1) O óleo essencial de olíbano suprime o câncer de melanoma in vitro e in vivo, induzindo apoptose por meio da regulação negativa da sinalização Bcl-2/Bax. 2) O óleo essencial de olíbano também melhora a hepatotoxicidade, reduzindo os danos hepáticos sem causar toxicidade nos principais órgãos. 3) Os resultados sugerem que o óleo essencial de olíbano pode ser um promissor agente anticâncer e hepatoprotetor.

1. [Olíbano 002]
Óleo essencial: Boswellia carteri
Composto: ácido boswélico, α-Pineno.
Título: Frankincense essential oil suppresses melanoma cancer through down
regulation of Bcl-2/Bax cascade signaling and ameliorates hepatotoxicity via phase I
and II drug metabolizing enzymes
“O óleo essencial de olíbano suprime o câncer de melanoma através regulação
negativa da sinalização em cascata Bcl-2 / Bax e melhora hepatotoxicidade via
enzimas metabolizadoras de drogas das fases I e II”
Autor: Faruck L. Hakkim, Hamid A. Bakshi, Shabia Khan, Mohamad Nasef, Rabia
Farzand, Smitha Sam, Luay Rashan, Mohammed S. Al-Baloshi, Sidgi Syed Anwar
Abdo Hasson, Ali Al Jabri, Paul A. McCarron e Murtaza M. Tambuwala
Journal: Oncotarget
Vol/Issue: 10 (37)
Ano: 2019
DOI: 10.18632/oncotarget.26930
TAGs: Olíbano; Boswellia carteri; melanoma; óleo essencial; apoptose; remissão
tumoral; pele; hepatotoxicidade; sinalização cascata; enzimas metabolizadoras; ácido
boswélico; α-Pineno; câncer; melanócito; metástase; cirurgia; anticancerígeno;
hepatoprotetora; fígado; alterações histopatológicas; transaminase; toxicidade;
viabilidade celular; in vivo; in vitro.

2. Sobre o artigo:
A remoção cirúrgica de um tecido como terapia em estágio inicial e medicamentosa
para estágio avançado de melanoma (metástase) é frequentemente escolhida pelo
oncologista, mas o status de mau prognóstico e um declínio na sobrevida do paciente
acompanhado de toxicidade pós-tratamento são as principais preocupações.
O diagnóstico em estágio inicial e o desenvolvimento de agentes toleráveis à terapia
são os grandes desafios. Assim, os produtos naturais têm atraído atenção nos últimos
anos para o desenvolvimento de medicamentos anticâncer eficazes e seguros.
O Olíbano é uma planta bem conhecida nas regiões do Oriente Médio (Iêmen e Omã),
Índia e China. Desde os tempos antigos, é uma prática comum a inalação da fumaça
de sua resina, o consumo de extrato aquoso e a mastigação de resina fresca para
curar várias doenças. Diferentes variedades de Olíbano estão disponíveis e algumas
delas também são comestíveis.
Neste estudo, os pesquisadores utilizaram a variedade “hojari” de resina de Olíbano
(Boswellia sacra) que é comestível e é consumida pela população da região. O extrato
de Olíbano foi estudado para várias atividades biológicas, em particular como um
agente anticâncer; e diferentes formas de ácidos boswélicos foram isolados por serem
seus principais componentes.
O uso de óleo essencial de Olíbano (OEF) na aromaterapia é bem experimentado e
também relatado, seu potencial é conhecido como agente anticâncer contra câncer de
mama e pancreático in vitro, por exemplo. Apesar do potencial do OEF, nenhuma
evidência científica concreta está disponível para traduzir isso na prática clínica.

3. Neste estudo, os pesquisadores avaliaram o efeito do óleo essencial de Olíbano no
modelo in vitro e in vivo de melanoma (câncer de pele) e, outras experiências também
foram realizadas para investigar sua potencial eficácia hepatoprotetora.
Resumidamente, na primeira parte do estudo foram avaliadas as atividades in vitro
utilizando as resinas de Boswellia sacra em combinação com as células de melanomas
humanas (FM94) e de camundongos (B16-F10), incluindo teste de toxicidade,
viabilidade celular, entre outros.
Na segunda parte, as atividades foram in vivo, ou seja, os animais receberam células
de melanomas implantadas na pele e, além disso, também foram analisados os níveis
de transaminases (AST e ALT), alterações histopatológicas e morfométricas do fígado
– utilizados como indicadores de hepatotoxicidade, uma vez que as transaminases são
liberadas no sangue circulante somente após danos estruturais.
Resultados:
1. Viabilidade Celular
As células de melanomas humanas (FM94) e de camundongos (B16-F10) foram
tratadas com OEF a 3, 5, 7 e 10 μg/ml por 24 h.
Com isso, os pesquisadores perceberam que o OEF induziu a redução na viabilidade
celular de células de carcinoma B16-F10 e FM94 em comparação com o controle não
tratado (Figura 1A e e 1B) e também com uma célula de melanócito epitelial humano
normal (HNEM) (Figura 1C).
Curiosamente, as células FM94 tratadas com OEF perderam completamente sua
aderência e morfologia, enquanto as células HNEM mantiveram sua morfologia (Figura
1D e e 1E).

4. Portanto, os dados indicaram que o pré-tratamento com OEF induziu citotoxicidade em
células tumorais, poupando células normais.
Figura 1: Citotoxicidade de OEF em células B16-F10, FM94 e HNEM. O gráfico (A) representa
a análise da viabilidade celular para o tratamento com OEF em diferentes concentrações nas
células B16-F10; (B) células FM94; (C) células HNEM.
As imagens morfológicas (D) e (E) representam os tratamentos nas células FM94 e HNEM,
respectivamente, com diferentes concentrações de OEF e Dox por 24 horas (células A- não
tratadas; B- 3 μg/ml; C- 5 μg/ml; D- 7 μg/ ml; E- 10 μg/ml; F- Dox 5 µg/ml) por 24 h.
2. Fragmentação Nuclear
Os pesquisadores observaram também que em 24 h de tratamento o OEF induziu
apoptose nas células B16-F10. O teste de coloração Hoechest revelou que 5, 7 e 10

5. μg/ml da concentração de OEF induziu a fragmentação nuclear quando comparado ao
controle não tratado (Figura 2).
Esses dados indicam que os constituintes do OEF têm como alvo o núcleo das células
do melanoma e causando danos ao DNA.
Figura 2: Fragmentação nuclear induzida por OEF em células B16-F10: as células foram
tratadas com diferentes concentrações de OEF por 24 horas e coradas com coloração de
Hoechest. (A) Controle; (B) 5 µg/ml; (C) 7 µg/ml; (D) 10 µg/ml. Os núcleos foram observados
em microscópio de fluorescência.
3. Fragmentação do DNA

6. Para garantir a capacidade de direcionamento do DNA de OEF, as células B16-F10
foram tratadas com diferentes concentrações (5, 7 e 10 μg/ml) por 24 horas e
observadas quanto a danos no DNA.
Portanto, os pesquisadores observaram que o OEF induziu a formação da escada de
DNA de maneira dependente da dose.
4. Apoptose
A indução da apoptose é considerada uma abordagem terapêutica predominante para
vários agentes bioativos e produtos naturais.
Está bem estabelecido que o principal componente do OEF é o α-pineno com outras
misturas de terpenos, e, portanto, estas misturas complexas poderiam se intercalar
com o DNA para formar adutos.
Embora o tratamento com OEF tenha como alvo o DNA em células B16-F10, é
imperativo compreender o estado apoptótico das células B16-F10 após o tratamento.
Para isso, as células B16-F10 foram tratadas com OEF a 10 μg/ml por 24 h e
analisadas quanto ao processo de apoptose por coloração com anexina V e usando
citometria de fluxo.
Os pesquisadores viram que o tratamento com OEF resultou em um aumento
significativo na porcentagem de células no estágio inicial (25%) e tardio (10%) de
apoptose, enquanto apenas 2 a 3% das células não tratadas atingiram o estágio inicial
e final de apoptose (Figura 4).

7. Figura 4: Análise de apoptose por citometria de fluxo: células B16-F10 tratadas com OEF a 10
μg/ml por 24 h. (A) As células não tratadas mostraram 2–3% das células no estágio inicial ou
tardio de apoptose. (B) nas células tratadas com OEF, houve aumento significativo na
distribuição percentual de células em apoptose precoce (25%) e tardia (10%) foram
observados.
5. Mecanismo molecular de indução de apoptose por OEF
Para determinar o mecanismo de indução apoptótica em células B16-F10 por
tratamento com OEF, os níveis de expressão da família de proteínas Bcl-2 e Bax foram
analisados.

8. Estudos anteriores indicaram que as proteínas da família Bcl-2 e proteínas pró-
apoptóticas (Bax e Bak) desempenham um papel importante na via apoptótica
intrínseca pela regulação da integridade da mitocôndria.
Embora a expressão reduzida de Bcl-2 acompanhada com alta expressão de Bax
possa promover a resposta apoptótica à drogas anticâncer, a expressão aumentada de
Bcl-2 leva à resistência a drogas quimioterápicas.
Portanto, os pesquisadores observaram um declínio gradual nos níveis de expressão
de Bcl-2 com aumento acentuado nos níveis de expressão da proteína Bax de uma
maneira dependente do tempo. Ou seja, o OEF regulou para baixo a expressão de Bcl-
2 com regulação para cima simultânea de Bax pró-apoptótica em células B16-F10.
Com isso, o OEF induziu apoptose por regulação negativa do Bcl-2, que leva à
formação de apoptossoma no citosol e ao início da cascata de sinalização da caspase.
Ainda, para investigar se a apoptose foi induzida por OEF em células de melanoma
humano, células FM94 tratadas (0, 7, 10 μg/ml) por 24 horas e o nível de expressão
dos marcadores apoptóticos (caspase 3, caspase 9 e PARP) foram avaliadas.
Os pesquisadores observaram que o OEF regulou significativamente a expressão de
caspase 3 clivada, caspase 9 e PARP de maneira dependente da dose. Os dados
indicam que a indução de apoptose por OEF era caspase-dependente e parecia ser
mediada pela via mitocondrial.
Além disso, em estudos anteriores, pesquisadores descobriram que a principal proteína
antiapoptótica MCL-1 era frequentemente superexpressa e identificada como um alvo
importante na maioria dos cânceres humanos.

9. A MCL-1 é conhecida por ser crítica para a sobrevivência das células de melanoma sob
várias condições de estresse e a sua expressão também é conhecida por aumentar no
melanoma com a progressão da doença.
A redução da expressão de MCL-1 enfraquece a ligação entre proteínas da família Bcl-
2 pró e anti-apoptóticas, isso resulta na liberação de proteínas da família Bcl-2 pró-
apoptóticas.
Assim, o MCL-1 desempenha um papel único na regulação da apoptose, pois a sua
eliminação é necessária em um estágio inicial para a indução da apoptose. Portanto, os
pesquisadores avaliaram a eficácia do OEF na expressão de MCL-1 em células FM94.
Eles descobriram que o OEF regula para baixo o MCL-1 de forma dependente do
tempo (Figura 5C). Isso sugere um papel fundamental para MCL-1 na regulação da
apoptose em células FM94 induzidas por OEF.
Figura 5C: Mecanismo molecular da apoptose induzida por OEF em células FM94. A expressão
de MCL-1 de células FM94 foi determinada após 3 h, 6 h, 12 h e 24 h de tratamento com 10
μg/ml de OEF. PC indica controle positivo (5 μg/ml de doxorrubicina).
Em conclusão, os dados sugerem que OEF induziu apoptose em células de carcinoma
B16-F10 de camundongo e FM94 humano.

10. 6. Experiência de toxicidade in vivo
A toxicidade é uma limitação da quimioterapia, portanto a busca por agentes mais
seguros e tolerados pelo sistema é sempre incentivada pela OMS.
Para determinar se 1200 mg/kg de peso corporal durante 4 semanas no tratamento
com OEF provoca alterações no peso corporal e toxicidades para os órgãos principais
normais, os pesquisadores analisaram os tecidos do cérebro, coração, fígado e rim de
grupos tratados e não tratados de camundongos.
E, curiosamente, as seções histológicas desses tecidos de camundongos tratados com
OEF não mostraram quaisquer anormalidades patológicas detectáveis, conforme
examinado por coloração H&E.
Assim como nenhuma diferença significativa no peso corporal foi observada em
camundongos tratados em comparação com os animais de controle não tratados.
O fígado apresentou arquitetura lobular hepática normal, veia central intacta com
hemácias aprisionadas em uma seção do fígado de animais tratados com OEF. Os
cortes renais mostraram glomérulos, túbulos proximais e distais, interstício e vasos
sanguíneos normais. E a morfologia normal dos músculos do cérebro e do coração em
comparação com seções de tecido não tratadas (Figura 7).

11. Figura 7: Teste in vivo de toxicidade de OEF nos órgãos principais: Os camundongos foram
tratados com OEF (1200 mg/kg de peso corporal). No final do período experimental, os órgãos
principais, como cérebro, coração, fígado e rim, foram excisados e corados com hemotoxilina e
eosina (H&E). A barra de escala indica 10 μm.
7. Remissão do tumor pelo OEF
As células B16F10 de melanoma de rato é um dos cancros mais malignos em ratos e
pode servir como um bom modelo de melanoma humano para avaliar vários
tratamentos, incluindo vacinas. Portanto, neste estudo, usou-se o modelo de
xenoenxerto de melanoma através da injeção de células B16F-10 em camundongos.
O tratamento com OEF (300 e 600 mg/kg de peso corporal) reduziu o tamanho do
tumor significativamente em comparação com os animais de controle não tratados
(Figura 8).

12. Isso está de acordo com os dados in vitro. Geralmente, os óleos essenciais são
desprovidos de riscos genotóxicos de longo prazo e muitos deles apresentam
capacidade antimutagênica que pode estar ligada à atividade anticarcinogênica.
Além disso, estudos demonstraram que os constituintes do óleo essencial são muito
eficientes na redução do volume tumoral do melanoma ou proliferação de células
tumorais por exercerem efeitos apoptóticos.
Portanto, a remissão do tumor de melanoma foi observada em camundongos no grupo
de controle e os tratados com OEF. Após 14 dias, o tamanho do tumor foi reduzido em
camundongos tratados em comparação com animais de controle não tratados (Figura
8). O padrão de inibição do crescimento do tumor revelou que o tratamento com OEF
reduziu o tamanho do tumor de forma dependente da dose.

13. Figura 8: Eficácia de OEF na remissão do tumor de melanoma. O tumor foi induzido pelo
transplante de células B16F10 em camundongos – que foram tratados com OEF (300 e 600
mg/kg de peso corporal) a cada dois dias durante o período experimental (total de 14 dias) e o
volume do tumor foi medido. Podemos observar que o OEF em 300 mg/kg significativamente
reduz o volume do tumor no dia 14 em comparação com o grupo de controle. Já o OEF a 600
mg/kg significativamente reduziu a carga tumoral no dia 10, 12 e 14 em comparação com o
grupo de controle.
8. Eficácia hepatoprotetora in vivo de OEF
A hepatotoxicidade por medicamentos é a principal causa de insuficiência hepática
aguda na clínica em todo o mundo. Como exemplo, o acetaminofeno é bem conhecido
por induzir insuficiência hepática aguda e crônica.
Neste estudo, o acetaminofeno (750 mg/kg de peso corporal) foi usado para induzir
lesão hepática; e a eficácia hepatoprotetora de OEF (250 e 500 mg/kg de peso
corporal) foi analisada em camundongos com lesão hepática avaliando a hematologia
(hemograma completo).
Os parâmetros fisiológicos do hemograma mostraram que o PVC, WBC, neutrófilos,
Hb, MCHC e RBC diminuíram e os linfócitos, contagens de MCV e MCH aumentaram
significativamente em camundongos tratados com acetaminofeno (750 mg/kg de peso
corporal).
Contudo, curiosamente, a anormalidade induzida por acetaminofeno foi
significativamente revertida por tratamentos com OEF (250 e 500 mg/kg de peso
corporal).
Os resultados evidenciaram que o OEF pode proteger a lesão hepática e as
anormalidades associadas às células sanguíneas.

14. 9. Eficácia de OEF na histologia hepática de camundongos com lesão hepática
induzida por acetaminofeno
A lesão hepática induzida por drogas perturba marcadamente a morfologia e o arranjo
das células no tecido hepático.
O tratamento com acetaminofeno (750 mg/kg de peso corporal) induziu congestão
sinusoidal leve, necrose hepatocelular, dano focal ao redor da veia central,
degeneração emplumada, perda da arquitetura lobular com contornos celulares
danificados, hemorragia, núcleos condensaram-se e alteração gordurosa
microvesicular.
Contudo, esses efeitos prejudiciais do acetaminofeno foram restaurados por pré-
tratamento com OEF (250 e 500 mg/kg de peso corporal) e silimarina (25 mg/kg de
peso corporal).
10. Eficácia de OEF nos parâmetros bioquímicos de camundongos com lesão
hepática induzida por paracetamol
A alteração dos parâmetros bioquímicos é a manifestação clínica de toxicidades
sistêmicas, incluindo hepatotoxicidade. Neste estudo, os pesquisadores mediram os
níveis de biomarcadores associados à toxicidade, como AST, ALT, ALK, bilirrubina,
proteína, colesterol, glicose, relação albumina / globulina e triglicerídeos no soro.
Os camundongos tratados com paracetamol (750 mg/kg de peso corporal)
apresentaram níveis elevados de AST, ALT, ALK, bilirrubina, colesterol e triglicerídeo,
enquanto os níveis de proteína, glicose e relação albumina / globulina foram diminuídos
(Figura 10).

15. Porém, sete dias de pré-tratamento com OEF (250 e 500 mg/kg de peso corporal)
reverteram as mudanças causadas pelo paracetamol e trouxeram de volta o nível dos
parâmetros bioquímicos ao controle normal.
Figura 10: Eficácia de OEF em parâmetros bioquímicos de camundongos com lesão hepática
induzida por acetaminofeno.
Grupo I: Controle não tratado alimentado por via oral com solução salina normal (0,9% v/p) 5
ml/kg de peso corporal diariamente. Grupo II como controle hepatotóxico tratado com
acetaminofeno (750 mg/kg de peso corporal). Os grupos III e IV receberam OEF 250 e 500
mg/kg de peso corporal, respectivamente, juntamente com acetaminofeno (750 mg/kg de peso
corporal) por sete dias. Grupo V tratado com silimarina (25 mg/kg de peso corporal) com
acetaminofeno (750 mg/kg de peso corporal) por sete dias. Portanto, o gráfico (A) representa
os parâmetros fisiológicos de AST, ALT, ALK. (B) Bilirrubina total e proteína total. (C)
Colesterol, glicose e triglicerídeos. (D) Razão albumina / globulina.

16. 11. Eficácia do OEF nas enzimas de metabolização de drogas de Fase I e II
As enzimas metabolizadoras de drogas, como o citocromo p450 (Cytp450), o citocromo
b5 (Cytb5) e a glutationa-s-transferase (GST), desempenham um papel fundamental na
desintoxicação de drogas.
Para desenvolver uma formulação de medicamento baseada em OEF para o
tratamento de melanoma, é imperativo estudar a eficácia de OEF nas enzimas
mencionadas acima.
Portanto, a administração de 250 e 500 mg/kg de peso corporal de OEF por sete dias
alterou os níveis de Cytp450, Cytb5, e GST, significativamente (Figura 11).
Curiosamente, o tratamento com OEF aumentou os níveis dessas enzimas e esses
dados afirmam claramente que o OE pode reter as funções fisiológicas hepáticas em
particular a desintoxicação.

17. Figura 11: Eficácia de OEF em enzimas de metabolização de drogas de camundongos com
lesão hepática induzida por acetaminofeno.
Grupo I: Controle não tratado e alimentado por via oral com água destilada diariamente por
sete dias. Grupo II: Camundongos tratados com OEF 250 mg/kg de peso corporal. Grupo III:
Camundongos tratados com OEF 500 mg/kg corporal. Grupo IV: camundongos tratados com
BHA (hidroxianisole butilado) a 0,75% junto com dieta (controle positivo). O gráfico (A)
representa os citocromos CytP450 e Cytb5; e o (B) GST (glutationa S-transferase).
Na prática:
Uma verdadeira chuva de informações! Esse artigo testou de diversas formas a
atividade do óleo essencial de Olíbano contra melanomas (células de câncer maligno
na pele) e também identificou o mecanismo protetor das células do fígado
(hepatoproteção).
O OEF exibiu atividade antimelanoma in vitro reduzindo a viabilidade das células de
câncer (B16-F10, FM94) e sem danificar as células normais (HNEM)!

18. Além disso, o OE proporcionou a indução de apoptose via sinalização de caspase e via
dependente de MCL-1. E ainda, pode reduzir o tamanho do tumor no modelo de
animal.
Os pesquisadores também concluem que o OEF pode ser a droga mais eficaz para a
prevenção de lesão hepática, juntamente com parâmetros bioquímicos hematológicos,
histologia hepática e enzimas metabolizadoras de drogas. Incrível não é?
Sem toxicidade nas doses avaliadas, a boa notícia é que essas doses são muito
maiores do que as práticas da aromaterapia (como uso interno de 1 gota de 2 a 3
vezes por dia em processos inflamatórios).