O documento fornece informações sobre como dormir bem e prevenir problemas de saúde. Ele discute a importância de uma dieta saudável, atividade física regular e dormir o suficiente para manter o corpo e a mente saudáveis.

1. Dormir
bem
Prevenção
Dieta
Atividade
física
“An ounce of prevention is worth a pound of cure”
– Benjamin Franklyn

2. Candidato: Mauro C. Cafundó de Morais
Orientadora: Profa. Dra. Christiane P.
Soares
Programa de pós-graduação em
Biociências e Biotecnologia
aplicadas à Farmácia
Faculdade de Ciências
Farmacêuticas de Araraquara
UNESP

3. A quimioprevenção do câncer envolve
prevenção, atraso ou reversão do processo
de carcinogênese através da ingestão de
compostos na dieta ou fármacos.
OH
HO
trans-resveratrol
OH
N C
S
Vitis spp.
O
Brassica spp.
S
CH3
sulforafano
Sporn et al., Carcinogenesis, 2000, 21(3), 525

4.  Enzimas de fase 1
O
 Enzimas de fase 2
O
β-naftoflavona
Br
 Indutores bifuncionais
 Indutores monofuncionais
O
O
4’-bromoflavona
Song et al., Cancer Res., 1999, 59(3), 578

5. Indutor
Indutor
S
Indutor
S
+
SH
SH
Keap1
Nrf2
+
Keap1
Nrf2
Citoplasma
Nrf2
Nrf2
Núcleo
Small Maf
ARE
Genes de fase 2
TGACnnnGC
Dinkova-Kostova et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99(18), 11908

6.  Fator de transcrição nuclear responsável por vários genes
 Dímeros relacionados por domínios homólogos altamente
conservados (RH)
Gilmore, Oncogene, 2006, 25(51), 6680

7. Extracelular
TNFα
IKK
U
U
U
IκB P
Proteassomo 26S
U
P
IκB
IκB
NF-κB
P
+
Intracelular
NF-κB
Núcleo
NF-κB
PKA
P NF-κB
c-IAP1 & 2
Traf 1 & 2
A1/Bfl-1
Bcl-xL
Genes
Antiapoptóticos
P NF-κB
DNA
Baldwin, J. Clin. Invest., 2001, 107, 241

8. 


O uso regular de anti-inflamatórios reduz significativamente o
aparecimento de câncer
Enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) é expressa em
diversos tipos de câncer
Óxido nítrico (NO), produto de iNOS, exerce efeitos prócarcinogênicos
L-Arginine
SINGH et al., Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 2011, 67(6), 1211

9.  Enzima do complexo citocromo P450 (CYP19)
 Biossíntese de hormônios estrogênios
+ HCO2H
OH
3O2
3H2O
H
H
O
H
H
H
3NADPH
Testosterona
OH
3NADP+
Aromatase
H
HO
Estradiol
 ↑ estrogênios » ↑ chance de câncer de mama
Endringer et al., J. Nat. Prod., 2008, 71(6), 1082

11.  O acúmulo de mutações está relacionado com o
desenvolvimento da maioria dos tumores malignos e desordens
degenerativas
Identificar agentes genotóxicos e diminuir exposição a eles, e
aumentar a exposição a agentes antigenotóxicos
Moller, Basic Clin. Pharmacol. Toxicol., 2005, 96, 1

12. Áreas de prioridade para restauração da biodiversidade em SP
Mercado mundial de fármacos de
origem vegetal: US$ 12,4 bilhões
(2006)
25% do faturamento da Indústria
farmacêutica
Joly et al., Science, 2010, 328(5984), 1358

13. Pterogyne nitens T.
Fabaceae
Alchornea glandulosa P. & E.
Euphorbiaceae
Lorenzi, Árvorez Brasileiras, 2000, v.2, 3ed.

14. O presente estudo teve como objetivo fazer um
rastreamento de substâncias puras isoladas ou
sintéticas, avaliando sua atividade citotóxica.
Definir um perfil genotóxico, e avaliar a indução
de apoptose ou potencial quimiopreventivo
dessas substâncias.

15. I.
II.
III.
IV.
V.
Avaliar a citotoxicidade de substâncias isoladas ou sintéticas através de
ensaio de MTT em linhagem HepG2 e ensaio de SRB em linhagem MCF7 e MDA-MB-231 e determinar a concentração inibitória de 50% das
células (IC50).
Avaliar a genotoxicidade do AG e G1 das substâncias através do ensaio
do cometa.
Avaliar o efeito de indução de apoptose de alcalóides guanidínicos (NTA
e NTB) e bioisostero (NTT) através do ensaio de coloração com Hoechst
33342 e iodeto de propídio.
Avaliar o efeito de quimioprevenção da coleção de substâncias, através
do ensaio de inibição do fator de transcrição NF-κB, inibição da
produção de nitrito, inibição de aromatase e indução de quinonaredutase.
Avaliar o efeito inibitório de 2OICh sobre a expressão de produtos do
fator de transcrição NF-κB (iNOS e COX-2) em níveis de mRNA e proteína
por RT-PCR e western blot.

16. 










Substâncias avaliadas nos ensaios (70 substâncias – 6 grupos)
Cultura de células (HepG2, Hepa 1c1c7, MCF-7, MDA-MB-231,
HEK293/luc, RAW 264.7)
Citotoxicidade (MTT e SRB)
Ensaio do cometa (Eletroforese)
Ensaio de apoptose (Hoechst e iodeto de propídio)
Ensaio de indução de QR (Redução de MTT)
Inibição da aromatase (in vitro)
Ensaio de NF-κB/Luciferase (gene relator luc)
Ensaio de inibição da produção de nitrito (estímulo com LPS)
Análise de expressão de iNOS e COX2 (RT-PCR e western blot)
Análise estatística

17. O
OH
O
O
S O
HN
OH
H
O
O
OH O
O
TPCK
IC50 = 5,1 ± 1,5 µM
Cl
DOX
MCF-7 IC50 = 0,5 ± 0,07 µM NH2
O
OH
Br
O
OH
HO
NH2
H2N
O
OH O
O
4BF
CD = 0,01 µM
NAR
IC50 = 2,0 ± 0,5 µM
NH
N
L-NMMA
IC50 = 29,5 ± 1,2 µM
O
OH

18. O
O R
O
O R
O
R
OH
OH
R
R
N
R
R
R
R
Derivados do ácido fenâmico
R
N
R
OH
Derivados da xantona
X
R
O
R
OH
Derivados do ácido gálico (GA) e
ácido protocatecuíco (PA)
O
NH
OH
OH
R
OH
R
HO
O
R
alcalóides
guanidínicos
Derivados da
(+)-carvona (C+) e bioisóstero
O
R
R
R
R
R
R
R
O
O
Derivados da flavona (Fla) e chalcona (Ch)

19. Análogos da xantona avaliados nos ensaios:
Citotoxicidade por SRB em células MCF-7 e MDA-MB231
Inibição de NF-κB
Inibição do NO
Inibição de aromatase
Indução de QR
HO
HO
O
OH
HO
HO
O
OH
HO
ácido gálico (GA)
ácido protocatecuíco (PA)

20. 100
G4
inibição de CYP19 (%)
90
80
G5
70
NAR *
60
50
40
30
20
10
0
1,1
3,3
10,0
30,0
90,0
concentração (M)
Inibição in vitro da enzima aromatase (CYP19) pelas substâncias G4 (▲), G5 (■) e NAR
(●). Os dados referem-se às médias de dois experimentos independentes e erro
padrão (M ± EP); * P<0,05 em relação ao controle (DMSO 0,5%), One-way ANOVA.

21. Relação estrutura atividade inibição de CYP19
Esterificação foi crucial para atividade
inibitória da aromatase
O
O
R
Lipofilia interfere nessa atividade
↑ da cadeia » ↓ viabilidade celular
HO
OH
OH
HO
HO
O
HO
O
HO
O
HO
galato de butila (G4)
CYP19 IC50 = 34,6 µM
O
HO
galato de pentila (G5)
CYP19 IC50 = 28,1 µM
Hidroxilas livres não foram essenciais
Hidroxilas nas posições 3, 4 e 5 foram essenciais

22. 100
GA *
90
inibição de NF-B (%)
80
G1 *
70
G2
60
50
40
30
20
10
0
1,5
4,4
13,3
40
120
concentração (M)
Inibição da atividade de NF-κB ativado por TNFα 50 ng/mL em células HEK293/Luciferase
em relação ao controle (DMSO 0,5%), por GA (▲), G1 (■) e G2 (●). Os resultados estão
expressos como média ± erro padrão (M ± SE) de dois experimentos independentes; *
P<0,05 em relação ao controle, One-way ANOVA.

23. LPS
10.0
Concentração de nitrito (  M)
G3
G4
7.5
*
*
5.0
*
*
2.5
*
*
*
0.0
LPS
0,6
1,8
5,6
16,7
50,0
concentração (M)
Inibição da produção de NO estimulado por LPS 1 µg/mL, em células RAW 264.7 em
relação ao controle (DMSO 0,5%) por G3 e G4. Os resultados estão expressos como
média ± erro padrão (M ± SE) de três experimentos independentes; * P<0,05 em
relação ao estímulo (LPS 1 µg/mL), One-way ANOVA e pós teste de Tukey

24. 150
GA
G1
*
Tail m om ent
100
*
*
50
0
Ctrl H2O2 0,15
0,45
1,35
4
12
40
0,07
ácido gálico
0,22
0,67
2
8
25
galato de metila
concentração (M)
Genotoxicidade do ácido gálico (GA) e galato de metila (G1) pelo ensaio do cometa em
células HepG2 tratadas por 24h. Ctrl: controle (DMSO 1%); H2O2: peróxido de hidrogênio
100 µM. Os dados referem-se à média da contagem de 50 nucleóides ± erro padrão
(M±EP), * P<0,05 em relação ao controle, Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn.

25. Análogos da xantona avaliados nos ensaios:
Citotoxicidade por SRB em células MCF-7 e MDA-MB231
Inibição de NF-κB
Inibição do NO
Inibição de aromatase
Indução de QR
ácido fenâmico
O
OH
NH

26. O
O
O
OH
O
NH
OH
NH
O
O
O
O
O
O
AB4
inibição de NF-κB: 73,0 ± 5,2%
AB5
inibição de NF-κB: 72,6 ± 1,6%
inibição de NO (IC50): 28,2 ± 3,1 µM

27. Análogos da xantona avaliados nos ensaios:
Citotoxicidade por SRB em células MCF-7 e MDA-MB231
Inibição de NF-κB
Inibição do NO
Inibição de aromatase
O
OH
Indução de QR
O
O
xantona
O
benzoxantona (X9)
CD = 41,0 ± 6,1 µM
OH

28. Análogos da xantona avaliados nos ensaios:
Citotoxicidade por SRB em células MCF-7 e MDA-MB231
Inibição de NF-κB
Inibição do NO
Inibição de aromatase
Indução de QR
IR = 1,1
O
(+)-carvona

29. O
O
Inibição de NF-κB (%) a 50 µM
O
O
(+)-carvona
66,8±4,3%
O
(+)-hidroxicarvona
56,4±9,9%
(-)-carvona
61,4±6,1%
epoxido carvona
69,7±7,1%
O
(-)-hidroxicarvona
0,0±7,9%

30. Análogos da xantona avaliados nos ensaios:
Citotoxicidade por SRB em células MCF-7 e MDA-MB231
Inibição de NF-κB
Inibição do NO
Inibição de aromatase
O
Indução de QR
O
R
NH
4
N
3
R
N
2
R
R
1

31. OH
O
O
OH
O
HO
OH
HO
O
6-hidroxiflavona (6Fla )
CD = 6,5 ± 0,8 µM
Hidroxila livre essencial para indução de QR
O
pedalitina (PED)
inibição de CYP19
IC50 = 0,3 ± 0,01 µM

32. 100
NTA *
90
NTB *
80
NTT *
DOX *
cels. vivas (%)
70
60
50
40
30
20
10
0
10
20
30
40
50
Concentração (M)
Ensaio de viabilidade celular por MTT em células de HepG2 tratadas por 24h com NTA (▲),
NTB (■), NTT (●) e DOX (♦). Os dados referem-se às médias de três experimentos
independentes e erro padrão (M±EP); * P<0,05 em relação ao controle (DMSO 0,5%), Oneway ANOVA e pós-teste de Tukey.

33. 125
*
100
3
75
2
50
1
cells. vivas (%)
IR (tratam ento / controle)
4
25
0
0
4BF
Ctrl
0,6
1,7
5
15
45
concentração de NTT (M)
Indução da enzima quinona-redutase em células Hepa 1c1c7 pela substância NTT
(tratamento / controle) e relação com sobrevivência celular (%) pelo ensaio de violeta
cristal (●) tratadas por 48h. Os dados referem-se às médias de três experimentos
independentes e erro padrão (M ± EP); * P<0,05 em relação ao controle (Ctrl)(DMSO
0,5%), One-way ANOVA e pós-teste de Tukey.

34. Relação estrutura atividade inibição de CYP19
NH > S
bioisósteros
Inibição de CYP19
NTA: 67,0 ± 6,7%
NTB: 68,2 ± 5,1%
X
H
N
N
R2
R1
R1 = H ou geranila não foi crucial para
atividade inibitória da aromatase

35. A
*
Apoptose total
40
Necrose
*
30
20
10
0
Ctrl
DOX
NTA
NTB
NTT
% de cels. (tratam ento / total de cels.)
% de cels. (tratam ento / total de cels.)
50
50
B
Apoptose inicial
40
*
Apoptose tardia
30
20
10
0
Ctrl
DOX
NTA
NTB
NTT
Apoptose pelo ensaio de HO/IP em células HepG2 após tratamento com NTA, NTB e NTT
por 24 h. A: Comparação entre apoptose total e necrose. B: Comparação entre apoptose
inicial e apoptose tardia. Ctrl: controle (DMSO 0,5%); DOX: doxorrubicina 50 µg/mL.
Resultados estão expressos como média de três experimentos independentes ± erro
padrão (M±EP). * P<0,05 em relação ao controle, one-way ANOVA e pós-teste de Tukey.

36. Análogos da xantona avaliados nos ensaios:
Citotoxicidade por SRB em células MCF-7 e MDA-MB231
Inibição de NF-κB
Inibição do NO
Inibição de aromatase
Indução de QR
R2
R1
O
Ch: R1 = H, R2 = H
2OICh: R1 = O-isoprenila, R2 = H
3OFCh: R1 = H, R2 = O-farnesila
2OFCh: R1 = O-farnesila, R2 = H

37. R2
R1
O
Ch: R1 = H, R2 = H
3OFCh: R1 = H, R2 = O-farnesila
2OICh: R1 = O-isoprenila, R2 = H
2OFCh: R1 = O-farnesila, R2 = H
R1 = O-isoprenila pode ↑ efeito indutor de QR
Indução de QR (CD)
Inibição do NO (CI50)
Inibição do NF-κB
Ch: N.S.
3OFCh: N.S.
2OICh: 1,3 µM
2OFCh: 14,6 µM
Ch: 50,6% a 50 µM
3OFCh: 17,6 µM
2OICh: 7,9 µM
2OFCh: 7,2 µM
Ch: 22,8 µM
3OFCh: 16,2 µM
2OICh: 10,8 µM
2OFCh: 9,3 µM

38. concentração de nitrito (M)
10
3OFCh
2OICh
8
2OFCh
6
*
*
4
*
*
*
2
*
0
LPS
0,6
1,8
5,6
16,7
50
concentração (M)
Inibição da produção de NO estimulado por LPS 1 µg/mL, em células RAW 264.7 em
relação ao controle (DMSO 0,5%) por 3OFCh, 2OICh e 2OFCh. Os resultados estão
expressos como média ± erro padrão (M ± SE) de três experimentos independentes; *
P<0,05 em relação ao estímulo (LPS 1 µg/mL), One-way ANOVA e pós teste de Tukey.

39. 3OFCh *
100
2OICh *
2OFCh *
inibição de NF-B (%)
80
60
40
20
0
0.2
0.6
1.8
5.6
16.7
50
concentração (M)
Inibição da atividade de NF-κB ativado por TNFα 50 ng/mL em células HEK293/Luciferase
em relação ao controle (DMSO 0,5%), por 3OFCh (▲), 2OICh (■) e 2OFCh (●). Os
resultados estão expressos como média ± erro padrão (M ± SE) de três experimentos
independentes; * P<0,05 em relação ao controle, One-way ANOVA e pós-teste de Tukey.

40. iNOS (130 kDa)
COX2(72 kDa)
β-actina (43 kDa)
2OICh (µM)
1.8
5.6
16.7
0
0
LPS 1 µg/mL
+
+
+
+
–
Efeito inibitório de 2OICh na expressão de proteína iNOS e COX2 após 20 horas de
tratamento.

41.  Produtos naturais são uma fonte de moléculas bioativas e
pequenas alterações me suas estruturas podem aumentar
consideravelmente a atividade.
 ↑ cadeia lateral de derivados de GA e PA » ↓ proliferação
celular.
 GA exerce efeito genotóxico a 12 µM e 40 µM.
 O G1 não apresenta efeito genotóxico nas concentrações
testadas.
 G4 apresenta efeito de inibição da aromatase e produção
de nitrito.
 Supressão da atividade de NF-κB por ésteres de GA pode
desempenhar um papel quimiopreventivo no câncer.

42.  AB4 e AB5, com metoxilas nas posições 4’, 5’ e 6’, apresentam
atividade de quimioprevenção do câncer por inibição de NFκB.
 benzoxantona (X9) possui atividade quimiopreventiva
induzindo enzima QR em células Hepa 1c1c7.
 Alcalóides guanidínicos (NTA e NTB) e bioisóstero (NTT)
apresentaram efeito citotóxico em todos os modelos
celulares.
 NTT induz QR de maneira bifuncional.
 NTB apresentou indução de apoptose tardia em células
HepG2 após tratamento de 24 horas.
 Chalconas preniladas possuem efeito de quimioprevenção por
inibição da produção de NO em células estimuladas por LPS e
inibição do fator de transcrição nuclear NF-κB ativado.
 2-O-isoprenilchalcona é capaz de mediar um grande número
de atividades biológicas relevantes para a saúde humana.

43.  Laboratório de Citologia
• Profa. Dra. Christiane P. Soares
• Profa. Dra. Valéria Valente
 Laboratório de Farmacognosia
• Roberta A. Duarte, Ph.D.
• Prof. Dr. André G. Santos
• Maísa Giocondo, M.Sc.
• Gabrielle Alexandre
• Isabel C. Silva, M.Sc.
 UH Hilo, College of Pharmacy
• Tarsia Giabardo, M.Sc.
• John M. Pezzuto, Ph.D.
• Thaís O. R. Falcoski, M.Sc.
• Tamara P. Kondratyuk, Ph.D.
• Elaine Mello, M.Sc.
• Eun-Jung Park, Ph.D.
• Juliana M. Sorbo, M.Sc.
• Suaib Luqman, Ph.D.
• Aline Miranda
• Laura Marler
• Camila Araki
• Beau Rostama
• Daniele Agustoni
• NooJa Acharavadee
• Felipe O. Souza
• Talysa O. Hoover
• Flávio Monteiro
• Elizabeth Ryan
• Maria Isabel Feliciano
 Instituto de Química de Araraquara (NuBBE)  Agencias de fomento à pesquisa
• FAPESP (processo n. 2010/12579-5)
• Profa. Dra. Dulce H. S. Silva
• CAPES (PDEE n. 0087-11-4)
• Profa. Dra. Vanderlan S. Bolzani
• Luis Octávio Regasini, Ph.D.
• Fernando P. Maiello
• Maicon S. Petrônio