3. SIDRIM & ROCHA, 2004
Uso de antifúngicos
Amostras encaminhadas
Suspensão
Ficha padrão
4. Unhas
Pelos , Cabelos, barba e bigode
Líquidos corpóreos ou lavados
Órgãos
Pele e mucosas
4
SIDRIM & ROCHA, 2004
5. ZAIZ et al., 2010; ANVISA, 2004; VERMELHO et al., 2006
Assepsia
Lâmina dermatológica/bisturi
sem fio de corte
Jarbas Porto
Debridação da lesão
6. ZAIZ et al., 2010
Região de alopécia
Auxílio pinça flambada
Lâmpada de Wood
Antibioticoterapia prévia
7. ZAIZ et al., 2010
Tesouras, limas, alicates de unhas e curetas
dermatológicas
Região de progressão e
confluência
Swabs ou pipeta Pasteur
Região mais adentro da matriz
ungueal
8. ZAIZ et al., 2010
Swab
Exame direto e cultura
Solução salina
Refrigerar
Boca
Ânus
Vagina
Biópsia ou raspagem
Coletar as escamas
Curetagem ou biópsia
4 swabs
9. SIDRIM & ROCHA, 2004
Conjuntiva
Córnea
Tecidos e Órgãos
Raspagem ou debridação
Duas regiões bem demarcadas
Solução salina
Temperatura ambiente por até 24
horas
10. Punção lombar
3-5ml em tubo estéril
Temperatura
ambiente
LCR
Sangue
Assepsia
Anticoagulante
MINAMI, 2003
11. 20-30ml do jato intermediário
Frasco estéril
Punção suprapúbica
Urina
Máximo de 2 horas para análise
Fezes
Swab retal
Máximo 2 horas
Cary-Blair
MINAMI, 2003
14. Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica. Agência de Vigilância Sanitária. Módulo VII. 2004
Exame microscópico e cultura
Pelos, cabelos, escamas de unha
e pele
Centrifugação
Líquor, secreções e fluídos
corporais
Semeado por esgotamento
Urina
15. Digestão com enzima
Exame microscópico e cultura
Escarro
Fragmentação → coloração/cultura
Tecidos
Centrifugação e cultura
Sangue
16.
17. Pelos, pele, unha, escarro,
exsudatos espessos e
outros materiais densos
É um reativo que clarifica e digere o material clínico
Fonte: MEDRANO, D. J. A. Perfil de sensibilidade de cepas de Coccidioides posadasii a associação de drogas antimicrobianas. Universidade
Federal do Ceará - Programa de Pós-graduação em Ciências Medicas (Tese). Fortaleza, 2010. 156 p.
Coccidioides sp.
18. Lactofenol Fluido de montagem
Azul de algodão Corante
Fonte: MEDRANO, Delia Jéssica Asteta. Perfil de sensibilidade de cepas de Coccidioides posadasii a associação de drogas antimicrobianas.
FORTALEZA. 2010. (Tese) Doutorado em Microbiologia Médica- Universidade Federal do Ceará. 2010.
19. Líquor, urina, secreções ou exsudatos
Fungos capsulados
Erro frequente:
confundir linfócitos
com células de
leveduras
Nanquim preto
Criptococccus
Criptococoma.Fonte: <http://anatpat.unicamp.br/nptcripto1c.html#esfregnanquim>.
20. Gram +
Discrimina elementos fúngicos de artefatos existentes em
urina, secreções e fezes
Exceção
Aspergillus flavus Cryptococcus neoformans
SIDRIM &ROCHA, 2004
22. O calcoflúor white (CFW) é um agente clareador – celulose e quitina
Utilizado em combinação com o KOH
DANIELLE L. H.; MARYAM Gerami-Nejad; CASSANDRA Kistler-Anderson; CHERYL A. Gale. Hyphal Guidance and Invasive Growth
in Candida albicans Require the Ras-Like GTPase Rsr1p and Its GTPase-Activating Protein Bud2p. American Society for Microbiology. 2005
Candida albicans
23. Tinha nigra. Disponível em:<http://anatpat.unicamp.br/lampele2a.html>.
Avaliação dos padrões de reações teciduais
Cora o tecido – ressalta a morfologia fúngica
Cromoblastomicose - Phialophora
25. Fungos que contêm cápsula
mucopolissacarídica
Diferencia o Cryptococcus de
outros fungos similares em
tamanho e forma
Núcleos – azul
Mucinas - róseo para vermelho
Outros elementos – amarelo
Criptococoma. Fonte: <http://anatpat.unicamp.br/nptcripto1b.html#muci>.
26. Glicogênio, mucinas neutras,
membranas basais e evidenciar a
maior parte de fungos e
parasitas em tecidos
Produz artefatos facilmente
confundíveis com Histoplasma e
Eporothrix
Glicogênio, mucina, membrana
basal, fungos - vermelho
Núcleos - azul
C. neoformans
28. Pelos, unhas, escamas de pele Exame microscópico + KOH
Líquor
Exame microscópio + tinta
nanquim, coloração de gram,
coloração de Giemsa ou panótica
Fluidos oculares
Exame microscópico com KOH ou
com coloração de gram
Sangue ,medula óssea
ZAITS
29. 1-Exame microscópico + KOH, 2 - Exame microscópio + tinta nanquim, 3 -Exame microscópio com coloração
de gram, 4 - Exame microscópico com coloração de Giemsa ou panótica
Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica. Agência de Vigilância Sanitária. Módulo VII. 2004
31. Para a cultura e isolamento primário de fungos, é necessário a
utilização de dois meios de cultura
A seleção do tipo de meio é feita de acordo com a experiência
clínica do analista + dados clínicos repassados pela equipe médica
32. Amostra semeada na superfície dos meios de cultura
Inoculação – alça de níquel-cromo ou pipeta Pasteur
O material não deve ser colocado em profundidade no ágar
Temperatura de incubação para todas as amostras
41. Trichophyton
Diferenciar
T. mentagrophytes T. rubrum
Hidrólise da ureia + Hidrólise da ureia -
Leveduras dos filos Ascomicotina e Basidiomicotina
Peptona, Glicose, NaCl,
Fosfato de potássio,
monobásico, Fenol
vermelho, ureia
42. Promove o crescimento de fungos lipofílicos
Malassezia furfur
ASD
Antibióticos
Óleo de oliva
Bili de boi
Malassezia sp
48. Coccidioidis sp.
Algodonosa, branca ou
acinzentada, reverso creme -
amarronzado ao envelhecer
Hifa hialina, septado com artroconídios e
de parede celular espessa
49. Trichophyton verrucosum
Glabrosa a velutosa, relevo
rugoso, branco-amarelo ocre.
Presença de cadeias formadas por
clamidoconídios grandes.
56. Trichophyton T1
Ácido casamínico (sem vitaminas), Fosfato
monopotássico, Sulfato de magnésio,
Dextrose
T2 T1+inositol Requerimento vitamínico
T6
T3
T4
T5
T7
T1+inositol+tiamida
T1+tiamida
T1+ácido nicotínico
T. verrucosum
T. tonsuras de T. violaceum
T. equinum
Nitrato de amônio, Fosfato
monopotássico, Sulfato de
magnésio, Dextrose
Requerimento vitamínico
Trichophyton - T. megninni de T.
rubrum
T6 + sol. de histidina
60. SIDRIM & ROCHA, 2004
Alçada de colônia isolada
Suspensão em 5 ml de
soro ou plasma
Incubar a 37°C
Por 3h
Depositar uma gota da suspensão
sobre lâmina e cobrir com lamínula
Examinar ao microscópio
óptico A presença de tubo germinativo
61. Álcoois, proteínas e aminoácidos
– fontes de nitrogênio - meio
isento de nitrogênio
Levedura irá assimilar e crescer
em volta de determinadas
fontes
Pelo halo de turvação resultante
do crescimento
62.
63. Maior sensibilidade
Reações sorológicas
Reações sorológicas
Epidemiologia e monitorização – Diagnóstico?
Eficiência relacionada à: sensibilidade, especificidade e
reprodutibilidade
Antígenos – extratos brutos – conferem maior positividade
– reatividade cruzada – componentes antigênicos comuns
67. Identificação de fungos a nível de espécie
Diagnóstico precoce de infecções fúngicas invasivas
Especificidade e sensibilidade, rapidez
68.
69. Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica.
Agência de Vigilância Sanitária. Módulo VII. 2004
SIDRIM, J. L. C.; ROCHA, M. F. O. Micologia Médica à luz de
autores contemporâneos. 2ª. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,
2004
ZAITZ, C.; MARQUES, S. A., RUIZ, L. R. B.; FRAMIL, V. M. de
S. Compendio de Micologia Médica. 2ª ed. Guanabara Koogan. 2010
LACAZ
Notas do Editor
Mudar imagens
COLOCAR UMA IMAGEM
Procurar imagem de micose ocular
Procurar imagem de micose ocular
Procurar imagem de micose ocular
Mudar imagens
FAZER UM ESQUEMA!!!
Compêndio de micologia médica
O lactofenol azul de algodão é composto de lactofenol, que atua como fluido de montagem, e de azul de algodão, um corante. Os organismos suspensos no fluido de montagem são rapidamente mortos pela presença do fenol que age como citotóxico, precipitando proteínas celulares e inativando sistemas enzimáticos essenciais. O ácido lático preserva as estruturas fúngicas. A visualização e preservação de fungos através deste sistema são excelentes, uma vez que não ocorre plasmólise (retração do volume das células por perda de água) ao matar os organismos. O azul de algodão é incorporado à fórmula como corante diferencial para quitina e celulose, elementos da parede celular dos fungos.
Nanquim preto. Estes preparados examinados sem coloração adicional destacam os fungos contra o fundo negro dado pela tinta Nanquim, variando a altura do condensador e a abertura do diafragma, é possível visualizar detalhes da estrutura interna dos fungos, melhor que com qualquer dos métodos precedentes.
Cryptococcus neoformans – leveduras encapsuladas com brotamentos e de tamanho variável, mostrando um padrão puntiformes devido à retenção irregular da coloração.
Aspergillus – esta amostra não retém a coloração do violeta cristal e cora-se com Gram negativa
CORA AS CÉLULAS EVIDENCIANDO O FUNGO FAGOCITADO.
LÂMINHA – TINHA NIGRA - Paciente masculino, 37 anos, branco, transplantado renal há 2 meses. Apresenta lesões eritêmato-descamativas difusas na pele.
Tinha (do latim tinea). São um grupo de micoses superficiais, limitadas às camadas queratinizadas ou semiqueratinizadas da pele (epiderme, pelos e unhas). Os fungos (dermatófitos) utilizam a queratina como alimento. Os principais gêneros são: Microsporum, Tricophyton e Epidermophyton. As tinhas são denominadas conforme a área acometida: tinha do couro cabeludo, da barba, do pé e da mão, tinha corporal, crural (períneo, regiões glúteas e parede abdominal), e das unhas (onicomicose).
A epiderme está recoberta por hiperortoceratose lamelar. De permeio ao estrato córneo, e nos infundíbulos foliculares, notam-se estruturas fúngicas, na forma de hifas e esporos.
A técnica de Grocott é simples, feita em cortes de parafina, e permite demonstração dos fungos com grande elegância. Baseia-se numa oxidação inicial dos cortes em ácido crômico, seguida pela impregnação na solução de metenamina prata na estufa a 60ºC. É fundamental o acompanhamento da reação sob microscópio já após os primeiros 10 minutos, para interromper no ponto ótimo. Isto é feito colocando a lâmina em tiossulfato de sódio. Impregnação excessiva leva ao escurecimento de outras estruturas, principalmente fibras colágenas, e o preparado perde em especificidade e qualidade. Resultado - fundos marrom a negro, tecido claro. Pode-se recorrer a contracoloração com hematoxilina (não realizada no material demonstrado abaixo) para visualização do tecido.
IMAGEM - Fungos invadindo vasos.
Os fungos do gênero Aspergillus exibem grande predileção por vasos. Com facilidade, invadem paredes vasculares, causando vasculite necrosante e trombose, o que promove as lesões vistas na macroscopia: estas podem ser isquêmicas e/ou hemorrágicas, com predomínio de abscessos.
A reação histoquímica do ácido periódico e reativo de Schiff para grupos açúcar (para procedimento técnico, clique) demonstra o corpo celular do fungo em cor magenta forte e a cápsula polissacarídica em róseo. Realça os parasitas contra o tecido de fundo e dá detalhes dos limites entre cápsulas de fungos vizinhos nos aglomerados. Células em reprodução são também elegantemente demonstradas.
Masson-Fontana mancha marrom mostrando a formas de leveduras negras da C. neoformans (Masson-Fontana, × 1000)
Exame microscópico + KOH
Exame microscópio + tinta nanquim
Exame microscópio com coloração de gram
Exame microscópico com coloração de Giemsa ou panótica
Rosa começa aqui
Para a cultura e isolamento primário de fungos é necessário a utilização de 2 meios de cultura: Meios seletivos e não-seletivos.
Os meios seletivos são aqueles que contém algumas substâncias inibitórias que acabam que inibido o crescimento de alguns fungos e favorecendo o crescimento de outros. Enquanto que os meios não seletivos são aqueles que não apresentam inibidores, desse modo permite o crescimento de uma variedade de microrganismos.
A seleção dos meios é feito de acordo com as informações clínicas fornecidas ao laboratório. Ex: O tipo de amostra (raspado de pele, unhas, sangue, LCR) pois cada amostra requer um processamento específico. O local de onde essa amostra foi coletada no caso das unhas (onicomicose) limbo as infecções estão mais relacionadas a dermatófitos, enquanto no leito mais relacionado a leveduras-Candidas como foi falado pelo professor. E claro que a experiência do analista também não poderia ficar de fora.
As amostras clínicas devem ser inoculada na superfície do ágar com movimento de zig-zag para separar eventuais contaminantes da amostra, podendo ser utilizado para essa finalidade a alça de níquel ou a pipeta paster quando se refere a amostra líquida. O material não deve ser inoculado em profundidade do ágar, mas sim na superfície para não interferir no crescimento fúngico. Levando em consideração a temperatura de incubação de cada fungo, pois assim como na bacteriologia, os fungos também apresentam uma temperatura de incubação ótima. A temperatura de incubação para todas as amostras é recomendado uma temperatura de 30ºC devido a possibilidade do agente etiológico ser oportunista.
NENHUM – significa que a amostra não precisa passar por nenhum tratamento prévio
Tendo em vistas a diversidade das amostras que chegam no laboratório, temos de saber quais procedimentos tomar para poder fazer a inoculação no meio de cultura.
Em amostras muito liquefeita recomenda-se a centrifugação para a concentração da amostra e só depois a inoculação. Ex:. Secreções respiratórias fluidificadas como: líquor, urina (principalmente), fluidos corporais (pleura, ascítico, sinovial, pericárdio, gástrico, brôquico). Amostras obidas com Swabs (mucosa oral, nasal, olhos e conduto auditivo) deve ser embebido com salina e depois centrifugado. Para tecidos recomenda a fragmentação ou maceração da amostra e logo após fazer o imprint em lâmina. Esse procedimento tem como objetivo melhor expo microrganismo ligado ao tecido. A preparação do esfregaço a partir da amostra clínica não é recomendado devido a baixa sensibilidade, desse modo, recomenda-se que a amostra seja semeada em meio de cultura, e só depois se preparar a cultura em lâmina. Para pus, abscesso, pele, pelos e escamas não necessita de nenhuma preparação.
O meio de cultura Ágar Sabouraud dextrose é um meio utilizado em larga escala para o cultivo primário de uma variedade de fungos (filamentosos, leveduriformes, e alguns dimórficos). São utilizados em especial para o cultivo de dermatófitos uma vez que as característica macro e microscópica são descritas a partir da sua caracterização nesse meio. Em alguns casos esse ágar é acrescido antibióticos para impedir o crescimento de bactérias que possam vir prejudicar o isolamento de fungos. E para o isolamento de fungos ditos patogênicos na maioria das vezes utilizam-se Ágar mycosel que possui tanto antifúngico como antibiótico, que na maioria das vezes é cicloeximida e clorofenicol
Ágar sabouraud-infusão de cérebro e coração. É um meio enriquecido, uma variação do ágar sabouraud dextrose. Utilizado para o isolamento de fungos patogênicos, não-patogênicos e dermatófitos.
Facilita o aparecimento de estruturas de frutificação, especialmente dos macroconídios do gênero microsporum . Utilizado para diferenciar o Microsporum audoinii das demais espécie de Microsporum, uma vez que esse que essa espécie não se desenvolve nesse meio de composição pobre.
É um meio que permite o aparecimento de várias estruturas fúngicas de ornamentação e de frutificação, facilitando a identificação das estruturas fúngicas das espécie em geral.
Utilizado para a realização de microcultivo de fungos filamentosos e estoque de cepas fúgicas. Esse meio estimula a produção de macro e microconídios em microcultivo em lâmina. Pode ser encontrada na forma desidratada com a denominação de: Ágar batata (DIFCO), potato dextrose agar (OXOID), Ágar pomme-de- terre
Colônia plana, cotonosa, branca, radiada em fundo, em fundo amarelo ouro-micélio vegetativo
É um meio seletivo utilizado para o isolamento de fungos patogênicos a partir de amostras contaminadas. O ágar consiste em digerido de farinha de soja suplementado de glicose, cicloeximida e clorofenicol. Fungos sensiveis como Cryptococcus neomorfans, Trichosporon beigelli, espécie de candida e aspergillus e alguns fungos saprófitos e oportunitas também não crescem nesse meio.
Usado para diferenciação de Trichophyton rubrum das demais espécie de Trichophyton com base na produção de pigmento avermelhado desse fungo.
Promove o crescimento de fungos lipídicos, especialmente leveduras do gênero Malassezia.
Diferencia as espécie de Candida, baseado-se nas diferentes coloração adquirida pelas colônias. Sendo muito útil nos casos de infecções mistas, facilitando a diferenciação das espécie envolvidas. Candidas albicans – são verdes, C. krusei- coloração rósa, C. tropicalis- coloração púrpura, C. glabrata- coloração azul metálica
Candidas albicans – são verdes, C. krusei- coloração rósa, C. tropicalis- coloração púrpura, C. glabrata- coloração azul metálica
Cultivo em lâmina também chamado de microcultivo, é uma técnica utilizada para estudo dos aspectos microscópicos característico de micélio vegetatativo ou de frutificação. A técnica consiste em uma câmera úmida contendo uma lâmina de vidro colocada sobre um bastão de vidro colocado sobre um bastão de vidro em forma de U. Onde um pequeno quadrado de ágar batata é semeado com fungo a ser estudado. Uma lamínula é colocada sobre o bloco de ágar, e após o crescimento satisfatório a lamínula é retirada e colocada em uma lâmina corada com lactofenol azul de algodão e depois submetida a estudo microscópico do fungo.
Alexandra começa aqui
Tinea capitis: pelos infectados com alguns dermatófitos emitem fluorescência de cores variadas, como: Microsporum canis ou M. audouini – verde-azulada; Trichophyton schoenleini – verde-palha.
Pitiríase versicolor: escamas infectadas com Malassezia spp. emitem fluorescência em tom prateado.
Eritrasma: escamas infectadas com Corynebacterium minutissimum – fluorescência vermelho-coral.
Extensão filamentosa de uma célula leveduriforme que tem cerca da metade da largura e três a quatro vezes o comprimento da célula-mãe.
O teste de ID é o principal método diagnóstico de Pb, e utiliza antígenos de leveduras concentrados e/ou soro de referência. É um teste bastante simples e que não requer equipamentos de alto custo o que consequentemente estimula sua utilização. Apresenta sensibilidade superior a 80% e especificidade superior a 90%, variando de acordo com o antígeno utilizado . É um teste baseado na formação de imunocomplexos que precipitam de acordo com seu peso molecular. O que se observa no teste é de uma a três bandas de precipitina, sendo o número de bandas relacionado com os títulos de FC, informando que baixos títulos indicam infecção localizada e altos títulos, infecção disseminada. O teste de imunodifusão baseia-se no princípio de reação entre anticorpos circulantes contra epítopos do fungo no organismo do paciente e um preparado antigênico que irá reagir formando um imunocomplexo, visualizado a olho nu pela formação de uma linha de precipitação em lâmina. Alguns trabalhos relatam a glicoproteína de 43 kDa, denominada p43, como o antígeno imunodominante em P. brasiliensis. Esta glicoproteína exerce papel importante frente à adesão a laminina, o que favorece a infecção e disseminação do fungo
para os tecidos (VICENTINI et al., 1994; BLOTTA et al., 1993). Este antígeno está presente em grandes concentrações em pacientes acometidos com a forma aguda da PCM, consequentemente estes pacientes apresentam elevadas concentrações de anticorpos antigp43, apresentando bons resultados frente ao teste de imunodifusão (MENDES-GIANNINI et al., 1990; BLOTTA et al., 1993).