 14 No tanque de diluição controla-se: pH: entre 4,5 – 5,5 Nutrientes: Sulfato de amônio (1 g/L); fosfato (1 g/L) sulfato de Mg (0,1 g/L) {ativador enzimático} b) Caldo de cana-de-açúcar: não necessita diluição pois a cana sofre adição de água por aspersão na moenda para extração do açúcar, neste ponto o brix deve ficar entre 18-20 D = Brix do caldo x Volume do caldo - volume do caldo = Voluma de H2O a ser adicionada Brix desejado Ex.: Brix do caldo = 20 Volume = 50.000 L Brix desejado = 16º D = 20 x 50.000 – 50.000 = 12.500 L de H2O a ser adicionada para ter 16º Brix 16 Após fazer a diluição corrige-se o pH para 4,5 - 5,5 usando ácido sulfúrico, cítrico ou ainda suco de limão (caseiro) e colocam-se os nutrientes. DETERMINAÇÃO DE SÓLIDOS SOLÚVEIS TOTAIS POR REFRATOMETRIA 1) Preparo do mosto: a) Determinação de sólidos solúveis por refratometria - Para cada grau acima de 20 ºC subtrai-se 0,06 por grau; - Para cada grau abaixo de 20 ºC soma-se 0,06 por grau: Ex.: 20 ºBrix a 25ºC 5 x 0,06 = 0,3 20 ºBrix – 0,3 = 19,7 ºBrix 20 ºBrix a 15ºC 5 x 0,06 = 0,3 20 ºBrix + 0,3 = 20,3 ºBrix Um mosto inicialmente com 76 ºBrix preparar 300 ml de mosto com 16% de SST. 100 g melaço -------- 76 g SST X g --------------------- 16 g SST X = 21,05 g/100mL Para 300 mL = 63,15 g de mosto + 236,85 g de água RELACÃO ENTRE DIFERENTES GRAUS DE MEDIDA. 1 ºBrix corresponde a 0,54 ºBaumé 1 ºBaumé corresponde a 1,8 ºBrix 1 ºBrix corresponde a 0,85 ºBabo BRIX = % de sólidos solúveis existentes em uma solução de sacarose quimicamente pura.
  • 17. Fermentadores Prof. Raul Vicenzi 15 ELEMENTOS DE UM FERMENTÁDOR (BIOREATOR) O coração de qualquer processo fermentativo é sem dúvida o fermentador. Uma definição funcional para um fermentador seria dizer que consiste em um recipiente em que se mantém um ambiente favorável para que se desenvolva um determinado processo biológico. A palavra fermentador nos faz visualizar um recipiente de grande tamanho de aço inoxidável brilhante e com uma instrumentação muito sofisticada. Ainda que muitos fermentadores industriais são assim, outros importantes processos biológicos industriais, desenvolvidos em grande escala, são conduzidos em equipamentos muito menos sofisticados. Em alguns processos um fermentador pode consistir em um simples recipiente aberto, embora para processos cujas condições são muito sensíveis será necessário um sistema fechado e muito bem controlado capaz de manter um ambiente favorável. MEIO AMBIENTE As condições ambientais existentes dentro de um fermentador podem considerar-se sob três aspectos diferentes: condições biológicas, químicas e físicas. MEIO BIOLÓGICO Unicamente os microrganismos que contribuem para o processo em questão encontram-se presentes, enquanto que os não produtivos, destrutivos ou não desejáveis estejam excluídos do processo. Do ponto de vista de produção é importante também que os microrganismos desejados estejam presentes em quantidades suficientes para que o processo se desenvolva a um ritmo rentável. Um sistema que contenha somente o microrganismo desejado diz-se um sistema asséptico. A assepsia consegue-se, primeiro, esterilizando o meio, eliminando todos os organismos vivos, diz-se então esterilizado, segundo introduzindo o microrganismo desejado. O ato de introduzir o microrganismo desejado denomina-se inoculação. MEIO QUÍMICO Implica na composição do meio de crescimento microbiano, que deverá conter as concentrações adequadas de substratos ou nutrientes microbiológicos, assim como dos precursores sintéticos, livres de substâncias inibidoras e mantidas a um pH adequado. MEIO FÍSICO Refere-se fundamentalmente a temperatura do sistema cujo controle é muito importante quando se projeta um fermentador. Este parâmetro e a necessidade de manter a uniformidade das condições ao longo da fermentação, exigem um bom sistema de agitação, o que pode provocar por sua vez a ruptura dos organismos e de seus agregados. Quando se mantém um ambiente favorável os parâmetros ambientais não têm que necessariamente permanecerem constantes ao longo do tempo.
  • 18. Fermentadores Prof. Raul Vicenzi 16 Fermentação por batelada - características: v Diferentes fases de crescimento; v Diferentes condições ótimas; v Fermentação parece estar programada de acordo com a disponibilidade de nutrientes; v pH e temperatura oscilam ao longo do tempo, para que apareçam de acordo com estas trocas as sucessivas fases de crescimento PRINCIPAIS TIPOS DE FERMENTADORES Os fermentadores classificam-se em dois grandes grupos: v Fermentadores de cultivo disperso: neste sistema os microrganismos estão imersos no meio de cultivo e seguem os movimentos dos nutrientes líquidos. O fermentador mais simples consiste em um tanque aberto no qual o microrganismo se dispersa no meio líquido. Estes fermentadores forma utilizados de geração em geração com muito êxito na indústria cervejeira já que ao formar-se na fase anaeróbica da fermentação, uma capa de espuma que contém CO2 e leveduras, impedindo que o ar penetre no interior do tanque. Para controlar a temperatura durante a fermentação se pode colocar tubos refrigerantes. São muito utilizados no tratamento biológico de águas residuais em fluxo lento, onde a superfície do líquido permite que se dissolva o O2 do ar e libere o CO2. Estes efeitos podem ser acelerados com a agitação do líquido que aumenta a transferência de gases e mantém a homogeneidade. Nos sistemas anaeróbios os próprios gases da fermentação podem proporcionar a agitação, através do desenho do fermentador (cônico/cerveja) ou por meio mecânico (bombas de recirculação). v Fermentadores de cultivo imobilizado: nos sistemas imobilizados o microrganismo se desenvolve sob forma de uma lâmina ou capa disposta sobre uma superfície que está em contato com o meio nutritivo. Em laboratórios se utiliza o “cultivo em superfície” (placas). Inicialmente a produção de penicilina era feira em garrafas que eram introduzidas em uma incubadora. Atualmente se utilizada o cultivo em superfície na fermentação do ácido cítrico (Aspergillus niger), que se cultiva em uma superfície com um meio adequado contendo melaço em bandejas de pouca profundidade, colocadas em estantes à temperatura constante e com circulação de ar freqüente. Também e pode desenvolver películas microbianas sobre uma superfície de meio sólida adequada. Este meio pode ser de leito fixo, em pedras, plástico particulado, lâminas de plástico onduladas, através dos quais se faz passar o meio líquido sobre a capa de microbiana da superfície. v Na prática, porém, ocorre que nos sistemas de cultivo disperso também aparece uma capa sobre a superfície do recipiente, e no cultivo imobilizado existe um certo numero de microrganismos dispersos no meio de cultivo.
  • 19. Fermentadores Prof. Raul Vicenzi 17 Qualquer processo fermentativo divide-se em uma etapa puramente fermentativa e outra de recuperação do(s) produto(s), conforme o esquema abaixo: Esterilizador Refrigeração Com ou sem ruptura celular Formulação Armazena,mento de Matérias-primas Inóculo Volume: 1 a 2 litros Preparação de Meios Fermentador de produção Tanque de Semeadura (pé-de-cuba) Separação de células Etapas de Recuperação do Produto Envasamento e Armazenamento PRODUTO Tratamento de Efluentes Utilização de Subprodutos - água - ar - vapor Água do Processo Ar Estéril Vapor Energia Inóculo Preparado 1:10
  • 20. Esterilização na indústria fermentativa Prof. Raul Vicenzi 18 ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTO, MEIOS DE CULTURA E AR Introdução A esterilização implica a destruição, inativação ou remoção de toda forma de vida microbiana. Isso quer dizer que a esterilização provoca nos microrganismos uma perda irreversivel da capacidade de reprodução no ambiente considerado. Não implica, entretanto, a inativação total das enzimas celulares, toxinas, etc. Antes de entrarmos na discussão dos métodos, é conveniente fazermos algumas considerações em torno dos mecanismos de esterilização e das características das populações microbianas. O mecanismo letal varia conforme o processo de esterilização empregado. O efeito final, entretanto, é o mesmo. Deve ocorrer a destruição e/ou inativação da(s) enzimaas) envolvida(s) em processos vitais para o microrganismo. Teoricamente, basta que o agente esterilizante bloqueie uma reação enzimática essencial ou destrua uma molécula vital. Na prática, entretanto, agentes com ação tão especifica não encontram aplicação como esterilizantes, por vários motivos: A heterogeneidade da população microbiana; a possibilidade da existência de microrganismos com capacidade de utilizar outras “rotas metabólicas” para vencer o bloqueio estabelecido; a dificuldade do agente em atingir um alvo muito específico; etc., podem ser mencionados como fatores que justificam a utilização de agentes capazes de atingir o microrganismo de um modo mais grosseiro e inespecífico. Principalmente no caso da esterilização de equipamentos industriais, procura-se utilizar processos capazes de danificar generalizadamente a célula, em vez de se procurar um ponto específico de sua estrutura metabólica. Outra consideração importante, no caso da esterilização de equipamentos, é a cessação do efeito esterilizante no final do processo de esterilização. Em outras palavras, o agente ou condição esterilizante deve atuar eficientemente durante o processo de esterilização. Terminada a esterilização, não deve haver ação residual. No caso de fermentação industrial, por exemplo, uma possível ação residual pode ser tão ou mais prejudicial que a presença de certos contaminantes. Essas considerações ajudam a apontar os processos físicos como os métodos de escolha na esterilização de equipamentos. MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO Físicos Químicos Calor: - Seco: Flambagem ; ar quente - Úmido: vapor fluente, vapor sob pressão; tindalização. Radiação: - Ultravioleta - Ionizantes (RX e ã) Filtração : Membranas Líquidos, Gases e vapores Esterilizantes gasosos: Óxido de etileno (mais eficiente que os demais; utilizado em câmaras de esterilização) Formaldeído – mais comum â-propiolactona- carcinogência Ácido peracético
  • 21. Esterilização na indústria fermentativa Prof. Raul Vicenzi 19 A escolha do método depende das características dos produtos a serem esterilizado e do custo do processo. Quando se usa agentes químicos: tempo de contato Quando se usa calor: tempo e a temperatura de contato OBS.: O vapor direto acarreta um aumento no volume do mosto MECANISMOS DE ESTERILIZACÃO Se bem que os métodos usuais de esterilização tenham uma ação generalizada sobre a célula, o mecanismo pelo qual isso é conseguido varia conforme o agente empregado. No caso do calor, sabe-se, desde os tempos de Koch, que o mecanismo de destruição dos microrganismos pelo calor seco não é o mesmo que ocorre quando se utiliza vapor. Exceto em casos em que haja uma destruição física do microrganismo, como é o caso da flambagem do equipamento a ser esterilizado, o mecanismo de esterilização não está bem elucidado. Em alguns casos, a ruptura da parede celular e a vacuolização da célula são aparentes e poderiam ser interpretadas como oriundas da atuação de forças osmóticas. A adsorção de corantes pelas células, a incapacidade de reprodução e, no caso de microrganismos móveis e a perda da motilidade, são características que auxiliam na constatação da perda de viabilidade de células individuais. Enquanto que a inativação pelo calor seco é, essencialmente, um processo oxidativo, o uso de vapor causa uma coagulação das proteínas celulares com prejuízo para a organização estrutural do microrganismo, afetando a sua competência fisiológica. TABELA 1 - Efeito da temperatura sobre o tempo necessário para destruir esporos bacterianos de fermentação simples em meio com concentração inicial de 1,6 x 105 esporos/mL TEMPERATURA (ºC) TEMPO (minutos) 100 1200 105 600 110 190 115 7 120 19 125 7 130 3 135 1 Tempo de esterilização corresponde ao tempo em que o material foi submetido aquela temperatura específica e não ao tempo total do processo, que deve incluir o tempo de aquecimento e resfriamento. DESNATURAÇÃO DE PROTEÍNAS Além das estruturas primária, secundária e terciária, as moléculas de proteína podem ser constituídas por mais de uma cadeia de polipeptídios. A conformação estrutural da molécula protéica
  • 22. Esterilização na indústria fermentativa Prof. Raul Vicenzi 20 é estabilizada por ligações covalentes e não-covalentes. Essas ligações reduzem a flexibilidade das cadeias polipeptídicas, garantindo sua disposição de uma forma ordenada, compacta e, conseqüentemente, de baixa entropia, em vez de uma associação ao acaso. Entre as ligações covalentes, o tipo de ocorrência mais geral é a ligação dissulfeto As ligações não-covalentes podem ser pontes de hidrogênio, ligações hidrofóbicas e iônicas. As ligações hidrofóbicas são as que mais contribuem para a estabilização da estrutura protéica, pois de um modo geral, 40% dos resíduos de aminoácidos de uma proteína possuem ramificações não-polares. Uma alteração estrutural da molécula de proteína é, normalmente, acompanhada de uma perda de atividade biológica, pois a ação de enzimas pode ser explicada por uma perturbação conformacional especifica induzida pelo substrato no centro ativo da enzima. Considerando-se que as células de microrganismos podem conter, normalmente, de 40 a 60% de seu peso seco em proteínas, e considerando-se, ainda, as funções metabólicas e/ou estruturais desempenhadas por essas proteínas na célula microbiana, pode-se perceber, com facilidade, o efeito que agentes ou condições capazes de desorganizar estruturalmente as proteínas poderão exercer sobre a célula. ALTERAÇÃO DNA Se, de um lado, agentes que atuam sobre as proteínas são capazes de comprometer diretamente a competência fisiológica, agentes capazes de causar alterações no material genético do microrganismo podem provocar o aparecimento de mutações letais. Donde a possibilidade de se utilizarem, na esterilização, substâncias ou condições que apresentem maior afinidade pelo ácido desoxirribonucléico (DNA). - Agentes químicos como propionolactona, ácido nitroso, etc., agem sobre o material genético das células, causando alterações que terão conseqüências sobre as características fisiológicas do microrganismo. - Radiações – Fazendo-se incidir uma radiação sobre microrganismos, os componentes celulares poderão absorver energia radiante. O efeito letal das radiações é uma demonstração da presença, na célula viva, de moléculas capazes de absorvera energia radiante. Proteínas e ácidos nucléicos, constituintes essenciais da matéria viva possuem estruturas que absorvem principalmente luz ultravioleta. As alterações fotoquímicas que ocorrem, em virtude da absorção de luz ultravioleta, são muito prejudiciais ás células. POPULAÇÃO MICROBIANA Ao tratar de esterilização, temos de levar em conta, também, as características dos microrganismos contaminantes do equipamento a esterilizar. No caso de existirem no equipamento apenas formas vegetativas de microrganismos, e se o meio em que se encontram for um meio que não as abrigue e proteja da ação do agente esterilizante, e mais ainda, se pudermos estar certos de que o agente esterilizante será capaz de atuar sobre as células microbianas em condições favoráveis e por tempo suficiente, então o problema de esterilização será relativamente simples.
  • 23. Esterilização na indústria fermentativa Prof. Raul Vicenzi 21 FIGURA 1 - Esterilização de um meio de cultura em autoclave a 121 ºC por 20 minutos. O tempo total de esterilização é 100 minutos. ESTERILIZAÇÃO POR AGENTES FÍSICOS CALOR SECO Ø calor seco mata os microrganismos por oxidação dos componentes celulares. O ar seco não é um bom condutor de calor e sua ação não é tão enérgica quanto a do vapor. Por esse motivo é necessário uma temperatura e tempo maiores de esterilização. Ø o emprego do calor seco ou ar quente, é recomendado quando o contato direto ou completo do vapor sobre pressão com o material é indesejável ou improvável, que é o caso de vidraria, óleos, pós e substâncias similares. A esterilização pelo calor seco consiste em submeter o equipamento a ser esterilizado a uma temperatura tal que, durante o período de aquecimento, haja inativação dos microrganismos presentes. A maior resistência demonstrada por microrganismos ao calor seco parece depender de um endurecimento da camada mais externa da célula por meio de coagulação das protemas, dificultando a penetração do calor no interior da célula propriamente dita e ulterior coagulação das proteínas plasmáticas. Devido à muito menor capacidade de penetração do calor seco, é necessário aquecer o equipamento a ser esterilizado a temperaturas mais altas por tempo mais prolongado, o que torna esse método inadequado quando materiais como papel, algodão, plásticos, etc., estão presentes. Populações homogêneas de esporos apresentam uma relação linear de inativação com relação ao tempo de exposição a 125 ºC. A não-linearidade que ocorre com populações naturais, pode ser atribuída a uma heterogeneidade da população. As relações não-lineares obtidas com populações naturais podem ser reproduzidas por misturas adequadas de esporos com resistências térmicas diferentes, isolados daquelas mesmas populações. Aliás, essa heterogeneidade das populações
  • 24. Esterilização na indústria fermentativa Prof. Raul Vicenzi 22 naturais pode ser devida não só à presença de esporos de espécies diferentes como também a diferentes graus de resistência térmica entre esporos de uma mesma espécie. A temperatura empregada tem sido 125 ºC e é comum cotar-se a resistência térmica de um microrganismo em relação ao D125. A desorganização molecular que ocorre nas células, devido à exposição a temperaturas elevadas, pode se dar dos seguintes modos: a) ativação direta das moléculas pela energia térmica, com alteração conformacional por quebra de ligações intramoleculares e intervenção subseqüente de outras moléculas; b) reação de moléculas complexas com oxigênio, água ou vapor de água (no caso de esterilização pelo calor úmido). A exigência básica da esterilização pelo calor seco é que todo o material seja sujeito à temperatura esterilizante. As únicas causas possíveis de fracasso na esterilização são o controle defeituoso da temperatura; a não penetração do calor; e a presença de microrganismos com resistência térmica superior á esperada. CALOR ÚMIDO Ø calor úmido mata os microrganismos por desnaturação protéica, ou seja: pela coagulação das proteínas e enzimas celulares, e também a fusão dos lipídeos da membrana celular; Ø quanto maior a temperatura menor o tempo necessário; Ø Para destruir esporos temos que submeter este vapor de água a uma pressão positiva para alcançarmos as temperaturas de trabalho; Sempre que possível usa-se vapor para a esterilização, pelo seu alto conteúdo de calor por unidade de peso ou de volume; porque cede facilmente calor a uma temperatura constante e controlável; por ser de fácil produção e distribuição; e porque, mesmo sendo de aquecimento rápido, a velocidade de aquecimento e a temperatura final do equipamento podem ser controladas. TABELA 2 - Relação entre a pressão de vapor de água em diferentes pressões Pressão de vapor da água (atm) Temperatura 0 100,0 0,34 109,0 0,68 115,0 1,00 121,0 1,36 126,5 Obs.: - Para assegurar a temperatura pela pressão de trabalho precisamos ter certeza de que todo o ar foi expulso, primeiro porque o ar não é bom condutor de calor, logo o calor não penetra no material a ser esterilizado. Segundo a temperatura do ar aquecido a uma pressão é inferior a temperatura do vapor aquecido a mesma pressão. Causas da inativação térmica de bactérias pelo calor úmido Os mecanismos propostos para explicar a influência letal do calor úmido sobre as bactérias são: (a) coagulação de proteínas; (b) inativação de enzimas; (c) desorganização dos lipídeos celulares; (d) desorganização do aparelho genético; (e) ruptura do RNA.
  • 25. Esterilização na indústria fermentativa Prof. Raul Vicenzi 23 A morte das células expostas ao calor é exponencial. A base bioquímica desse fenômeno é difícil de ser explicada em termos de acontecimentos específicos na célula. O calor úmido age sobre vários componentes celulares e, na célula, pode-se observar uma série de efeitos. Inativação térmica dos esporos Os esporos são dotados de uma camada interna de mucopeptídeo recoberta por uma capa protéica rica em cisteína. As seguintes teorias tentam explicar a termorresistência dos esporos: impermeabilidade do esporo; enzimas em formas inativas estabilizadas; desidratação do material protéico, com estabilização conseqüente da maior interaproximação dos radicais hidrofóbicos e imobilização iônica. A inativação dos esporos em presença de vapor de água deve-se à atividade da água e não propriamente ao calor latente do vapor. Esse fato mostra que os altos coeficientes de temperatura, característicos da inativação térmica de esporos. só podem ser devidos a processos de coagulação de proteínas ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS POR RADIAÇÕES UV E IONIZANTES Os princípios básicos da utilização da radiação UV são a redução de microrganismos presentes no ar e a destruição de células depositadas na superfície do equipamento e expostas à radiação. A radiação UV tem sido empregada como agente auxiliar para diminuir os níveis de contaminação. A ação de radiações ionizantes (raios gama) sobre os microrganismos se manifesta como um uma inibição do poder de multiplicação dos mesmos. ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS POR AGENTES QUÍMICOS Apresenta a vantagem de ser feita a temperatura inferior a 50ºC. Os fatores que influenciam na eficiência da esterilização são: tempo de contato, temperatura, pH, matéria orgânica, estabilidade ao oxigênio umidade, etc. detergentes, líquidos (ácidos e álcalis, glutaraldeído, formaldeído, iodófors, ácido peracético) Gases e vapores (ozônio, brometo de metila, formaldeído, â-propionolactona, óxido de etileno, ácido peracético) ESTERILIZAÇÃO DO MEIO DE CULTURA De acordo com um conceito bem amplo, a esterilização de um meio é a operação que tem por finalidade remover ou destruir todas as formas de vida, animal ou vegetal, macro ou microscópicas, saprófita ou não, existentes no meio considerado. O grau de esterilização dos meios de fermentação varia conforme o processo a que se destina. Algumas vezes é totalmente dispensável (fermentação láctica de hortaliças e polvilho; tratamento biológicos de resíduos); realizada de forma incipiente (fermentação alcoólica; produção de leveduras para panificação; fermentação acética do vinagre); realizada com alto grau de exigência (produção de antibióticos, enzimas, vitaminas, acetona, butanol). Em ensaios laboratoriais sempre é necessário (devido ao uso de culturas puras) • Em plantas industriais o calor úmido é a principal forma de se efetuar a esterilização. Pode
  • 26. Esterilização na indústria fermentativa Prof. Raul Vicenzi 24 ser feita nos próprios recipientes destinados a fermentação (processo descontínuo) ou em separado (processo contínuo) Ø ESTERILIZAÇÃO EM BATELADA: • Vários meios de cultura são esterilizados no fermentador a 121 ºC (para destruir esporos), o tempo é calculado em função dos constituintes do mosto(pH, material em suspensão, etc) e do tamanho do fermentador. • Esterilizar ás válvulas e eletrodos e outros equipamentos que entram em contato direto com o fermentador • Método indireto - injetar vapor no fermentador através de camisa ou da serpentina; • Método direto - injetar vapor direto na solução nutriente, assim o vapor deve estar livre de aditivos químicos OBS.: O vapor gerado pela indústria normalmente contém substâncias potencialmente tóxicas aos microrganismos, derivadas de anticorrosivos utilizados no processo de geração de vapor. Com injeção direta de vapor no meio de cultura o volume deste aumentará, pois uma parte do vapor se condensa aumentando o volume do líquido dentro do fermentados. Vantagem a) tem a vantagem de esterilizar o fermentador e o meio simultaneamente, evitando perigos de contaminações; Desvantagem a) Manutenção de temperaturas altas por períodos longos, favorecendo possíveis alterações no meio; b) Consumo elevado de vapor e água de resfriamento; c) Problemas de corrosão pelo contato do equipamento com o meio aquecido. d) Elevado tempo ocioso do equipamento; e) interações químicas com nutrientes Ø ESTERILIZAÇÃO CONTINUA • As principais desvantagens apresentas podem ser evitadas pela esterilização contínua; melhor controle de temperatura; temperaturas mais elevadas diminui o tempo da operação; Fornece meio esterilizados para fermentadores de vários tamanhos • Etapa preliminar obrigatória nos processos fermentativos contínuos, também tem valor nos processos em batelada, pois diminui o tempo de esterilização e a área física necessária para o processo, devido a relação exponencial entre taxa de morte e temperatura tomando bem menor o tempo necessário para a destruição de todos os microrganismos quando temperaturas maiores são utilizadas; • Na esterilização em batelada são necessários 30 a 60 minutos a 121 ºC, a esterilização contínua normalmente é realizada em 30 a 120 segundos a 140 ºC; • Meio de cultura torna-se diluído pois a condensação do vapor aumenta o volume do líquido, para resolver este problema o meio aquecido é bombeado através de uma válvula de expansão eo condensado é removido por uma bomba de vácuo até que o meio de cultura fique com a mesma concentração de antes da esterilização.
  • 27. Esterilização na indústria fermentativa Prof. Raul Vicenzi 25 • Pode se feita pela injeção direta de vapor ou por meio de trocadores de calor. • Em certos casos a pasteurização já pé suficiente para eliminar grande parte do flora microbiana. É uma operação rápida utilizando temperaturas próximas de 100 ºC seguida de resfriamento. Em meio ácidos equivale a uma esterilização • Para pequenas quantidade de meio pode-se lançar mão da tindalização. FIGURA 2 - Esquema de esterilização contínua do meio de cultura em trocadores de calor DESTRUIÇÃO DE NUTRIENTES A esterilização do meio pelo calor acarreta alterações na sua composição química. A experiência mostra que, quanto mais elevada for a temperatura de esterilização de um dado meio, menor será a destruição de nutrientes e, conseqüentemente, melhores serão os resultados da fermentação posterior. Esta menor destruição de nutrientes é uma conseqüência de fato – observada experimentalmente – de ser a energia de ativação de destruição térmica dos microrganismos maior do que a de destruição térmica dos nutrientes. Essa afirmativa é de importância prática, tanto na esterilização de meios de fermentação como na esterilização de alimentos. ESTERILIZAÇÃO DO AR As fermentações aeróbias, com o microrganismo em suspensão, constituem os processos fermentativos de maior importância industrial atualmente. Em tais fermentações a quantidade de ar introduzida no sistema é grande e é perfeitamente aceitável, que haja grande preocupação quanto a esterilização do ar a ser admitido nos fermentadores. Tais cuidados devem ser tomados principalmente nas horas iniciais da fermentação. - A maior parte dos processos fermentativos é conduzido com agitação vigorosa, e o ar fornecido ao fermentador deve ser estéril. - O número de partículas e microrganismos depende da localização da indústria, do movimento do ar e do tratamento prévio que o ar foi submetido.
  • 28. Esterilização na indústria fermentativa Prof. Raul Vicenzi 26 MÉTODOS PARA ESTERILIZAÇÃO DO AR Calor seco - normalmente antieconômica ou de difícil realização; Radiações – Apenas as radiações UV poderiam ter aplicação prática, porém pouco usada devido ao grande tempo de exposição. Pode ser usada em pequenas instalações (laboratórios, pesquisa). Atua mais como desinfetante. Filtração –É sem dúvida o processo mais importante por ser o de maior aplicação na industria. Filtros feitos de lã de vidro, acetato de celulose, etc Os filtros pode ser de dois tipos principais: Filtros que apresentam poros - retenção mecânica dos microrganismos (cartuchos de membranas de ésteres de celulose, nylon); Filtros de camadas de material fibroso (lã-de-vidro, ) - Atua na combinação de vários efeitos físicos: inércia, bloqueio, difusão, separação por gravidade e atração eletrostática.
  • 29. Metabolismo e cinética de crescimento microbiano Prof. Raul Vicenzi 27 CRESCIMENTO CELULAR O crescimento dos microrganismos é uma parte integral de quase todos os processos de fermentação. Sabe-se que as bactérias se reproduzem por divisão binária, produzindo duas células de mesmo tamanho, entretanto a reprodução de muitas leveduras se dá por gemação;os mofos crescem por extensão das hifas e a morfologia de seu micélio pode variar em função do meio ambiente. quando um fungo cresce na superfície de um meio sólido produz uma rede miceliana , cuja natureza reflete a natureza do meio. Nos cultivos submersos, as células fúngicas podem crescer unidas a partículas de nutrientes suspensas na forma de micélio filamentoso difuso ou como massa densa. A morfologia e crescimento influem na velocidade de crescimento e na formação de produtos Quando um microrganismo é inoculado em um meio de volume e composição conhecidos, o cultivo passa por uma série de fases, como se pode observar na figura 1. Depois da inoculação, existe uma fase de latência, em que o microrganismo se adapta as condições do meio. Após um certo período de tempo em que a velocidade de crescimento das células aumenta gradualmente, as células crescem a uma velocidade constante máxima ; esta fase se denomina exponencial ou logarítmica. À medida que o crescimento continua, os nutrientes se vão esgotando e os produtos vão sendo excretados pelo organismo, a velocidade de crescimento diminui e finalmente o crescimento cessa, devido freqüentemente ao esgotamento de um nutriente ou pelo acumulo de algum produto tóxico; esta fase se denomina estacionária. FIGURA 3 – Crescimento de um microorganismo em um cultivo desontínuo FATORES QUE INFLUEM NA VELOCIDADE DE CRESCIMENTO A velocidade de crescimento varia com o tipo de célula microbiana e também em função das condições físico-químicas do meio ambiente. Em geral, o tempo para que se duplique a biomassa aumenta com a complexidade do microrganismo, de forma que os tempos de duplicação médio para as células animais e vegetal são substancialmente maiores que os de mofos e leveduras, que por sua vez são maiores que das bactérias.
  • 30. Metabolismo e cinética de crescimento microbiano Prof. Raul Vicenzi 28 O crescimento celular varia com a temperatura. A maioria dos microrganismos cresce entre 25 e 35 ºC. Dentro deste espaço o crescimento aumenta com o aumento da temperatura até um valor máximo, acima do qual a velocidade cai rapidamente devido ao incremento da taxa de morte microbiana. O pH influi no crescimento da mesma forma que na atividade enzimática. A maioria dos microrganismos cresce em uma escala de pH variando de 3 a 4. A velocidade de crescimento da célula microbiana depende da atividade de água (Aw) e da umidade relativa. As bactérias necessitam uma Aw 0,95 enquanto os mofos podem crescer em valores de atividade de água menores, de até 0,7 como mínimas. Como em qualquer reação química, a velocidade de crescimento depende da concentração de nutrientes químicos, e pode ser descrita pela equação de Monod. Os valores típicos de Ks para as diversas fontes de carbono estão compreendidos entre 1 e 10 mg/dm3 . As células podem crescer a velocidades próxima as ìmax quando a fonte de carbono limitante é maior que 10 Ks ou 10 a 100 mg/dm3 . As concentrações de carboidratos elevadas podem inibir o crescimento devido ao efeito osmótico que tem uma influencia maior sobre as bactérias do que sobre os mofos Foi comprovado que a quantidade de massa celular total, formada durante o crescimento celular, é freqüentemente proporcional a quantidade de substrato utilizado. Biomassa produzida (g) ãx/s = ------------------------------ ãx/s =coeficiente de rendimento de biomassa Substrato consumido (g) METABOLISMO MICROBIANO O crescimento microbiano depende da capacidade da célula para utilizar os nutrientes de meio ambiente e sintetizar os compostos macromoleculares das estruturas celulares e também os principais compostos de baixo peso molecular, necessário para a atividade celular. O metabolismo intermediário inclui as reações que transformam os compostos de carbono e nitrogênio que entram na célula em novo material celular ou em produtos que são excretados. A síntese desses compostos necessita energia e a maioria das células utilizada nas fermentações, são heterotróficas e obtém sua energia a partir da quebra de compostos orgânicos. Nos processos respiratórios ou aeróbios, os microrganismos são capazes de oxidar completamente alguns dos substratos a CO2 e H2O, obtendo o máximo de energia para a conversão dos substratos remanescentes em nova massa celular. No metabolismo fermentativo ou anaeróbio, as células são menos eficazes para converter os substratos orgânicos em material celular e usualmente excretam intermediários degradados parcialmente. O crescimento de urna cultura microbiana pode ser dividido em fases ou estágios. Após a inoculação de uma cultura em um meio nutriente existe um período durante o qual o crescimento parece não ocorrer; este período refere-se à fase lag e pode ser considerado como uma fase de adaptação. Seguindo um período durante o qual a taxa de crescimento das células aumenta gradualmente, as células crescem a uma taxa constante, este período é conhecido como fase exponencial. Quando o crescimento diminui ou cessa e as células entram fase estacionária. Após um
  • 31. Metabolismo e cinética de crescimento microbiano Prof. Raul Vicenzi 29 longo período de tempo o número de células viáveis decresce e a cultura entra na fase de morte ou declínio. Tanto quanto esta cinética de crescimento, o comportamento de uma cultura pode ser descrito de acordo com os produtos, os quais são gerados durante os estágios da curva de crescimento. Quando um microrganismo é inoculado em um meio rico em nutrientes, a velocidade da divisão celular, e portanto a produção de biomassa, varia de acordo com uma seqüência característica. A fase lag pode virtualmente ser eliminada aumentando o tamanho do inóculo e otimizando as condições físicas dentro do fermentador. Em um processo industrial a duração da fermentação contribui pra o custo do produto, logo uma fase lag mínima é aconselhável. FIGURA 4. Curva de crescimento de biomassa e consumo de glicose em um cultivo em batelada. Quando um microrganismo cresce em um ambiente no qual todos os seus nutrientes essenciais estão em excesso, esses nutrientes se transformam em produtos finais do metabolismo energético, em calor, ou em compostos requeridos para a reprodução de novas células. Durante a fase exponencial de crescimento a divisão celular ou velocidade de aumento da biomassa chega a ser máxima e os produtos gerados são essencialmente para o crescimento das células e incluem: aminoácidos, nucleotídeos, proteínas, ácidos nucléicos, lipídios, carboidratos, etc. Estes produtos são conhecidos como os primeiros produtos do metabolismo ou METABOLITOS PRIMÁRIOS e a fase a qual eles são produzidos (fase log ou exponencial) como trofofase. Também se inclui nesta categoria a biomassa celular que pode ser considerada como o metabólito mais primário. Muitos produtos do metabolismo primário são considerados economicamente importantes e são produzidos por fermentação. Durante a desaceleração e na fase estacionária, algumas culturas microbianas sintetizam compostos os quais não são produzidos durante a trofofase e os quais parecem não ter nenhuma função óbvia no metabolismo celular. A estes compostos nos referimos como METABÔLITOS SECUNDÁRIOS e a fase na qual eles são produzidos (equivalente à fase estacionária) como idiofase. É importante salientar que os metabólitos secundários ocorrem em cultivos contínuos a
  • 32. Metabolismo e cinética de crescimento microbiano Prof. Raul Vicenzi 30 baixas taxas de crescimento sendo uma propriedade destas, baixas taxas de crescimento, e também, da fase onde não tem crescimento celular. TABELA 3. Produtos do metabolismo primário microbiano e sua significância comercial. Metabolismo Primário Significância Comercial Etanol Ingrediente ativo em bebidas alcoólicas, usado como combustível em motores quando misturado ao petróleo Ácido Cítrico Vários usos na indústria alimentar Ácido glutâmico Intensificador de Flavor Lisina Suplemento alimentar Nucleotídeos Intensificador de Flavor Fenilalanina Precursor do Aspartame - Adoçante Polissacarídeos Aplicação na indústria alimentar Vitaminas Suplementa Alimentar Fonte: Stanbury, Whitaker & Hall in Principles of Fermentation Technology. 1995. Os metabólitos secundários são compostos que não são necessários para a biossíntese celular, não tendo um papel direto no metabolismo energético. A biossíntese destes compostos está intimamente ligada com o metabolismo primário das células que os produzem, já que normalmente seus precursores são metabólitos primários ou modificados, como ácidos orgânicos, aminoácidos, derivados de açúcares e bases nitrogenadas. Um conceito apropriado para os metabólitos secundários é “são os compostos não essenciais para o crescimento exponencial” (Wiseman, A.) Os metabólitos secundários mais importantes do ponto de vista comercial são os antibióticos, entre eles a Penicilina, cuja produção anual chega a 10.000 ton/ano. As toxinas e os alcalóides representam o resto dos metabólitos secundários de importância industrial. Quando se observa que microrganismos crescem a taxas relativamente baixas de crescimento no seu meio ambiente natural, isto sugere indicio de que é a idiofase que prevalece sobre a trofofase, a qual pode ser mais uma das propriedades da cultura de microrganismos. METABOLISMO ENERGÉTICO A energia necessária aos microrganismos pode ser fornecida pela luz (organismos fototróficos), ou pela oxidação de substâncias químicas (organismos quimiorganotróficos). Nos dois casos a energia vai ser estocada pela forma de energia de ligação química, biologicamente utilizável. Trata-se essencialmente da ligação anidridofosfórica do trifosfato de adenosina (ATP), formada pela fosforilação do difosfato de adenosina (ADP). ORGANISMOS QUIMIORGANOTRÓFICOS A maioria das bactérias, leveduras e mofos são incapazes de efetuar a fotossíntese, utilizam a energia liberada no decorrer das reações químicas de oxidação. São chamadas quimiorganotróficas. As reações de oxidação podem ser efetuadas de vários modos:
  • 33. Metabolismo e cinética de crescimento microbiano Prof. Raul Vicenzi 31 - Perda de elétron: Fe++ Fe+++ + e- + energia - Desidrogenação: R-CH2OH R-CHO + 2H+ + 2e- + energia - Hidratação-desidrogenação: R-CHO + H2O R-COOH + 2H+ 2e- + Energia - Descarboxilação-desidrogenação: R-CO-COOH + H20 R-COOH + CO2 + 2H+ + 2e- + Energia Em todos os casos há perda de elétrons freqüentemente acoplada a uma perda de prótons. Estes elétrons e prótons, após transferência mais ou menos longa, feita por intermédio de uma cadeia de oxiredução, vão reduzir um aceptor final. Os microrganismos quimiorganotróficos tiram sua energia da oxidação de substâncias orgânicas elaboradas, as quais devem obrigatoriamente encontrar-se no meio, logo, trata-se de microrganismos heterotróficos. A grande maioria dos microrganismos que intervém na biotecnologia faz parte deste grupo. ACEPTOR FINAL DE ELÉTRONS O sistema de transporte de elétrons é mais ou menos complexo e recorre as enzimas (desidrogenases, citocromos redutases, etc.) e co-enzimas (FAD, NAD, NADP, citocromos, etc.) que são intermediários aceptores de elétrons (e de prótons); trata-se de um seguimento de reações acopladas com oxiredução. No final desta cadeia, elétrons (e prótons) servem para reduzir um aceptor final que pode ser de diversas naturezas: Oxigênio molecular, composto mineral oxidado ou composto intermediário do metabolismo. Existe, também, um mecanismo de eliminação de elétrons e prótons próprio de numerosas bactérias anaeróbias, sob a forma de hidrogênio, devido a hidrogenase. Se o substrato for completamente oxidado, diz-se que há respiração (fala-se às vezes, de via oxidativa). Se o substrato for parcialmente oxidado e, por isso, incompletamente degradado, o que acarreta a formação de metabólitos, diz-se que há fermentação. A fermentação traz geralmente o nome da(s) substância(s) produzida(s) ou da mais abundante se a produção for complexa. RESPIRAÇÃO AERÓBIA Existem vários mecanismos de respiração aeróbia. O fato comum entre eles é que o aceptor final de prótons é o oxigênio do ar e não podem intervir senão quando os microrganismos são cultivados em condições de aerobiose. Para cada par de prótons transformados em água, há formação de 3 moléculas de ATP, podendo às vezes haver uma oxidação direta. Esta via leva a formação de peróxido de hidrogênio (H202) que é tóxico para célula; exceto se esta possuir catalase, enzima capaz de decompor o H2O2. Quando um microrganismo possui esta via, e não tem catalase, é morto pelo oxigênio do ar, sendo portanto, um anaeróbio estrito.
  • 34. Metabolismo e cinética de crescimento microbiano Prof. Raul Vicenzi 32 FERMENTAÇÃO / RESPIRAÇÃO Na fermentação propriamente dita, uma substância orgânica originária da degradação do substrato serve como aceptor de elétrons (e de prótons). De fato, pode-se considerar que é a mesma substância que serve, ao mesmo tempo, de doador e aceptor. Numerosas fermentações podem ser efetuadas em anaerobiose, pois todos os prótons liberados servem para reduzir um substrato orgânico; outras devem ser efetuadas em aerobiose, pois pelo menos uma parte dos prótons liberados servem para reduzir o oxigênio. CINÉTICA DO CRESCIMENTO MICROBIANO Na fase logarítmica podemos dizer que dobram por intervalo de tempo: • O número de células (bactérias e leveduras): • A biomassa (actomicetos e fungos). Ø A velocidade de crescimento se mantém constante durante a fase logarítmica, ainda que o meio se altere pelo consumo de substrato e excreção de metabólitos. Ø A velocidade de crescimento independe da concentração do substrato, pois um excesso de substrato está presente. • O substrato limitante é a substância que pela mudança de sua concentraçao promove: • mudanças na velocidade de crescimento do microrganismo • mudanças na velocidade de consumo do substrato • mudança na velocidade de formação do produto. Na pratica podemos dizer que todo o substrato é limitante. O processo industrial é interrompido ao final da fase logarítmica ou antes da fase de declínio, depende se o processo é associado ou não associado. A taxa de aumento da biomassa está relacionada com a velocidade específica de crescimento (ì) e a concentração da biomassa (X) expressa em g/L. dx ------- = ìX , onde dt ì = velocidade máxima da biomassa X = concentração de biomassa Ø A taxa do aumento do número de células está relacionada com a velocidade específica de crescimento e com a densidade celuIar (N) expressa em células/L. dN ------- = ìN , onde N = densidade celular dt Ø O tempo de geração (G) é uma constante da cepa da célula e depende das condições de cultivo. É o espaço de tempo necessário para que uma célula se duplique. Quando o microrganismo está na fase exponencial o tempo de geração é constante e dado por:
  • 35. Metabolismo e cinética de crescimento microbiano Prof. Raul Vicenzi 33 t t G = --- = -------------------- z 3,322 log Nf/Ni METABOLISMO MICROBIANO A síntese do produto se dá no interior da célula, para que o substrato seja convertido em produto, ele deve entrar na célula e ser biotransformado por uma seqüência específica de enzimas. Quanto mais complexo o produto, maior será o número de enzimas envolvidas no metabolismo. Esquema simplificado do metabolismo celular. S ⇒ [ X – P ] ⇒ P ENTRADA DO PROCESSO: transporte do substrato para dentro da célula METABOLISMO - TRANSFORMACÃO: é o que diferencia o processo químico do fermentativo. Às vezes X =P. SAIDA DO PROCESSO: liberação do produto da enzima, podendo ficar intra ou extracelular. S = concentração do substrato em g/L X = concentração de células em g/L P = concentração do produto em g/L ou mg/L VELOCIDADE DE FORMAÇÃO DE CÉLULAS A velocidade de formação de células e dada pela variação da concentração de células em função do tempo, na fase exponencial de crescimento (fase log), a velocidade é constante e pode ser calculada pelo numero de células (N) por contagem direta dos microrganismos ou por contagem em placas e ainda pela massa seca de células (X). Ela é chamada velocidade especifica de crescimento, calculada por: ln Nf – ln Ni ln Xf – ln Xi ln DOf – ln DOi ì = ------------------- ou -------------------- ou --------------------- tf – ti tf - ti tf - ti para [ ] de células para Biomassa para densidade ótica FIGURA 5- Variação da Concentração Celular em Função do Tempo OBS.: Para microrganismos não filamentosos é preferível utilizar número de células e para microrganismos filamentosos, a massa seca de células.
  • 36. Metabolismo e cinética de crescimento microbiano Prof. Raul Vicenzi 34 VELOCIDADE DE CONSUMO DE SUBSTRATO A medida que a célula está se reproduzindo os substratos estão sendo consumidos, a velocidade de consumo do substrato será teoricamente constante, enquanto for constante o crescimento celular, isto quase nunca acontece, uma vez que o substrato não é só utilizado para o crescimento celular, mas também para formação de metabólitos, em alguns processos o substrato pode ter uma velocidade de consumo quase linear por um período de tempo, e a velocidade é chamada de velocidade específica de consumo do substrato e é calculada por: ln Sf – ln Si ì = ------------------- Sf = concentração de substrato tf – ti FIGURA 6 - Variação da Concentração de Substrato em Função do Tempo VELOCIDADE DE FORMAÇÃO DO PRODUTO A velocidade de formação do produto tende a ser constante durante um período de tempo. É chamada de velocidade especifica de formação do produto e calculada por: ln Pf – ln Pi ì = ------------------- Pf = Produto final tf – ti
  • 37. Metabolismo e cinética de crescimento microbiano Prof. Raul Vicenzi 35 FIGURA 7 - Variação da Concentração de Produto em Função do Tempo VELOCIDADE ESPECÍFICA DE CRESCIMENTO É função de três parâmetros: - Concentração de substrato limitante (S) - Velocidade máxima de crescimento (ì max) - Constante especifica do substrato (ks), equivale a concentração em ì = 0,5 ìmax É a concentração de substrato que dá a metade da velocidade máxima de crescimento. E dada pela equação de MONOD, que equivale a equação de Henri-Michaelis-Menten para cinética enzimática. S ì = ìmax --------------- Ks = corresponde a metade do ìmax Ks + S FIGURA 8 - Relação entre a Velocidade de crescimento e Concentração de Substrato
  • 38. Metabolismo e cinética de crescimento microbiano Prof. Raul Vicenzi 36 Existindo vários substratos limitantes, podemos estender a equação de Monod para: K1.S1 K2.S2 Kn.Sn ì = ìmax . --------- + --------- + + .......+ ----------- K1 + S1 K2 + S2 Kn + Sn - Se existir um excesso de todos os substrato, então ì = ìmax e a cultura está na fase log, na sua velocidade máxima de crescimento. Se o primeiro substrato for exaurido e outro substrato estiver presente, teremos uma segunda fase lag e log com outro tempo de geração que caracteriza a metabolização deste segundo substrato, este fenômeno é chamado de DIAUXIA. Isto ocorre porque um dos substratos, geralmente a glicose, é catabolizada preferencialmente e inibe a quebra de outros substratos. As enzimas que catabolizam os outros substratos são induzidas (durante a segunda fase lag) após a metabolização completa do primeiro substrato. TABELA 4 - Efeito do comprimento da cadeia de glicose na velocidade máxima de crescimento de Fusarium graminearum a 30ºC AÇÚCAR Nº de UNIDADE de GLICOSE ìmax (h-1 ) G (h) Glicose 1 0,28 2,48 Maltose 2 0,22 3,15 Maltotriose 3 0,18 3,85 FIGURA 9 – Crescimento triáuxico de Fusarium graminearum Com isto chegamos a conclusão que o ì máximo depende do: • microrganismo; • condições de cultivo; • composição do meio de cultura; • temperatura de incubação; • outros fatores (pH, oxigênio, etc.)
  • 39. Metabolismo e cinética de crescimento microbiano Prof. Raul Vicenzi 37 CLASSIFICAÇÃO DOS PROCESSOS TIPO 1 - ASSOCIADO No processo associado o produto é derivado diretamente do metabolismo primário, usado para a produção de energia. O crescimento, o catabolismo de carboidratos e a formação do produto ocorrem ao mesmo tempo. A TROFOFASE (fase de crescimento) e a IDIOFASE (fase de formação do produto) não são separadas. Ex. produção de biomassa, etanol e ácido glucônico. Sendo A, B, e C, produtos intermediários do metabolismo primário, a formação do produto pode ser considerada: A ⇒ B ⇒ C ⇒ PRODUTO FIGURA 10 - Relação entre Crescimento Celular e Formação de Produto em um Processo Associado TIPO 2- SEMI-ASSOCIADO O Produto é derivado de um substrato usado no metabolismo primário, mas segue uma rota colateral. A tropofase e a idiofase são separadas. Em fermentação em batelada este tipo de cinética possui dois pontos importantes: 1) crescimento celular acompanhado de alto consumo de substrato e pouca ou nenhuma formação de produto; 2) O crescimento diminui e a formação do produto começa acompanhada de um alto consumo de substrato. Ex.: produção de ácido cítrico e de alguns aminoácidos. A reação de formação do produto pode ser exemplificada como: A B C Metabolismo Primário D E Produto
  • 40. Metabolismo e cinética de crescimento microbiano Prof. Raul Vicenzi 38 FIGURA 11 - Relação entre Crescimento Celular e Formação de Produto em um Processo Semi-Associado TIPO 3 - NÃO ASSOCIADO O metabolismo primário e a formação do produto ocorrem em tempos separados. O produto não é derivado do catabolismo, mas de rotas anfibólicas. Neste tipo de fermentação, o metabolismo primário ocorre acompanhado do consumo de substrato, após isto o produto é formado por reações do metabolismo intermediário. Ex.: muitos antibióticos e vitaminas. Nesse tipo de processo freqüentemente condições ótimas para o crescimento celular não são as mesmas para a formação do produto e a fermentação pode ser dividida em duas etapas, onde na primeira se dá condições às células crescerem e após altera-se a temperatura, pH, quantidade de oxigênio ou concentração de nutrientes para favorecer a formação do produto. FIGURA 12 - Relação Entre Crescimento Celular e Formação de Produto em um Processo Não associado A classificação dos processos depende da produção do metabólito, da composição do meio de cultura e da regulação da cepa utilizada. Podem ocorrer formas intermediárias:
  • 41. Metabolismo e cinética de crescimento microbiano Prof. Raul Vicenzi 39 - Produção de ácido láctico: tipo 1 e 2 - Produção de antibióticos aminonoglicosídicos: tipo 2 e 3 Um processo pode se comportar de duas formas distintas, conforme os parâmetros de fermentação. Por exemplo, a produção de etanol é um processo associado, mas pela modificação das condições de fermentação, pode ser forçado a se comportar como não-associado.
  • 42. Cultivos starters na industria de alimentos Prof. Raul Vicenzi 40 EMPREGO DE CULTIVOS INICIADORES - STARTERS Os cultivos starters são utilizados atualmente no processamento de alimentos para induzir diversas mudanças em suas propriedades, tais como a modificação da textura, a conservação, o desenvolvimento de aromas ou melhora nutricional, e na produção de enzimas. As principais aplicações de cultivos starters se encontram nas indústrias de panificação, cárnea e leiteira, ainda que existam leveduras starters destinadas a fermentação de bebidas alcoólicas e a produção de álcool industrial. Atualmente está se impondo o emprego de starters preparados com cepas de microrganismos mais adequados para elaboração de cada produto. As culturas starters usadas nos produtos cárneos curados consistem, normalmente de um organismo tipicamente acidificante como Lactobacillus ou Pediococcus para estabilizar o produto biologicamente e um organismo com características nitrato redutoras que, por uma série de reações produzirá uma atrativa cor avermelhada associada com o tipo de produto, sendo que o organismo nitrato redutor normalmente é Micrococcus ou Staphylococcus coagulase negativa. 1. DEFINIÇAO: Starters são grupos de microrganismos selecionados com características bioquímicas desejadas e definidas produzidos sob rigorosas e controladas condições (pH, temperatura, acidez, substrato, etc.) e são usados na elaboração de produtos fermentados. 2. OBJETIVOS DO USO DE STARTERS. Ø Incorporar um número desejado de microrganismos no meio de modo que estes possam crescer, multiplicar-se e produzir as alterações desejáveis no meio e no produto final; Ø Superar o desenvolvimento de qualquer agente contaminante, competindo com estes pelos substratos e pela produção de substâncias que inibam os contaminantes; Ø Ajustar uma escala de produção, permitindo uma produção programada de produtos (se inocular, pode-se ter certeza do que será o produto final e o tempo que leva a produção); Ø Obter uma maior uniformidade em diferentes lotes de produção; PARA UMA CULTURA MICROBIANA SER UTILIZADA COMO STARTER DEVE POSSUIR ALGUNS REQUISITOS FUNDAMENTAIS COMO: • ser tolerante ao sal (salmoura de 6 a 10%); • ser tolerante a presença de nitritos (50 a 100 ppm) • ter crescimento na faixa de 26 a 43 ºC e temperatura ótima de crescimento entre 32 a 35 ºC; • ser homofermentativo (produzir somente ácido láctico); • não ser proteolítico; • não ser lipolítico; • não produzir sabores e aromas atípicos ao produto final;
  • 43. Cultivos starters na industria de alimentos Prof. Raul Vicenzi 41 • não ser patogênico; • apresentar destruição térmica a 57-60 ºC. Os cultivos starters não devem ser patogênicos, toxigênicos nem formar antibióticos, além disso não devem degradar os aminoácidos a aminas farmacologicamente ativas (ex. histamina) ou a ácido sulfidrico. As bactérias lácticas devem formar muito pouco ou nenhum peróxido de hidrogênio, não formar gás e pouco ou nenhum ácido acético. 3. PRODUÇÃO DE CULTURAS PARA FERMENTAÇAO EM ALIMENTOS Selecão: Selecionar cepas ou microorganismos que vão produzir a característica ideal. • O microorganismo deve ser geneticamente estável. Manutenção: Uma vez obtido o cultivo satisfatório devemos mantê-lo puro e ativo. Mantêm-se a cultura ativa por transferência ou repicagem em meio de cultura apropriado. O meio de cultura de repicagem deve ser o mesmo da atuação, de preferência; No ponto médio da fase exponencial de crescimento, guardar sob refrigeração para paralisar o crescimento. Neste ponto temos o maior número de células viáveis e mais saudáveis de uma cultura, se a usarmos como inoculante de um processo. O nível de sobrevivência depende do ambiente: cuidar a temperatura, culturas mantidas a altas temperaturas (ou mesmo ambiente) continuarão metabolizando e suas enzimas podem ser descaracterizadas. Usar sempre a mesma porcentagem de inóculo. Usar culturas que estão com o seu crescimento no ponto médio da fase exponencial. Se o inóculo for uma cultura mais resistente, podemos usar a cultura até o final da fase estacionária. 4. PUREZA DA CULTURA Evitar a presença de contaminantes. Os métodos de controle usados para checar a pureza do inóculo vão depender do tipo de microrganismo em questão: Exame microscópico é um método utilizado para identificação de contaminantes desde que se conheça a morfologia do microrganismo que estamos trabalhando e que o contaminante tenha uma morfologia diferente A detecção de substâncias produzidas pelos contaminantes e que não são produzidas pelos starters. Ex.: culturas lácticas são todas catalase negativa, enquanto que a grande maioria dos contaminantes são catalase positiva. Repicar uma amostra para o meio onde o contaminante cresce bem e de preferência tenha colônias características. Em caso de a contaminação retornar para a cultura estoque, ou se houver a suspeita de que esta está contaminada, fazer a repurificação estriando a cultura em meio seletivo para a cultura desejada e proceder a purificação.
  • 44. Cultivos starters na industria de alimentos Prof. Raul Vicenzi 42 5. CARACTERÍSTICAS DAS BACTÉRIAS ÁCIDO LÁCTICAS São anaeróbias facultativas: crescem melhor com baixa tensão de oxigênio; São basicamente sacarolíticas: outros componentes são pouco alterados Produzem grande quantidade de ácido láctico: são ineficientes quanto a produção de energia Divisão quanto a fermentação da lactose: homo e heterofermentativas; Mecanismos biossintéticos pobres: é necessário o suprimento de carboidratos, aminoácidos, lipídios, minerais, etc, para que se desenvolvam: Não usam O2 no seu metabolismo, por isto não decompõem completamente o alimento e seus metabólitos básicos acumulam no meio. A única forma de metabolismo energético é a fermentação: São gram-positivas. 6. FERMENTAÇÃO POR STARTERS É alteração da matéria-prima, formando alimentos com características sensoriais agradáveis e proporcionando uma maior vida-de-prateleira. Os primeiros produtos fermentados foram descobertos empiricamente e serviam apenas para conservar. Após desenvolveu-se um certo gosto por produtos fermentados, hoje fabricados para obter propriedades de conservação e atender a demanda do mercado. E considerada como um método de preservação provocando modificações das características químicas da matéria-prima e pelo fato de que os agentes conservadores se formam como produto da mesma, por ação dos microrganismos são, no entanto alterações dirigidas. As transformações mais importantes de produtos alimentícios tem como principal substrato os carboidratos. Quase todos os conservantes produzidos por ação microbiana são ácidos (ácido láctico) e álcool. O efeito conservante dessas substâncias geralmente é complementado pela aplicação de outros métodos: baixas temperaturas, calor, anaerobiose, sal, açúcar, adição de um ácido (vinagre). As bactérias lácticas são utilizadas em uma série de produtos como: queijos, leites fermentados, vegetais e produtos cárneos produzem substâncias inibidoras (ácidos, álcool, H2O2 e antibióticos (bacteriocinas)). 7. TIPOS DE FERMENTAÇÃO Os microrganismos lácticos utilizados na indústria de alimentos uns são homo e outros heterofermentativos, ou seja, alguns produzem apenas ácido láctico (homofermentativos) como produto da transformação do substrato em questão e, outros produzem ácido láctico e uma gama de outros ácidos que ficam incorporados ao produto. Láctica: picles, chucrute, azeitonas verdes, queijo, leites fermentados, produtos cárneos, etc.. Alcoólica: vinho, cerveja, sucos de frutas fermentadas, licores, destilados. etc... Acética: maionese, vinagre, etc. Propiônica: ácido propiônico.
  • 45. Cultivos starters na industria de alimentos Prof. Raul Vicenzi 43 8. IMPORTÂNCIA DO DESENVOLVIMENTO DA ACIDEZ a) Controle de contaminações indesejáveis, antagonismo (patogênicos); b) Ajuda na eliminação de umidade. Ex. queijos. c) Formação do sabor; d) Formação de corpo e textura; e) Facilita a ação de outros aditivos. Ex. a renina atua melhor em pH ácido; f) Ajuste do pH adequado para os diversos processos fermentativos; g) Conservação dos produtos (aumenta a vida útil ou vida-de-prateleira dos produtos.); h) Produção de bacteriocinas (proteínas que são produzidas a partir de seu metabolismo) 9. IMPORTANCIA DO ÁCIDO LACTICO NOS PRODUTOS FERMENTADOS a) Preservação do produto; b) Seleção da flora microbiana, evitando contaminações; c) Contribui para o sabor, aroma e flavor dos produtos fermentados; d) Melhora a digestibilidade de alguns produtos: Ex.: a precipitação de proteínas em partículas finas facilita a digestão enzimática; e) Melhora a utilização do Cálcio, Fósforo e Ferro no organismo (são melhores absorvidos em pH ácido); f) Estimula a secreção do suco gástrico. 10 FATORES IMPORTANTES NO DESENVOLVIMENTO DA FERMENTAÇÃO A presença de antibióticos constitui um sério problema para obtenção de starters lácticos. A penicilina, muito utilizada para combater mamites, e a aureomicina em concentrados da dieta. Os resíduos desses antibióticos no leite produzem inibição dos microrganismos lácticos ate 96 horas após a aplicação ter sido feita no animal. Níveis de 0,05 a 0,10 U.I. de penicilina/mL inibem o desenvolvimento da maioria dos Streptococcus e 0,5 U.I./mL inibe por completo a fermentação. Os Lactobacillus são mais resistentes, embora algumas espécies são inibidas por completo com 5 U.I./mL de penicilina no leite. Presença de resíduos de sanitizantes (iodóforos e amonioquaternários), os iodóforos em baixas concentrações estimula a presença de ácidos enquanto que em níveis maiores (50 a 100 ppm) a reduzem. Geralmente o cloro ativo em concentrações entre 25 e 200 ppm impedem a fermentação láctica. Amonioquaternários, níveis entre 25 e 75 ppm causam diminuição da velocidade ou detenção da fermentação. 11. IMPORTÂNCIA DAS CULTURAS STARTERS PARA INDÚSTRIA As formas de obtenção e estocagem de culturas starters tem proporcionado o aparecimento de culturas em melhores condições de uso do que as tradicionalmente usadas. O estoque das culturas é mantido em plantas de processamento via sub culturas em laboratório