g2zW-9uX-2b5-Kx6

1. [Tea tree 001]
Óleo essencial: Melaleuca alternifolia
Composto:
Título: Expression of P53, BAX, and BCL-2in human malignant melanoma and squamous cell
carcinoma cells after tea tree oil treatment in vitro.
"Expressão de células de melanoma maligno humano P53, BAX e BCL-2 em células de
carcinoma celular após tratamento com óleo de tea tree in vitro".
Autor: Mohammed A. Ramadan; Alaa E. Shawkey; Mohamed A. Rabeh; Ashraf O. Abdellatif
Jornal: Cytotechnology
Vol (issue): 71 (1)
Ano: 2019
DOI: 10.1007/s10616-018-0287-4
TAGs: tea tree; melaleuca; melanoma maligno; câncer; in vitro; proliferação celular; apoptose;
quimioprevenção; carcinoma; pele; destilação a vapor; infecção; infecção de pele; carcinoma
espinocelular da laringe humana; laringe; efeito citotóxico; anticancerígeno; uso tópico; óleo de
Tea Tree; Melaleuca alternifolia; citotoxicidade; viabilidade celular; câncer de pele; melanoma
maligno; expressão dos genes reguladores de apoptose; concentrações inibitórias em 50%;
citometria de fluxo; ciclo celular; caspases;
Sobre o artigo:
O óleo de Tea Tree (OTT) é um óleo essencial obtido por destilação a vapor das folhas de
Melaleuca alternifolia (Família: Myrtaceae), tradicionalmente usado para o tratamento de vários
tipos de infecções de pele.

2. Estudos anteriores já relataram que o OTT apresenta citotoxicidade em relação a muitos tipos
de câncer incluindo carcinoma do colo do útero (HeLa), carcinoma do fígado (HepG2), células
de leucemia, carcinoma da próstata (PC-3), câncer de pulmão (A549) e células de carcinoma
da mama (MCF-7).
Portanto, o objetivo desse estudo foi avaliar a influência do óleo essencial Tea Tree (OTT) na
viabilidade celular (triagem de moléculas responsáveis pela proliferação celular) e na atividade
proliferativa em dois tipos representativos de câncer de pele, o melanoma maligno (A-375) e o
carcinoma espinocelular da laringe humana (HEp-2).
A quimioprevenção é uma abordagem farmacológica que utiliza agentes naturais, sintéticos ou
biológicos que podem prevenir, inibir e até reverter a progressão do câncer. Foi considerada
uma estratégia nova, esperançosa, segura e eficiente para os que tratam essa doença.
O melanoma é um tipo de câncer que se desenvolve nos melanócitos, células responsáveis
pela pigmentação da pele. E o carcinoma espinocelular da laringe, também chamado de
carcinoma de células escamosas, tem origem nas células epiteliais da laringe.
Portanto, este estudo avaliou o efeito do OTT nos níveis de expressão dos genes reguladores
da apoptose (P53, BAX e BCL-2), com o intuito de desvendar os mecanismos moleculares de
sua ação.
Pois, por apoptose, células indesejadas ou danificadas são eliminadas do sistema, e, assim,
este poderia ser considerado um mecanismo protetor contra o desenvolvimento e a progressão
do câncer. Portanto, a apoptose ou morte celular programada é um regulador chave do controle
fisiológico, do crescimento e da homeostase tecidual.
Com isso, os compostos que suprimem a proliferação de células malignas por indução de
apoptose podem representar uma abordagem mecanicista útil para a quimioprevenção do
câncer.

3. O processo apoptótico é modulado por vários genes supressores de tumores, incluindo P53 e
proto-oncogenes – responsáveis por codificar proteínas que ajudam a regular o crescimento e
a diferenciação celular; além de desempenhar função no controle do ciclo celular, no reparo do
DNA e na indução da própria apoptose.
Após danos no DNA, algumas respostas celulares são desencadeadas pela ativação de
proteínas, a fim de manter a integridade das células saudáveis, como ocorre através da
regulação dos genes de proteínas da família BCL-2.
Portanto, a análise metodológica consistiu na cultura de células, o ensaio de viabilidade celular,
a identificação da apoptose em conjunto com a análise do ciclo celular, a avaliação da
expressão dos genes específicos em células cancerígenas usando PCR em tempo real, além
dos efeitos do OTT nas proteínas ativadoras desses genes e a análise da atividade da
caspase, com a bioestatística.
Resultados:
O presente estudo avaliou a capacidade do OTT de inibir a proliferação de células A-375 e
HEp-2 in vitro, bem como seus efeitos no perfil do ciclo celular. Além disso, o estudo avaliou o
potencial do OTT para induzir apoptose por meio da coloração com Anexina V / PI e medindo
os níveis de expressão dos genes reguladores de apoptose P53, BAX e BCL-2.
 Citotoxicidade de OTT em células A-375 e HEp-2
Para determinar os efeitos citotóxicos nas linhas celulares A-375 e HEp-2, as células foram
submetidas a tratamento OTT durante 24 h em concentrações que variam de 0,004 a 2,0% v/v.
Como mostrado na Fig.1, o tratamento reduziu marcadamente a viabilidade das células A-375
e HEp-2 de uma maneira dependente da concentração. E após 24 h, os valores das
concentrações inibitórias em 50% das células cancerígenas (IC50) estimados foram 0,038%
(v/v) para células A-375 e 0,024% (v/v) para células HEp-2.

4. Figura 1: Este gráfico representa a citotoxicidade de OTT para células tumorais A-375 e HEp-2 conforme
determinado pelo ensaio de MTT. Podemos observar uma redução significativa na sobrevivência de
ambas as linhagens celulares, que após 24 h, os valores IC50 estimados foram 0,038 % (v / v) para
células A-375 e 0,024 % (v/v) para células HEp-2.
As alterações histológicas que acompanham os efeitos citotóxicos sugeriram que o OTT pode
induzir a morte celular apoptótica em células A-375 e HEp-2; e, com isso, os pesquisadores
tentaram elucidar os possíveis mecanismos moleculares por meio da detecção de apoptose,
análise do padrão do ciclo celular e quantificação de genes reguladores de apoptose
selecionados após o tratamento com OTT.
As mudanças histológicas em células tratadas com OTT foram examinadas visualmente por
microscópio. Através das imagens podemos observar que as células não tratadas exibiram
núcleos regulares, hipercromáticos e condensados. Eles também foram caracterizados por
contornos celulares regulares sem evidência de dobramento nas membranas celulares e
nucleares (Fig. 2 A, C).
Em contraste, as células A-375 e HEp-2 tratadas com OTT mostraram as características
apoptóticas precoces de condensação periférica da cromatina e segregação nucleolar (Fig. 2B,
D).

5. Figura 2: Fotomicrografia de células A-375 e HEp-2 antes e após o tratamento com OTT (IC50); células
de controle de A-375 (a) e HEp-2 (c) mostrando células regulares (setas vermelhas) com variação de
forma e tamanho das células e seus núcleos (setas amarelas). Após o tratamento, as linhas A-375 (b) e
HEp-2 (d) apresentaram células inchadas, aglomeração da heterocromatina misturada com eucromatina
(setas amarelas); algumas células tinham membranas celulares irregulares (seta verde).
 Detecção de apoptose usando citometria de fluxo
As células apoptóticas exibem diferentes mudanças durante os estágios iniciais e finais da
apoptose, incluindo perda de assimetria de fosfolipídios, levando à exposição de fosfatidilserina
na camada externa da membrana plasmática.
A anexina V é classicamente usada para identificar células apoptóticas por citometria de fluxo
porque se liga à fosfatidilserina. Além disso, a coloração combinada com Anexina V e PI
distinguem entre células apoptóticas precoces e tardias. Portanto, os resultados neste estudo
indicaram que o OTT induziu apoptose precoce e tardia nas células A-375 e HEp-2.

6.  Análise do ciclo celular por citometria de fluxo
A análise do ciclo celular revelou ainda que a exposição ao OTT causou parada da fase G2 / M
em ambas as linhas celulares A-375 e HEp-2.
O aumento do número de células na fase sub-G1 reflete a maior incidência de células
apoptóticas pós-tratamento. Além disso, a parada específica de células HEp-2 durante a fase S
indica um aumento da morte celular por meio de danos ao DNA e vias bioquímicas que
envolvem cascatas de sinalização.
No geral, essas descobertas sugerem que o OTT inibiu o crescimento das células A-375 e
HEp-2, bloqueando o ciclo celular na fase G2 / M.
Figura 5: Efeito do OTT na progressão do ciclo celular em células cancerosas A-375 e HEp-2. Os dados
são expressos como a porcentagem média de células em cada fase (Sub-G1, G0-G1, S, G2/M).
 Efeito do OTT na expressão do gene regulador de apoptose (P53, BAX e BCL-2) em
células A-375 e HEp-2.
Para investigar o mecanismo molecular subjacente à apoptose induzida por OTT em células A-
375 e HEp-2, os pesquisadores determinaram os níveis de expressão dos genes de mRNA de
P53, BAX e BCL-2.
Após 24 h de exposição às concentrações determinadas (IC50) de OTT, os níveis de mRNA
foram medidos por PCR em tempo real. Os dados mostraram que a expressão de genes pró-
apoptóticos (P53 e BAX) foi claramente regulada positivamente, enquanto o gene

7. antiapoptótico BCL-2 foi regulado para baixo (Figuras 6 e 7), indicando a eficácia potencial do
OTT em direcionar o câncer células em direção à morte programada.
Figura 6: Avaliação dos níveis de expressão de genes relativos pró e anti-apoptóticos sob o efeito de
OTT usando PCR em tempo real em uma linha de células cancerosas de melanoma maligno (A-375). A
B-actina foi usada como gene de referência.

8. Figura 7: Avaliação dos níveis de expressão de genes relativos pró e anti-apoptóticos sob o efeito de
OTT usando PCR em tempo real em uma linha celular de carcinoma de células escamosas (HEp-2). A B-
actina foi usada como gene de referência.
 Efeito do OTT nas proteínas p53, Bax e Bcl-2.
Como mostrado na Fig.8, as proteínas pró-apoptóticas p53 e Bax foram significativamente
reguladas positivamente em A-375 e HEp-2 após o tratamento com OTT, enquanto a
expressão da proteína antiapoptótica Bcl-2 foi inibida em comparação com células de controle
não tratadas.
Figura 8: Efeito do OTT na expressão da proteína de p53, Bax e Bcl-2 em células A-375 e HEp-2: as
células foram tratadas com OTT em seus respectivos IC50 por 24 h. Os níveis de proteína foram
quantificados por análise densitométrica das três autorradiografias.
Consequentemente, as razões Bax / Bcl-2 aumentaram significativamente de 0,5397 para
2,0645 em A-375 e de 0,5344 para 1,8966 em células HEp-2 após o tratamento com OTT.
 Efeito do OTT nas atividades da caspase-3/7 e -9 em células A-375 e HEp-2.

9. Os resultados demonstraram que as atividades da caspase-3/7 e -9 mostraram um aumento
significativo nas células A-375 e HEp-2 após o tratamento com OTT por 24 h (Fig.9).
A elevação da atividade da caspase-3/7 confirmou a indução de apoptose nas células A-375 e
HEp-2. E, além disso, a elevação do nível de expressão da atividade da caspase-9 em células
tratadas é considerada a contribuição da via intrínseca durante o processo apoptótico.
Figura 9: Avaliação do efeito de OTT nas ativações de caspase-3/7 e -9 em linha de células A-375 e
HEp-2 após 24 h de tratamento.
Na prática:
Os dados do estudo indicam que o tratamento com OTT induziu a morte celular por apoptose
mitocondrial por uma via dependente de P53 – proteína que evita a propagação de células
geneticamente defeituosas – e que envolveu a regulação das proteínas-alvo da família BCL-2
(isto é, BAX, BCL-2), principais responsáveis por regular a permeabilidade da membrana
externa da mitocôndria.

10. Portanto, a apoptose induzida por OTT, nas células de melanoma e carcinoma, foi associada à
regulação positiva e negativa de P53, BAX e regulação negativa dos níveis de BCL-2, além da
ativação da caspase (iniciação e execução de apoptose ou morte celular programada).
Os resultados revelam claramente que o OTT exerce importantes efeitos citotóxicos nas células
do melanoma maligno e do carcinoma espinocelular, fornecendo suporte adicional ao
composto, como um agente candidato quimiopreventivo e anticâncer.