PhD Presentation UFRJ Biofisica 2009 Rio de Janeiro

1. A chaperona ClpB/HSP104 de Trypanosoma cruzi
Roberta Alvares Campos
Turán Péter Ürményi
Lab. Metabolismo Macromolecular Firmino Torres de Castro
Programa de Biologia Molecular e Estrutural
IBCCF/UFRJ

2. O modelo de estudo Trypanosoma cruzi
Tripanossomatídeos
Protozoário flagelado
Agente Etiológico Trypanosoma cruzi (CL Brener)
da Doença de Chagas The TIGR Genome Project - Julho de 2003
T. cruzi (Esmeraldo) - J. Craig Venter Institute
Afeta 18 milhões de pessoas em 21 países.
Organismo Eucarioto
unicelular
Trypanosoma brucei
Ordem: Kinetoplastida Agente Etiológico Doença do Sono
- Mitocôndria única e alongada. Leischmania sp.
- organelas especializadas, ricas em
kDNA = cinetoplastos. Leishmaniose.
Doenças Extremamene Negligenciadas, segundo a OMS.
Forma Epimastigota. (Docampo et al., 1975).

3. Doenças Globais:
Doenças crônicas como o câncer, doenças cardiovasculares, distúrbios neurológicos e a AIDS.
Doenças Negligenciadas:
Como a malária, provocam um interesse “marginal” na indústria farmacêutica.
Doenças Extremamente Negligenciadas:
Doença do sono, Chagas e Leishmaniose, afetam populações de extrema pobreza.
Fonte: DNDi – Drugs for Neglected Diseases 2007 (http://www.dndi.org.br/)

4. A Doença de Chagas
Vetorial Transfusão Via oral
Transplantes Acidentes
silvestre sanguínea ou
Congênita, da
de órgãos leite materno
domiciliar ou em laboratórios
mãe para feto. infectados ou alimentos
peridomiciliar
O Ciclo de vida do T. cruzi. (Modificado do CDC, 2009).

5. As peculiaridades moleculares do T. cruzi
Organismos evolutivamente antigos
Transcrição multigênica
Trans-splicing
Regulação gênica pós-transcricional
Mecanismos de resposta ao estresse diferenciado

6. Estresse no ciclo biológico do T. cruzi
Hospedeiro mamífero
Baixo pH
Enzimas proteolíticas
Produtos oxidativos
Temperatura = 37⁰
Pontos potenciais de estímulos de stress no ciclo biológico do T. cruzi. Rondinelli, E. 1994.

7. Estresse & desnaturação protéica

8. As Chaperonas moleculares e sua importância
Proteínas
imunogênicas

9. Clp/HSP100
ATPases - Superfamília de Proteínas AAA+ Clp/HSP100
Controle de qualidade de enovelamento protéico
ClpB/HSP104
ClpA (ClpP, ClpS, ClpX, ClpQ)

10. Funções da proteína ClpB/HSP104
LEE, S. et al. 2003. The Structure of ClpB: A Molecular Chaperone that Rescues Proteins from an Aggregated Stade. Cell 115.

11. Estrutura da proteína Clp/HSP104
LEE, S. et al. 2003. The Structure of ClpB: A Molecular Chaperone that Rescues Proteins from an Aggregated Stade. Cell 115.

12. Resultados anteriores com expressão de HSPs em
tripanossomatídeos
29 37 40
103 kDa
92
GIAMBIAGI DE-MARVAL et al., 1996.
75
61
CARVALHO et al., 1990. CLOS et al., 1995.

13. OBJETIVOS
I. Caracterizar a estrutura gênica de ClpB/HSP104 de T. cruzi.
II. Investigar a expressão gênica de ClpB/HSP104 em resposta ao choque
térmico.
III. Propor a estrutura tridimensional da proteína ClpB/HSP104 por
modelagem molecular.

14. ESTRUTURA GÊNICA

15. Busca da sequência do gene ALVO clpb/hsp104 de
T. cruzi
Tc00.104705350 HSP100, ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 100 (pseudogene), putative, serine peptidase (pseudogene),
T. cruzi CDS
6821.20 putative, 7106.t00002
Tc00.104705350
T. cruzi CDS pre-mRNA cleavage complex II Clp1 protein, putative, 7179.t00009
7027.59
Tc00.104705350
T. cruzi CDS ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 100 (HSP100)(pseudogene), putative, 7023.t00008
6617.90
Tc00.104705350
T. cruzi CDS HSP78, ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 78, putative, serine peptidase, putative, 8007.t00002
9125.20
Tc00.104705350
T. cruzi CDS heat shock protein 100 (clp protein), putative, 7649.t00006
8233.60
Tc00.104705351
T. cruzi CDS ATP-dependent Clp protease subunit heat shock protein 100 (HSP100), putative, 8599.t00005
1107.41
Tc00.104705350
T. cruzi CDS pre-mRNA cleavage complex II Clp1 protein, putative, 7147.t00033
6941.229
Tc00.104705350
T. cruzi CDS HSP78, ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 78, putative, serine peptidase, putative, 7851.t00010
8737.100
Tc00.104705350
T. cruzi CDS HSP100, ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 100, putative, serine peptidase, putative, 5618.t00001
8807.10
GeneID: 3532962 Locus tag: Tc00.1047053508665.14 100 (HSP100), putative, 7820.t00005
T. cruzi CDS
Tc00.104705350
8665.14
ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein Protein: EAN81877
Tc00.104705350 HSP78, ATP-dependent Clp protease subunit, heat shock protein 78 (pseudogene), putative, serine peptidase, putative,
T. cruzi CDS
9127.10 8008.t00001
Agosto 2005

16. Sequência incompleta do gene ClpB/HSP104 de T. cruzi, no
banco dados do TcruziDB

17. Estratégia de mapeamento do terço final de Clp/HSP100

18. Obtenção da sequência completa do gene ClpB/HSP104
GAP previsto de 33 pares de bases
Região Codificante total do Gene
ClpB/HSP104 = 2604 pb
Proteína de 868 Aa
200 pb

19. Sequência completa de aminoácidos de ClpB/HSP104 em T.
cruzi
Identidade de 71,9%

20. Alinhamento de sequências de Clp/HSP100

21. Análise filogenética preliminar da Proteína ClpB/HSP104
Modelo radial com calculo da distância genética Jukes-Cantor e Método de construção por Neighbor-Joining.

22. Obtenção de sonda molecular do gene clpB/hsp104
de T. cruzi
980 pb

23. Análise por padrão de fragmentos genômicos de
clpb/hsp104
Não-dig.
Eco0109
Hind III
BamHI
EcoRI
HinfI
XhoI
XbaI
PstI
SalI
5 kb
2 kb

24. Sítio de trans-splicing do mRNA de ClpB/HSP104

25. Sítio de trans-splicing do mRNA de ClpB/HSP104

26. EXPRESSÃO GÊNICA

27. Expressão gênica de ClpB/HSP104 em resposta ao choque térmico
29°C 37°C 4o°C
Extrato
RNA Total
Protéico
SDS-PAGE 2D-IEF Northern qRT-PCR
Western blot Immunobloting blot

28. Indução do mRNA ClpB/HSP104 em resposta ao choque térmico

29. Indução da Proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi em resposta ao
choque térmico
M 29° 37/3 37/6 37/24 40/3 37/6 h 29° 37/3 37/6 37/24 40/3 37/6 horas

30. Otimização das condições de amostras para 2D-IEF

31. Isoformas de ClpB/HSP104 de T. cruzi em diferentes temperaturas
150
100
75
50
37
15
29
250
150
100
75
50
37
15
29
A 37
B

32. MODELAGEM MOLECULAR

33. Utilização da Modelagem molecular
 Discriminação entre as subfamilias das
Clps/HSP100.
 Procura por domínios conservados.
 Características estruturais podem ser úteis
para predizer funções.
 A caracterização estrutural pode nos guiar ao
estudo de peptídeos candidatos para
diagnóstico de doença de Chagas.

34. Construção do modelo tridimensional da proteína
ClpB/HSP104 de T. cruzi por Modelagem Comparativa
Explora similaridades estruturais entre PTNs
Pressupõe regiões de conservação evolutiva entre PTNs
Depende de um molde disponível no banco (PDB)
Construção do modelo tridimensional da proteína
Análise e validação do modelo gerado

35. Escolha do Molde/Template no PDB
Domínios Conservados – NCBI conserved domain
Moldes disponíveis no banco de dados - PDB
Proteína Organismo ID PDB Identidade Similaridade Cobertura
ClpB T. thermophilus 1QVR 53% (457/858) 72% (613/858) 98,84%
ClpA E. coli 1KSF 43% (150/347) 61% (215/347) 39,94%
ClpB E. coli 1JBK 66% (128/192) 84% (162/192) 22,11%
ClpB P. falciparum 2P6S 62% (116/187) 81% (152/187) 21,54%
ClpB S. cerevisiae 2QR9 27% (56/204) 46% (94/204) 23,50%

36. Modelo tridimensional da proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi
Modelo “868” construído por modelagem comparativa para a proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi
com o programa Modeller e visualizados com Pymol (WARREN, 2004).
É um monômero que constitui a sexta parte do hexâmero da proteína.

37. Validação do modelo tridimensional proposto da proteína
ClpB/HSP104 de T. cruzi
Análises utilizando o programa MODELLER:
Todos os 300 modelos obtiveram GA341 = 1.0 indicando a boa escolha do molde
(template) pelo usuário
Os 300 modelos foram ranqueados segundo o Discrete Optimized Protein Energy (DOPE)
quanto menor o DOPE, maior a acurácia do modelo.
Análise utilizando o programa
PROCHECK:
Os 300 modelos foram
ranqueados segundo o Gráfico
de Ramachandran.
Gráfico de Ramachandran
 regiões muito favoráveis – 91.3%,
regiões favoráveis – 7.3%,
generosamente permitidas – 1.2% ,
regiões desfavoráveis – 0.3%

38. Comparação estrutural T. thermophilus X T. cruzi construído
por modelagem molecular
(A) TClpB104 de T. thermophilus com os principais domínios estruturais da proteína (LEE et al., 2003).
(B) Modelo do monômero construído por modelagem comparativa para a proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi.
Em laranja = L1, em marinho = L2, em rosa = L3, em azul claro = L4.
Os 2 monômeros foram colocados em eixos semelhantes para esta comparação.
Programa Pymol (Yao & Warren, 2004).

39. Estudo de peptídeos candidatos da chaperona ClpB/HSP104 de T.
cruzi para diagnóstico da doença de Chagas
(A) Modelo “868” de ClpB/HSP104 de T. cruzi (verde) fitado com o modelo de ClpP Humana (1TG6).
(B) Modelos fitados com detalhes para os 2 peptídeos propostos para futuros alvos de diagnóstico.

40. Conclusões
Foi obtida a sequência completa do gene clpb/hsp104 de T. cruzi que dá origem a
uma proteína de 868 aminoácidos, com identidade de 71,9% quando comparados
aos genes ortólogos dos demais tripanossomatídeos.
Análises de Southern blot sugerem que o gene clpB/hsp104 está presente no
genoma de T. cruzi em cópia única.
Análises do teor relativo do mRNA mostraram que ocorre indução dos níveis de
mRNAs clpB/hsp104 de T. cruzi após o choque térmico, com um aumento de 4
vezes a 37 ºC e de 2 vezes a 40ºC.
Análises de indução por choque térmico com a proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi,
mostraram que ela está presente tanto na temperatura normal de cultivo 29ºC,
como em choque térmico, levando a um acúmulo da proteína à 37 ºC quanto a à
40ºC, sendo mais evidente ao final de 24 horas de incubação à 37 ºC.

41. Conclusões
A proteína ClpB/HSP104 de T. cruzi está presente em uma única
isoforma à 29ºC com pI aproximado de 6.5, e o número de
isoformas parece aumentar com o choque térmico a 37ºC.
Foi proposta uma estrutura tridimensional da proteína ClpB/HSP104
de T. cruzi por modelagem molecular de boa qualidade e que definiu
que a proteína de T. cruzi é uma ClpB/HSP104.

42. RAC - Tese 24/07/2009
Perspectivas
-Mapeamento do tamanho e da meia vida do mensageiro de
ClpB/HSP104 utilizando RNA Poly A+
-Análises proteômicas dos spots encontrados dos géis 2D-IEF em
MALDI-TOF.
- Estudo detalhado dos 2 peptídeos funcionais propostos neste
trabalho, ligados a uma molécula de avidina no N-terminal para
ensaios de captura em placas de Elisa para testes de
imunogenicidade da proteína contra soros Chagásicos.

43. RAC - Tese 24/07/2009
Agradecimentos especial as colaborações
Proteômica 2D-IEF
Lab. de Diagnóstico de Doenças Infecciosas
Líder: José Mauro Peralta
Giovani Veríssimo
Inst. de Microbiologia Prof. Paulo de Góes/UFRJ
Modelagem molecular
Lab. de Física Biológica
Líder: Paulo Bisch
Manuela Leal
IBCCF/UFRJ

44. MUITO OBRIGADO!