Apostila micologia

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Apostila micologia

  1. 1. APOSTILACURSO DE MICOLOGIA MÉDICA1
  2. 2. 1.- IntroduçãoIdentificação dos fungosGeneralidadesOs fungos são organismos eucarióticos, desprovidos de clorofila e de celulose, uniou pluricelulares sem a capacidade de formar tecido, imóveis na sua maioria. Cada célulapode gerar, por si só, um novo organismo da mesma espécie. São considerados osprincipais biodegradradores de matéria orgânica de nosso planeta.As células fúngicas apresentam morfologia variável, mostrando grande diferença emtamanho, estrutura e atividade metabólica, formando diferentes tipos de colônias quandocultivados em meios apropriados, estruturas de frutificação complexas e/ou elaboradosmecanismos de propagação e dispersão.REINO PROTOZOA: Rhinosporidium seeberiREINO CHROMISTA: Pythium insidiosum2DivisõesREINO EUMYCOTA(De Hoog et al 2000)ChytridiomycotaZygomycota Ascomycota Basidiomycota
  3. 3. Os fungos são organismos distintos das bactérias em tamanho, estrutura celular ecomposição química. Os fungos são eucariontes isto é possuem núcleos envolvidos pormembrana própria, heterotróficos, com nutrição de absorção, uni ou pluricelulares, comparede formada de polissacarídeo incluindo glucanas, mananas, quitina bem comoglicoproteínas, sem celulose. A composição desses compostos é variável e depende daposição sistemática dos fungos, ergosterol é o principal componente da membrana fúngica.A célula fúngica é constituída pelos componentes encontrados em outrosorganismos eucarióticos.As organelas citoplasmáticas e inclusões são: mitocôndrias, vacúolos, vesículas,retículo endoplasmático, microtúbulos, ribossomos e cristais de glicogênio. Os típicosaparelhos de Golgi irão estar sempre presentes. Quase todos os fungos são aeróbios e todosnecessitam matéria elaborada para sua alimentação (heterotróficos).Os fungos não ingerem seu alimento, mas possuem nutrição de absorção e parasitamseres vivos ou atacando matéria morta como sapróbios, parasitas, simbiontes ou patógenos.Os fungos se desenvolvem em meios de cultivos especiais, formam colônias que sãoclassificadas em dois tipos principais, leveduriformes e filamentosas, que se diferenciampela macromorfologia e micromorfologia.As colônias de leveduras são, em geral, de consistência cremosa de cor branca acreme, brilhantes ou opacas podendo apresentar às vezes coloração escura ou alaranjada.As leveduras produzem células simples, arredondadas, ovais ou alongadas que sereproduzem quase sempre por brotamento, geralmente na posição polar chamadas deblastoconídio. Algumas leveduras podem produzir, brotos simultaneamente em váriospontos.Os brotamentos ou células filhas são liberados da célula mãe, formando célulasindependentes ou continuar unidos formando células alongadas chamadas de pseudohifasque se diferenciam das hifas verdadeiras por apresentarem constrição nos septos. Além dosblastoconídios as leveduras podem apresentar artroconídios, pseudohifas eclamidoconídios típicos.As colônias de fungos filamentosos podem ser granulares, cotonosas, aveludadas,pulverulentas, membranosas. O seu talo consiste de hifas que podem ser contínuas ou3
  4. 4. interrompidas em intervalos irregulares por septos (septada) que dividem as hifas emcélulas.Um conjunto de hifas forma o micélio que pode ser vegetativo ou reprodutivo. Omicélio vegetativo penetra no meio de cultivo, para absorver substâncias nutritivas para ofungo. O micélio vegetativo é o que fica na parte superior do meio e produz as estruturas dereprodução típicas para cada grupo de fungos.Os fungos sexuados se reproduzem por esporos que podem ser formados internamente(ascoporas) ou externamente (basidiosporas).Os fungos sexuados também se reproduzem assexuadamente.Na reprodução assexuada, as estruturas de reprodução tomam nomes variados deacordo com o grupo a que pertencem os fungos.Conídios são estruturas assexuadas de reprodução encontradas entre os fungosfilamentosos. Podem apresentar tamanhos, formação, cores e septos diferentes(macroconídios, microconídios, ameroconídios, didimoconídios, fragmoconídios,dictioconídios, etc.). As hifas que sustentam os conídios são denominadas de conidióforose as células que dão origem aos conídios conidiogênicas.Os conídios podem ser claros ou hialinos – hialoconídios ou pigmentados e escuros- feoconídios.Entre os fungos de hifas não septadas, as hifas aéreas produzem esporos assexuados(esporangiosporos) dentro de estruturas chamadas esporângios. As hifas que sustentam osesporângios são conhecidas como esporangióforos.Columela é uma invaginação estéril do esporangióforo na área fértil do esporângio.4
  5. 5. 2.- Coleta de Material BiológicoA coleta de material biológico é a primeira etapa no processo de identificação dosfungos. Quando realizada incorretamente, dificulta a observação, isolamento e identificaçãodo agente causal da doença.O primeiro passo consiste em obter os dados do paciente: nome, idade, RG,procedência, endereço, telefone para contato, entre outros; dados epidemiológicos:profissão, contato com animais, doença associada, estado imunológico, etc; informaçõesclínicas: local anatômico acometido, aspecto da lesão, suspeita clínica, antibioticoterapiaprévia, evolução e dados do médico responsável.O procedimento de coleta varia segundo a região acometida, suspeita clínica e tipode material biológico. A quantidade de amostra coletada deve ser suficiente para permitir oprocedimento de identificação laboratorial do fungo: como exame microscópico direto ecultivos em vários meios, com eventuais repetições desses exames para confirmação dosachados laboratoriais.Procedimento da coletaPara efeitos práticos, a coleta de material biológico, depende da localização e dotipo da micose.• Amostras de micoses superficiais e cutâneasTambém denominadas dermatomicoses acometem: pele, pêlo, unhas, provocandoalgumas delas alterações somente de importância estética.A.- Amostras de pele.A prévia desinfecção da lesão com algodão embebido em álcool 70% diminui abiota bacteriana, aumentando a sensibilidade do exame micológico.5
  6. 6. Raspar a lesão com bisturi, cureta esterilizada ou com lâminas de vidro previamenteflambadas. Nas lesões sugestivas de dermatofitose, a coleta deve ser feita nas bordas dalesão, já que este é o sitio ativo da infecção.Quando o raspado da lesão não pode ser realizado, pode-se optar por métodos taiscomo o de Porto (só para pitiríase versicolor) que consiste em utilizar uma fita adesivatransparente (Durex) que é pressionada sobre a lesão, removida e fixada sobre uma lâminaou a utilização de um tapetinho estéril de aproximadamente 4 cm que e pressionado sobre alesão, embrulhado e transportado ao laboratório (Mariat & Tapia, 1966). As desvantagenssão a falta do cultivo ao empregar a técnica de Porto e do exame direto, quando se usa otapetinho.B.- Amostras de unha.A lesão pode-se localizar na região subungueal distal, proximal ou lâminasuperficial da unha. A tomada amostra dependerá do tipo de lesão.Deve-se remover a presença de esmalte antes da coleta. Na onicomicose superficialbranca, raspa-se as áreas esbranquiçadas da parte superficial com o auxilio de bisturi estéril.No acometimento sub-ungueal, deve-se raspar profundamente a área infectada desde aporção distal à proximal.Os primeiros detritos coletados da porção distal deverão ser eliminados já que sãoricos em contaminantes. As escamas obtidas da porção profunda da lesão poderão serusadas para o exame micológico. Quando as unhas são distróficas, pode-se auxiliar a coletacom tesouras limpas e desinfetadas.C.- Amostras de cabelo e pêlo.Nos casos de piedras cortam-se com tesoura os cabelos ou pêlos apresentandonódulos fúngicos (observados com auxilio de lupa).Nas tinhas do couro cabeludo e da barba, as amostras podem incluir escamas da pelee os pêlos ou cabelos alterados. Os cabelos opacos e engrossados são facilmentearrancados, a partir das bordas das placas alopécicas com ajuda de uma pinça limpa eflambada.6
  7. 7. Os pêlos, escamas de pele ou de unhas, podem ser colhidos e transportados entreduas lâminas de vidro limpas, secas e flambadas, embrulhadas em papel, ou em placasesterilizadas, sempre com a identificação da amostra.D.- Amostras oculares.Material de conjuntiva é colhida da mucosa, desde a porção proximal em direção aborda, com "swab" estéril, embebido em solução salina. O "swab" pode ser colocado numtubo estéril, contendo meio semi-sólido de transporte ou 0,5ml de solução salina.Material ocular (córnea) colhido só por oftalmologistas, raspando as áreasnecróticas, ulceradas e supurativas da lesão com espátula esterilizada. Esta amostra seráprocessada em lâmina (exame microscópico direto) e semeada imediatamente nos meios decultivo apropriados ou tubo estéril contendo solução salina.E.- Amostras óticas.Geralmente o material biológico é obtido a partir do conduto auditivo externo, com“swab” esterilizado umedecido previamente em solução salina.E.- Mucosas.i- Mucosa oral.As amostras devem ser obtidas por raspado da superfície epitelial acometida,empregando espátula ou bisturi rombo esterilizado. Na candidíase oral em que se verificamplacas esbranquiçadas, o material pode ser colhido com “swab” estéril, ou alça de platina,colocar em tubo esterilizado contendo solução salina.ii- Mucosa nasal.O material nasal pode ser colhido com espátula, bisturi, alça ou ¨swab¨. Nos casosde suspeita de aspergilose, feohifomicose, zigomicose ou rinosporidiose, recomenda-secoleta do material com procedimento cirúrgico, como biópsia, etc.7
  8. 8. iii- Mucosa vaginal.As amostras de fluxo vaginal se tomam sem asseio prévio da paciente, com “swab”,colocar em um tubo com solução salina esterilizada.iv- Mucosa genital Masculina.A amostra pode ser colhida com swab da área da glande que apresenta pontosesbranquiçados ou pseudomembranas, ou do prepúcio em onde podem ser encontradas,vesículas.v- Mucosa perianal.Pode apresentar lesões esbranquiçadas ou ulceradas de aspecto granulomatosos. Asamostras são obtidas por raspado com bisturi rombo estéril ou “swab”• Micoses subcutanêasA.- Lesões sugestivas de Esporotricose.No caso de abscessos fechados a obtenção de material purulento é feita por punção,com seringa esterilizada ou por drenagem com prévia limpeza da zona implicada. Quando oabscesso drena espontaneamente, o material purulento deve ser colhido com espátula, alçaou “swab” e transferido a um tubo estéril de tampa de rosca, com solução salina.B.- Lesões sugestivas de Micetoma.O material compreende pus que deve conter grãos que podem ser visíveis a olho nu.Quando é difícil a coleta da amostra, recomenda-se colocar gaze sobre a superfície lesadapor 18 a 24 h o que permitirá recuperar os grãos para o estudo micológico completo.C.- Lesões sugestivas de Cromoblastomicose.Na superfície cutânea lesada, observam-se geralmente pontos negros devido àeliminação trans-epitelial do fungo. O material biológico deve ser coletado a partir dospontos enegrecidos da lesão. Escamas e crostas com auxilio de bisturi e agulhas estéreis,biópsias podem também ser obtidas.8
  9. 9. D.- Lesões sugestivas de Lobomicose ( Doença de Jorge Lobo).A amostra compreende material biológico coletado por biopsia ou secreção daslesões ulceradas colhidas com espátula, bisturi rombo, alça ou ´swab¨ e transferido a umtubo estéril contendo solução salina. O exame microscópico direto e/ou anatomopatológicoconfirmam o diagnóstico de lobomicose. Cultura não obtida, até o presente.E.- Lesões sugestivas de RinosporídioseO material biológico deve ser colhido da superfície de crescimento polipóide.Exame microscópico direto e cortes de tecido corados confirmam o diagnóstico.F.- Feohifomicose subcutâneaColher o material dos abscessos subcutâneos por punção ou biópsia. Fazer examemicroscópico direto, cultura e cortes sem coloração.G.- Zigomicose subcutâneaColher uma pequena porção do material por biópsia. Fazer preparações, examemicroscópico direto com KOH, anátomo patológico e cultura.• Amostras de micoses sistêmicasA.- Trato respiratório.i- Escarro.Amostras de escarro são coletadas após prévia lavagem bucal preferentemente emjejum. O material deverá conter escarro profundo, livre de saliva e será colhido em frascoestéril de boca larga. No caso dos pacientes que não expectoram facilmente, podem serusadas nebulização, com solução salina hipertônica.9
  10. 10. ii- Lavado brônquico.Procedimento realizado pelo médico com broncoscópio. O material clínico écolocado em frasco estéril e enviado ao laboratório.Aproximadamente 1 ml de escarro ou lavado brônquico, é levado a um tubo cônicode centrifuga contendo 250 ul aproximadamente de KOH 20% mais tinta, sendo incubadapor 12 h a 37ºC. O material biológico é centrifugado a 2500 rpm durante 10 minutos. Apreparação microscópica é realizada a partir do sedimento.B.- Biópsia.Devem ser obtidas amostras representativas da patologia suspeita. O material deveser dividido em dois frascos estéreis diferentes, um contendo formol ao 0.4% e outrocontendo solução salina, destinados ao exame histopatológico e micológico,respectivamente.C.- Medula óssea.É um procedimento médico que exige rigorosa assepsia. Podem ser obtidas 2-3 mldo material com seringa com heparina, que deve ser transportado imediatamente aolaboratório micológico.D.- Líquido cefalorraquídiano (LCR)Para o estudo micológico devem ser colhidos 5 a 10 ml de LCR, obtido por punçãolombar, em condições de rigorosa assepsia. O LCR é normalmente, livre demicrorganismos. Qualquer agente observado deve ser considerado como um patógenopotencial.E.- SangueRealizar assepsia do sitio escolhido para puncionar com álcool 70 % esperar 5segundos e aplicar solução de Iodo-povidine a 10%, coletar de 8 a 10 ml de sangue venoso(adultos) e de 1 a 3 ml (crianças), para cada frasco coletado. Terminada a punção retirar a10
  11. 11. agulha trocando-a por uma nova, inocular o sangue no frasco enviando de imediato aolaboratório.Número e intervalo das amostras:-Suspeita de septicemia: colher duas amostras de sangue de diferentes locais com intervalode uma hora.-Febre de origem desconhecida: colher duas amostras com intervalo de uma hora. Se foremnegativos, após 24 a 36 h, colher as outras duas amostras com intervalo de 1 hora.F.-UrinaA assepsia com água e sabão da região genital deve ser rigorosa pudendo após lavarcom povidine, enxugar com água estéril e secar com gaze estéril. (sexo masculino retrair oprepúcio e lavar a zona do glande e meato urinário)Coletar 10 ml de urina do segundo jato urinário (sexo feminino afastando os grandeslábios) em frasco esterilizado.Crianças: Fazer assepsia rigorosa dos genitais e região perianal com água e sabão,colocar o coletor urinário adequado segundo sexo, uma vez obtida a amostra mandar ocoletor fechado ao laboratório. (o coletor deverá ser trocado a cada 30-40 minutos caso acriança não tenha urinado)Paciente com sonda vesical de permanência: Desprezar a urina remanescente nasonda vesical permitindo a descida desta para a bolsa coletora, pinçar a sonda vesical 20 cmde distal a proximal logo que a urina fresca se acumule. Prévia assepsia com álcool 70 %,coletar 10 ml da amostra puncionando no lugar do dispositivo para coleta de urina, edepositar em tubo esterilizado adequadamente fechado e transportar ao laboratório. (nocaso da sonda urinária não apresentar dispositivo para coleta de urina é recomendáveldesligar a sonda vesical do sistema de drenagem e obter amostra de urina mediante gota agota diretamente no frasco estéril. Todo o procedimento deverá ser realizado respeitando asnormas de assepsia).11
  12. 12. G.- Fezes.Aproximadamente 20g de fezes recém emitidas devem ser coletadas em frascoesterilizado e enviadas rapidamente ao laboratório. Para cultivo de vigilância, utiliza-se“swab” anal.H.- Outros líquidos corporais.Todos os líquidos corpóreos são obtidos por aspirações percutânea ou drenagem,empregando procedimentos invasivos praticados pelo médico. Deve ser coletado tantolíquido quanto seja possível 2 a 10 ml ou mais, pois as concentrações dos microrganismospodem ser muito baixas e coletadas em recipientes com tampa rosca contendo heparina1:1000.Todas as amostras de material clínico devem ser colhidas adequadamente, emcondições ideais e transportadas rapidamente ao laboratório, com a solicitação do tipo deexame, suspeita clínica, dados clínicos e epidemiológicos do paciente, para processamentomicológico imediato.3.- Exame Microscópico Direto e CulturaO exame microscópico direto de material clínico é um dos procedimentos maissimples e úteis para o diagnóstico laboratorial de infecções fúngicas. Vários clarificadorespodem ser usados, sendo KOH a 10 ou 20% o mais empregado.A observação de elementos fúngicos em escamas de pele, pêlos ou unhas podeproporcionar uma clara indicação do tipo de micoses envolvida: dermatofitose, candidíaseou pitiríase versicolor.O exame microscópico direto de fluidos, biópsia ou outro material clínico podetambém estabelecer o diagnóstico de uma micose sistêmica, orientando a etiologia dainfecção como paracoccidioidomicose, histoplasmose, zigomicose, hialohifomicose,feohifomicose entre outras.12
  13. 13. Técnica:Colocar parte do material biológico a ser estudado sobre lâmina limpa, adicionaruma a duas gotas de KOH a 20%, cobrir com lamínula e flambar ligeiramente.As lâminas previamente marcadas serão colocadas em câmara úmida, “overnight” a4 °C e posteriormente se realizará a segunda observação microscópica.Nunca se deve pressionar a lamínula com os dedos, uma vez que os ácidos graxosnaturais da pele dificultam a observação. Quando a amostra é muito espessa é aconselhávelpressionar a lamínula com uma pinça ou outro objeto. O fungo pode ser então liberado domaterial biológico, o que permite sua visualização.A adição de tinta Parker (Quink) azul permanente ou tinta Scheaffer 22 ao KOH,permite melhor visualização e contraste dos fungos em especial das células de Malasseziafurfur que se tingem mais intensamente do que outras estruturas fúngicas.Outras substâncias tais como goma de Berlesse, DMSO e Chloroblack E podem serempregadas na visualização do fungo a partir do material biológico.Para verificação da presença de cápsula, devem-se fazer preparações do materialclínico com tinta da China, diluída 1:1 em água destilada ou salina esterilizada.Cultura dos Fungos:Os fungos preferencialmente se desenvolvem à temperatura de 25°C, sendo seucrescimento mais lento que o das bactérias. Por isto há necessidade de acrescentarinibidores bacterianos aos meios de cultura ao trabalhar com material biológicocontaminado. Entre os antibióticos cloranfenicol 50 a 300 mg/l é empregado para inibir odesenvolvimento de bactérias. Para inibir o crescimento de determinados fungoscontaminantes do ar que têm desenvolvimento rápido deve-se usar cicloheximida.Fungos filamentosos crescem melhor entre 24 e 28°C e os leveduriformes entre 24 e 37°C,em pH de 6,6 a 7,2.Existe um grupo de fungos que apresenta dimorfismo térmico: uma fase saprofítica oufilamentosa à temperatura (24-28°C) e uma fase parasitária ou leveduriforme a 37°C.São os fungos dimórficos: S. schenckii, H. capsulatum, P. brasiliensis, B.dermatitidis.13
  14. 14. Técnica:A semeadura está na dependência do tipo de amostra e da suspeita clínica. Pêlos,escamas de pele ou de unhas, serão semeadas em 6 a 8 picadas com alça em L sobre ágarinclinado em tubo. Fluidos biológicos como LCR, lavado brônquico, etc., serãocentrifugados a 3000 rpm. por 5 minutos e semeados com pipeta Pasteur estéril ou pipetagraduada sobre ágar inclinado. Material de biopsia deve ser fragmentado e semeadofazendo picadas na superfície do ágar. Amostras de hemoculturas serão semeadasacrescentando 0,5 ml do caldo na superfície do meio.A adequada coleta e transporte de material biológico são essenciais para se obter odiagnóstico micológico preciso.14
  15. 15. LISTA DE MATERIAL BIOLÓGICO, EXAMENS MICROSCÓPICOS DIRETOS E MEIOS DE CULTURA PARA ODIAGNÓSTICO LABORATORIAL DAS MICOSESMicoses Amostra clínica Exame Microscópico Direto Meio de Cultura AgentesetiológicosT°e tempo deincubaçãoPitiriaseVersicolorEscamas de Pele Células leveduriformes esféricasovaladas com ou sem brotamentoe filamentos curtos septados.Ágar bile de boiadicionado de azeite deolivaMalassezia furfur 37°C durante7 diasTinha negra Escamas de Pele Hifas escuras septadas,irregulares.Sabouraud-dextroseágar**; Lactrimel ágar**Hortae werneckii 25°C durante20 diasPiedra negra Cabelo Nódulos marron - escuros,formados por artroconídiosescuros; ascos com 2 a 8ascosporos típicosSabouraud-dextroseágar**.Piedraia hortae 25°C durante30 dias.Piedra branca Pêlos regiãogenitais, axilares,etc.Nódulos claros, formados porartroconidós claros e blastocon.Sabouraud-dextroseágar**; Lactrimel ágar**Trichosporon spp 25°C durante7 diasDermatofitosedo courocabeludoCabelo com raíz Artroconídios refringentesectothrix, endothrix ouectoendothrix. Parasitismo fávicoSabouraud-dextroseágar**; Lactrimelágar**. MycoselMicrosporum spp,Trichophyton spp.25°C durante15 a 30 diasDermatofitoseda pele.Escamas e pêlos Hifas septadas, ramificadas. Sabouraud-dextroseágar*; Lactrimel ágar**.MycoselEpidermophytonspp, Microsporumspp, Trichophytonspp.25°C durante15 a 30 diasOnicomicoseborda livreespessa.Escamas lâminainterna da unha(raramente lâminaexterna)Hifas septadas com artroconídiosretangulares ou esféricos.Sabouraud-dextroseágar*; Lactrimel ágar**.MycoselTrichophyton spp. 25°C durante15 a 30 dias15
  16. 16. Onicomicose bordalivre fina e de bordaperiungueal(candidíase)Escamas lâminainterna da unha edo arcoperiunguealCélulas leveduriformes e/oupseudohifasSabouraud-dextroseágar**; Lactrimelágar**Candida albicans,Candida spp.25°C durante7 a 15 diasCromomicose Crostas, secreçãoou pus.Estruturas globosas de cormarrom, de parede grossa,septada em dois planos(corpos escleróticos) ou talomoriforme.Sabouraud-dextroseágar**; Lactrimelágar**Phialophora spp,Cladosporium spp,Rhinocladiella spp.Fonsecaea spp.25°C durante20 diasEsporotricose Secreção ou pus Leveduras alongadas comocharuto, o observadasraramente.Sabouraud-dextroseágar**; Lactrimelágar**.Sporothrix schenckii 25°C e 37 °Cdurante 20diasEumicetoma Secreção ou pus Grânulos parasitáriosformados por aglomeraçãode hifas claras ou escurasSabouraud-dextroseágar**; Lactrimelágar**.Madurella spp (grãosescuros),Pseudallescheriaboydii (grãos claros),Acremonium spp, P.romeroi25°C durante20 diasRinosporidiose Descarga nasalou tecido dopólipoEsférulas até 350 paredesespessas em diversos grausde maturaçãoRhinosporidiumseeberiLobomicose Material de lesãoqueloides etumoresCélulas leveduriformestamanho uniforme 9-10 um.Uma ponte tubular une umacélula a outraGlenosporella loboi,Loboa loboi, P. loboiFeohifomicose Secreção ou pus Hifas escuras septadas,elementos leveduriformes,sem corpos escleróticosSabouraud-dextroseágar**; Lactrimelágar**Phialophora spp,Cladosporium spp.,Fonsecaea spp.,Wangiella spp.25°C durante20 diasZigomicose Nódulos Hifas largas não septadas Sabouraud-dextrose Conidiobolus16
  17. 17. subcutânea subcutâneos com reação eosinofílica(corte)ágar*; coronatus,BasidiobolushaptosporusParacoccidioidomicoseEscarro, pus,raspado demucosa, etc.Células esféricas de tamanhovariável de membranasduplas com um ou muitosbrotamentos, célulasesfericas isoladas, célulascaten., Células caliciformes.Sabouraud-dextroseágar*; Lactrimelágar**Paracoccidioidesbrasiliensis25°C e 37°Cdurante 30diasHistoplasmose Escarro, raspadodas lesões.Células leveduriformespequenas 2-3m, esféricasou ovaladas no interior demacrófagos oumononucleares (coloraçãocom Giemsa).Sabourad-dextroseágar*;Lactrimelágar,Histoplasmacapsulatum25°C e 37°Cdurante 30diasCriptococose L.C.R., escarro,pus, etcCélulas leveduriformesesféricas com cápsula grande(em observação com tinta daChina)Sabouraud-dextroseágar*; Lactrimelágar**.Cryptococcusneoformans37°C durante15 diasCandidíase Raspado mucosa,biopsia, escarro,etc.Células leveduriformes oupseudohifasSabouraud-dextroseágar*; Lactrimelágar**.Candida albicans,Candida spp.37°C durante15 diasOtomicose Pseudomembrana com pontos decores ou massaem migalha depãoFilamentos com ou semcabeças aspergilares oucélulas leveduriformes epseudohifasSabouraud-dextroseágar**; Lactrimelágar**.Aspergillus niger, A.Fumigatus, Aspergillusspp, Candida albicans,etc..25°C durante15 dias* Meio adicionado de Cicloheximida e cloranfenicol.; ** Meio adicionado de cloranfenicol17
  18. 18. Micologia médica, micoses e seus agentesEm micologia médica, as micoses são divididas para seu estudo em:Micoses superficiaisOs agentes de micoses superficiais, formam um grupo heterogêneo de fungos quenão sensibilizam o indivíduo, não provocam reações alérgicas a distancia como os agentesde micoses cutâneas.Malassezia furfur, Hortae werneckii, Trichosporon spp., Piedraia hortae são osfungos envolvidos nessas micoses.MICOSESCUTÂNEAS:DERMATOFITOSESCANDIDIASESMICOSESCUTÂNEAS:DERMATOFITOSESCANDIDIASESMICOSESSUBCUTÂNEAS:ESPOROTRICOSECROMOBLASTOMICOSEMICETOMASRINOSPORIDIOSEENTOMOFTOROMICOSEMICOSE DO JORGELOBOMICOSESSUBCUTÂNEAS:ESPOROTRICOSECROMOBLASTOMICOSEMICETOMASRINOSPORIDIOSEENTOMOFTOROMICOSEMICOSE DO JORGELOBOMICOSESSUPERFICIAIS:PITIRIASESVERSICOLORTINHA NEGRAPIEDRA NEGRAPIEDRA BRANCAMICOSESSUPERFICIAIS:PITIRIASESVERSICOLORTINHA NEGRAPIEDRA NEGRAPIEDRA BRANCAMICOSES SISTÊMICAS:PARACOCCIDIOIDOMICOSEBLASTOMICOSEHISTOPLASMOSECOCCIDIOIDOMICOSEMICOSES SISTÊMICAS:PARACOCCIDIOIDOMICOSEBLASTOMICOSEHISTOPLASMOSECOCCIDIOIDOMICOSEMICOSESOPORTUNÍSTICAS:ZIGOMICOSESHIALOHIFOMICOSEFEOHIFOMICOSECANDIDIASECRIPTOCOCOSEASPERGILOSEPNEUMOCISTOSELEVEDUROSESMICOSESOPORTUNÍSTICAS:ZIGOMICOSESHIALOHIFOMICOSEFEOHIFOMICOSECANDIDIASECRIPTOCOCOSEASPERGILOSEPNEUMOCISTOSELEVEDUROSES18
  19. 19. Malassezia furfur - Agente da pitíriase versicolor, afecção cutânea assintomáticaque se caracteriza por placas descamativas de diferentes cores: castanho-avermelhadas,marrons ou brancas. O papel do fungo em doenças de natureza seborreica como psoríase,dermatite seborreica, foliculite é discutível.M. furfur tem sido isolada também de infecções sistêmicas, principalmente emneonatos.Hortae werneckii - agente da tinha negra, lesão que se caracteriza pela formação demancha pouca descamativas de coloração castanha a preta, principalmente nas palmas dasmãos. Essas lesões vão aumentando de tamanho, durante meses ou anos.Trichosporon spp - causa piedra branca, que consiste em nódulos castanho-clarose macios em torno de pêlos da região genital, axilar e do couro cabeludo. Os nódulos sãomenos aderentes que os da piedra negra. Nos pacientes com imunodeficiência, pode ocorrerinvasão do sangue, dos rins, dos pulmões e da pele.Piedraia hortae - produz piedra negra, que consiste em nódulos duros, pretos efirmes em torno dos cabelos.Micoses cutâneasAgrupam as dermatofitoses e as candidíase cutâneas. Os agentes das micosescutâneas atacam a epidermes e as camadas mais profundas da córnea, chegando a produzirgranulomas, se localizando na pele, pêlos, unhas e mucosas.Os dermatófitos são fungos relacionados entre si que invadem a queratina morta.Pertencem aos gêneros Microsporum, Epidermophyton e Trichophyton. As espéciesgeofílicas vivem principalmente no solo; as zoofílicas, em animais; as antropofílicas, nosseres humanos.Esses fungos infectam locais específicos do corpo, que servem de base para odiagnóstico clínico. A localização da dermatofitose pode ajudar na identificação preliminardo fungo.19
  20. 20. AGENTE PELE UNHAS PÊLO INVASÃOECTÓTRICAPÊLO INVASÃOENDÓTRICAMicrosporum + +(raro) + -Epidermophyton + - - -T.mentagrophytes + + + -T.rubrum + + + (raro) -T. verrucosum + + + -T.tonsurans + + - +T.shoenleinii + + - +T.violaceum + + - +Microsporum canis - causa dermatofitose do corpo e do couro cabeludo, geralmenteencontrado em crianças adquirido de animais infectados como cães e gatos.Microsporum gypseum - causa dermatofitose inflamatória do corpo ou do courocabeludo, contraído por contato com solo contaminado.Epidermophyton floccosum - dermatofitose epidêmica (pé de atleta) em locais deveraneio, bem como dematofitose inguinal.Trichophyton rubrum - dermatofitose do corpo, dos pés, da virilha e das unhas. Empaciente imunodeprimidos, pode causar nódulos ou abscessos subcutâneos.Trichophyton mentagrophytes - dermatofitose inflamatória nos pés, no corpo, nasunhas, na barba e no couro cabeludo. É causa comum de pé de atleta, apresenta asvariedades granular e cotonosa.Trichophyton tonsurans - causa tinha do couro cabeludo, tinha capilar com pontospretos e às vezes dermatofitose do corpo, dos pés e das unhas.Trichophyton verrucosum - dermatofitose do couro cabeludo, da barba ou do corpo,geralmente adquirida por contato com o gado infectado.20
  21. 21. Trichophyton shoenleinii: dermatofitose do couro cabeludo chamado FAVO (tinhafavosa) com alopécia definitiva, raramente, dermatofitose do corpo ou das unhas.CandidíasesSão causadas primordialmente por C. albicans, embora outras espécies de Candidaestejam se tornando cada vez mais importantes como agentes etiológicos. A C. albicansexiste como normal no trato gastrointestinal, na área vulvovaginal, na pele e fezes. Emcasos de comprometimento imunológico e conseqüente queda da resistência causados porAIDS, neoplasias, lúpus eritematoso, tuberculose ou terapias com esteróides ou agentescitotóxicos, as leveduras podem proliferar e causar auto-infecções.As candidíases atingem principalmente as mucosas, exemplo candidíase oral.broncopulmonar, vulvovaginal; candidíase mucocutânea crônica, cutânea, ungueal, etc. sãoalgumas das manifestações que podem ocorrer.Micoses subcutâneasOs agentes de micoses subcutâneas, tem habitat no solo. Podem ocorrer micosessubcutâneas quando há traumatismo por espinhos ou outro tipo de vegetação ou materiaiscontaminados por fungos. Os organismos alojam-se na pele e passam a produzir infecçãolocalizada na pele e no tecido subcutâneo e às vezes nos linfonodos da região. Raramente ainfecção se se dissemina. As lesões subcutâneas caracterizam-se pela cronicidade de áreasduras, nodulosas, crostosas e ulceradas. Que não cicatrizam e periodicamente produzemexsudação. Os membros inferiores, sobretudo os pés, são muitas vezes comprometidos,visto que seu contato com espinhos e outros vegetais é mais freqüente.Esporotricose – Esta infecção decorre de ferimentos cutâneos provocados pormateriais contaminados, como espinhos de flores, gravetos, madeira, etc. Produz lesõesulcerativas subcutâneas, nos membros, que podem avançar ao longo dos vasos linfáticos. Aesporotricose pulmonar está sendo observada com mais freqüência, deve ser distinguida datuberculose, coccidioidomicose, histoplasmose e sarcoidose.O agente etiológico é Sporothrix schenckii, fungo dimórfico.21
  22. 22. Cromoblastomicose – As lesões produzidas evoluem com grande lentidão torna-se,vão-se formando muitas protuberâncias sobrepostas, o que cria a aparência de couve-flor.Geralmente, a erupção é seca, mas pode ulcerar-se. Na suas camadas mais profundas,encontram-se corpos escleróticos.Os principais agentes envolvidos: F. pedrosoi, F. compacta, P. verrucosa, C.carrionii, Rhinocadiella aquaspersa.Micetomas – O micetoma geralmente se restringe aos pés, mas pode ser visto emoutras regiões como mãos e nádegas.Os nódulos, que periodicamente exsudam um líquido oleoso contem grãos que podem serbrancos, amarelos, vermelhos ou pretos. Aos poucos as lesões comprometem toda a perna.A infecção causada pelos fungos superiores (micetoma eumicótico) produz lesõesfistulosas, com pouca dor ou destruição óssea, enquanto a causada por bactériasfungiformes (micetoma actinomicótico) apresenta lesões tumorosas cônicas semelhantes àserupções de acne, com grande exsudação e comprometimento ósseo com dor.Principais agentes de micetoma eumicótico: Scedosporium apiospermum,Acremonium falciforme, Acremonium recifei, Exophiala jeanselmei, Madurellamycetomatis, Madurella grisea.Principais agentes de micetoma actinomicótico: Nocardia asteroides, Nocardiabrasiliensis, Nocardia otitidiscavarium, Actinomadura madurae, Actinomadura pelletierii,Streptomyces somaliensis, Actinomyces israelii e Actinomyces bovis.Rinosporidiose – doença que se caracteriza pela formação de granuloma vegetante,poliposo, com sede predominantemente nasal ou ocular. (conjuntiva palpebral, conjuntivabulbar e saco lacrimal). Já foram verificados casos de localização vaginal, retal e peniana,assim como no conduto auditivo externo.Agente etiológico Rhinosporidium seeberi que não tem sido cultivado.Entomoftoromicose ou zigomicose subcutânea – Granuloma eosinofilico causadospor zigomicetos que invadem primariamente a gordura do tecido celular subcutâneo. É22
  23. 23. comum em crianças, traduzindo-se pelo aparecimento de um nódulo subcutâneo queaumenta em volume, provocando intumescimento extensivo, progressivo e lento.Geralmente o paciente não apresenta imunodepressãoAgentes envolvidos pertencentes aos gêneros Conidiobolus e Basidiobolus.Doença de Jorge Lobo – dermatose que provoca lesões tipo quelóides com ausênciade comprometimento visceral, ausência de adenopatia satélite, longa evolução do processo.Nem sempre as lesões cutâneas assumem aspecto puramente queloidiano ao lado e lesõespapulosas, nodulares, verrucosas, e tuberosas podem ocorrer.Agente etiológico, Lacazia loboi (Loboa loboi) ainda não cultivado.Micoses sistêmicasOs fungos que causam micoses sistêmicas vivem em forma sapróbia no solo.Alguns animais de vida silvestre são reservatórios importantes. Os indivíduos podemdesenvolver a doença principalmente por inalação de propágulos.Todos os agentes de micoses profundas apresentam dimorfismo térmico. Nanatureza e nos cultivos a 25°C, formam colônias filamentosas com reprodução assexuada.Nos tecidos e cultivos a 37°C eles apresentam sua forma leveduriforme.Estes fungos são taxonomicamente heterogêneos: Histoplasma capsulatum,Paracoccidioides brasiliensis, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis.Histoplasma capsulatum – é agente de infecção relacionada a indivíduos quevisitam grutas ou lugares com morcegos. 90-95% dos casos são assintomáticos ou sub-clínicos e os sintomas respiratórios gripais se resolvem espontaneamente. Esporadicamentealgum paciente pode apresentar uma forma pulmonar aguda da doença, com suoresnoturnos, tosse, febre e emagrecimento. É fulminante em pacientes com imunodeficiência.Paracococcidioides brasiliensis – a infecção geralmente se caracteriza por lesõespulmonares semelhantes às da tuberculose e de outras micoses. Lesões nas mucosas nasais,oral, pele e outros órgãos podem ocorrer.23
  24. 24. Blastomyces dermatitidis – O microrganismo ao ser inalado, produz infecçãorespiratória crônica e branda, que piora gradualmente, ao longo de semanas ou meses.Escarro torna-se purulento, sanguinolento. A fase respiratória da doença tem semelhançascom tuberculose, coccidioidomicose, paracoccidioidomicose e histoplasmose. Podeprovocar lesões subcutâneas, ósseas, etc.Coccidioides immitis – Por inalação dos conídios após 14 dias, 60% dos pacientesapresentam infecção respiratória assintomática. O restante 40% apresenta sintomas dadoença respiratória gripal leve ou raramente grave. Complicações pulmonares, na forma decavidades ou de pneumonia ocorrem em 5%. Pode ocorrer disseminação por viahematogênica dos pulmões para os ossos, as articulações, a pele, os tecidos subcutâneos,etc.Micoses oportunísticasA maioria dos fungos que produzem micoses oportunísticas são saprófitos do meioambiente, de crescimento rápido, normalmente inalado. Esses organismos geralmente nãosão patogênicos, mais atuam como patógenos oportunistas. O indivíduo que apresentaalgum tipo de depressão imunitária em decorrência de doença ou em especial, do uso demedicamentos imunossupressores, antibioticoterapia por longo tempo, pode ser alvo deinfecções oportunísticas.Zigomicose – infecção fúngica aguda causada por fungos da divisão Zigomycota, osesporos desses fungos podem infectar os seios paranasais e a área peri-orbital. A infecçãorapidamente se dissemina para os vasos sanguíneos vizinhos, causando necrose e trombose,vascular (CID). A partir daí se difunde para o encéfalo e para as meninges, produzindomeningoencefalíte, rapidamente fatal. Essa doença pode se disseminar para os pulmões epara o tubo digestivo.Principais agentes envolvidos: Absidia sp., Apophysomyces sp., Mucor sp.,Rhizopus sp., Saksenaea sp., Cunninghamella sp..24
  25. 25. Feohifomicoses – Infecções causadas por fungos demáceos que apresentam hifasescuras nos tecidos. O número de agentes envolvidas é, em geral, muito grande e tende aaumentar.Alternaria spp. – produz quadros como ceratomicose, infecções cutâneas,osteomielite, doenças pulmonares e infecção do septo nasal.Bipolaris spp. – causam ceratomicose e sinusite fúngica, abscessos subcutâneos,meningite, alergias e peritonite.Cladosporium spp., Epicoccum spp. e Nigrospora spp. – causa ceratomicose ealergias.Curvularia spp. – causam ceratomicoses, micetoma, endocardite, infecçãopulmonar, alergias e infecção do septo nasal.Exserohilum spp. – sinusite fúngica, embolia aórtica, úlcera de córnea e meningite.Hialohifomicoses – Infecção causada por fungos hialinos (hifas hialinas)Acremonium sp. - pode causar ceratomicose, lesões do palato duro, meningite,artrite e doenças sistêmicas.Aspergillus sp. - o Aspergillus fumigatus é o patógeno oportunista mais comum dogênero. Aspergilose disseminada, doenças pulmonares, broncopneumonia alérgica,ceratomicose, otomicose e infecção dos seios paranasais.Fusarium spp. - causa mais comum de ceratomicoses, onicomicoses, otomicoses,úlceras varicosas, micetoma, osteomielite. Tem sido identificado também em lesõessistêmicas em transplantados de medula óssea.25
  26. 26. Paecilomyces spp. – implicados em casos de peniciliose, endoftalmite, endocardite,derrame pleural e lesões cutâneas.Penicillium spp. – causam ceratomicose, peniciliose, otomicose, onicomicose e,raramente, infecções profundas. Penicillium marnefei produz uma forma disseminada depeniciliose, é o único agente dimórfico do grupo.Scopulariopsis sp. – ceratomicose, otomicose e onicomicose.Criptococose – Em geral produz infecções pulmonares brandas muitas vezessubclínicas. Em pacientes sintomáticos manifesta-se como tosse e febre, radiografiasdemonstra nódulos isolados ou múltiplos nos campos pulmonares médio e inferior quepodem calcificar. Muitos pacientes apresentam infiltrados densos pulmonares. Nadisseminação ocorre infecção hepato-esplênica, osteomelite, comprometimento subcutâneoe nódulos cutâneos semelhantes ao molusco contagioso. A meningites é a forma grave dadoença foi atinge grande parte de indivíduos com AIDS.Agente etiológico: Cryptococcus neoformans var neoformans, Cryptococcusneoformans var gattii, com os sorotipos A, B, C, D.Candidíse, Trichosporonose e Malasseziose – descritos anteriormente.Leveduroses por:Geotrichum candidum – Produz infecções orais com placas brancas semelhantes àsde candidíase, ao passo que a forma intestinal da doença provoca colite e fezessanguinolentas. As manifestações bronquiais são as mais comuns; tosse crônica e o escarromucóide e sanguinolento que provocam lembra tuberculose. Já foram documentadasinfecções vaginais.Toluropsis glabrata – patógeno oportunista que geralmente provoca doenças empacientes debilitados. Os pulmões e os rins são os órgãos mais afetados, embora esse fungo26
  27. 27. possa disseminar-se para o restante do corpo através do sangue, causando fungemia echoque séptico.Pneumocystis carinii – Pneumocystis se adere às células epiteliais e penetram aocitoplasma, aumentando a permeabilidade capilar do alvéolo, produzido danos namembrana basal do alvéolo formando exudado alveolar eosinofílico. O agente não tem sidocultivado.4.- Identificação dos FungosPRINCIPAIS CARACTERISTICAS MACROMORFOLOGICAS DOS FUNGOS4.a- Identificação dos Fungos27
  28. 28. Os caracteres macromorfológicos da colônia fúngica podem variarconsideravelmente entre um meio de cultivo e outro, dependendo da constituiçãonutricional ou devido a diferentes tempos e temperaturas de incubação. Conseqüentementeé fundamental em que meio e condições foi incubado o agente.A análise macroscópica dos cultivos visa caracterizar.1- Textura: serosa, cremosa, mucóide, membranosa, pulverulenta, granular, camurça,cotonosa.2- Topografia: plana, convexa, umbilicada, pregueada, cerebriforme.3- Aspecto: brilhante, opaco, seco, úmido.4- Superfície: lisa, fissurada, rugosa.5- Bordas: regulares, irregulares, radiadas.6- Cor da colônia: branco, preto, verde, vermelho, etc.7- Pigmento: presença ou ausência, cor do pigmento, difuso ou restrito à colônia.8- Tempo de crescimento.9- Diâmetro da colônia.Técnica de esgarçamento:Utilizada para identificação micromorfológica de fungos filamentosos. Com alça deplatina em L, retirar um fragmento da colônia, colocar em lâmina com una gota delactofenol azul de algodão e com auxilio de agulhas esgarçar bem. Cobrir com lamínula,comprimir levemente e observar ao microscópio com aumento 10X ou 40X.Cultivo em lâmina.Nesta técnica as estruturas permanecem devem permanecer íntegras e o meioutilizado pode ser Sabouraud dextrose ágar, batata ágar, lactrimel ágar ou V8.Esterilizar placas de Petri com uma lâmina no interior, papel de filtro e lamínula.Colocar o meio de ágar em placa. Deixar solidificar.28
  29. 29. Com a alça em L, destacar porções bem pequenas da colônia do bolor, crescida no ágar ecolocar nos quatro lados do pedaço de ágar.Cobrir com lamínula esterilizada, pressionando levemente.Colocar um pouco de água destilada esterilizada no fundo da placa esterilizada,repor a água esterilizada, sempre que necessário. Deixar por 10-15 dias, dependendo davelocidade de crescimento do fungo.Lâmina suporteLâmina paramicrocultivoÀgar batataLamínulaUmedecer com 4 mlde água esterilizada29
  30. 30. Para montar, retirar a lamínula com pinça estéril. Fixar o fungo na lamínulacolocando 1 a 2 gotas de álcool e esperar secar. Montar essa lamínula em uma lâminalimpa, com uma gota de lactofenol azul-algodão.A lamínula pode ser vedada com esmalte de unha ou Etellan para conservar pormais tempo.Pode, também, ser montada a lâmina do microcultivo, retirando-se o pedaço deágar, fixando com álcool e colocando uma lamínula limpa, com uma gota de Lactofenolazul-algodão.A classificação e identificação dos fungos estão baseadas principalmente nos caracteresmacro e micromorfológicos, assim como no método de reprodução sexual do organismoisolado. O processo de identificação de leveduras inclui testes bioquímicos, que serãodiscutidos posteriormente. Observamos atualmente em micologia, a participação crescentedas técnicas de biologia molecular, no auxílio taxonômico.Nosso primeiro grande objetivo é diferenciar colônias leveduriformes e filamentosas.1.- Observe e descreva as principais características macroscópicas das diversas colôniasfúngicas a serem analisadas:a) Colônias leveduriformesb) Colônias filamentosasMicromorfologia dos fungos de interesse em micologia médica4b. Rotina de Identificação de Leveduras30
  31. 31. l - ISOLAMENTO1 - Princípio:Freqüentemente as leveduras crescem com bactérias em cultura, ou pode haver odesenvolvimento de mais de uma espécie de levedura no mesmo cultivo. Para a corretaidentificação das leveduras é essencial utilizar culturas puras. O primeiro passo portanto,consiste na purificação dos cultivos.2 - Material utilizado:- água destilada esterilizado- alça de platina- cultivo de levedura a ser identificada- placas de Sabouraud dextrose ágar com cloranfenicol3 - Técnica:Preparar uma suspensão da colônia em água destilada esterilizada de acordo com ono 3 da escala de MacFarland. Com o auxílio de uma alça de platina semear em estrias emplaca de Sabouraud dextrose ágar com cloranfenicol.Incubar a 37°C por 48 horas. A cultura isolada será utilizada para as provas deidentificação.OBS: Quando não houver crescimento ideal nesta temperatura, proceder oisolamento em outra placa e incubar à temperatura ambiente.31
  32. 32. ll - Prova do tubo germinativo1 - Princípio:Esta é uma prova presuntiva para Candida albicans. O tubo germinativo é formadodentro de 2 horas por C. albicans, mas outras espécies, como Candida tropicalis podemproduzi-lo após 3 horas. Aproximadamente 95% das amostras de C. albicans são positivas.O tubo germinativo difere da pseudo-hifa por não ser septado, apresentar paredesparalelas e não possuir constrição na sua extremidade “abaulada”.2 - Material utilizado:- 0,5 mL de soro humano, de cavalo, de carneiro, etc.- pipetas Pasteur- lâminas- lamínulas3 - Técnica:Semear cultivo de 24-48 horas, em tubo contendo 0,5 mL de soro. Incubar a 37°Cdurante duas horas. Adicionar uma gota da suspensão com pipeta Pasteur em lâmina ecobrir com lamínula. Examinar ao microscópio com objetivas de 10 x e 40x.4 - Estruturas observadas ao microscópio:32
  33. 33. lll - Prova do clamidoconídio (microcultivo)1 - Princípio:Observar a existência ou não de filamentação, a produção de clamidoconídios,blastoconídios e de artroconídios, assim como a disposição destes elementos no micélio. C.albicans produz clamidoconídios arredondados em posição intercalar ou terminal emrelação à pseudohifa. De modo geral, a maioria das espécies do gênero Candida formampseudohifas bem desenvolvidas. Já as leveduras dos gêneros Torulopsis, Rhodotorula eCryptococcus não produzem pseudohifas. Algumas leveduras ascosporadas apresentampseudohifas rudimentares ou não as formam. A presença de artroconídios é sugestiva deGeotrichum spp. ou Trichosporon spp, este último associado a blastoconídios.2 - Material utilizado:- Cultivos de 24-48 horas- Ágar fubá- Placas de Petri (90x15 mm)- Alça de platina com extremidade retilínea- Lamínulas esterilizadas3 - Técnica:Fundir o meio de ágar fubá e verter sobre placa de Petri. Após a solidificação, como auxílio de uma alça de platina, fazer 3 estrias finas, paralelas na superfície da placa ecobrir com lamínula esterilizada. Incubar a 25°C, durante 48-96 horas. Examinar aomicroscópio, com objetivas de 10 x e 40x.4 - Observação ao Microscópio:33
  34. 34. IV - Prova de assimilação de fontes de C e N (auxanograma)1- PrincípioO teste de assimilação indica a habilidade de uma levedura para utilizar umcomposto na presença de oxigênio. Cada espécie possui seu padrão próprio de assimilação.Essas provas são muito sensíveis e úteis para a identificação das leveduras. Estãocondicionados a fatores de permeabilidade, sistemas enzimáticos que catalisam adegradação dos hidratos de carbono e ao sistema redutase que intervêm na redução donitrato.2- Material utilizado- Cultivo de 24-48 horas- Meio C- Meio N- Placas de Petri 150 x15 mm esterilizadas- Placas de Petri 90 x 15 mm esterilizadas- Fontes de carbono (dextrose, maltose, sacarose, galactose, lactose, trealose,melibiose, L-arabinose, celobiose, xilose, rafinose, dulcitol, ramnose, inulina,inositol)- Fontes de nitrogênio (peptona e KNO3)3- TécnicaPreparar suspensão da levedura ajustando a turbidez de acordo com o padrão 5 daescala de MacFarland. Fundir os meios C e N e estabilizá-los em banho Maria a 50°Cdurante a realização da prova. Para verificar a assimilação de fontes de carbono, misturar 2mL da suspensão com 40 mL do meio C e verter em placa de Petri de 150 x 15 mm. Paraobservar a assimilação de fontes de nitrogênio, misturar 1 ml da suspensão com 20 ml domeio N, e verter em placa de Petri de 90 x 15 mm. Após a solidificação dos meios,distribuir equidistantemente as fontes de carbono (meio C) ou nitrogênio (meio N) sobre o34
  35. 35. ágar. Incubar a 30°C durante 24-48 horas. Realizar leitura e observar surgimento de halo decrescimento na área correspondente a cada fonte.4- LeituraGli Gal Mal Sac Lac Raf Tre Mel Ram Dul Ino Cel Inu Man Xil KNO3PepV - Prova de fermentação de Açúcares (zimograma)1- PrincípioA habilidade de uma levedura para fermentar um determinado açúcar dependerá dapresença ou ausência de um sistema de transporte que permitirá a absorção do açúcar abaixas tensões de O2 e da presença de um sistema enzimático que atuará na degradaçãoglicolítica do açúcar com a formação de etanol e anidrido carbônico. A fermentaçãopositiva ou negativa de um determinado açúcar é um dado complementar para diferenciaras espécies.2- Material- Cultivos de 24-48 horas- Água destilada esterilizada (4ml)- Meio de cultivo para a fermentação de açúcares: dextrose, maltose, sacarose,lactose, galactose, e trealose- Bateria de meios para fermentação (tubos de rosca com tubos de Durhan)- Pipeta automática calibrada para 200 microlitros35
  36. 36. 3. TécnicaPreparar uma suspensão de leveduras (turbidez de acordo com o padrão 5 da escalade MacFarland). Inocular 200µl da suspensão em tubos de ensaio contendo os respectivoscarboidratos. Incubar a 37°C por 24-72 horas. Realizar leitura observando a produção deácido (mudança de cor do meio) e gás (formação de bolha no interior do tubo de Durhan).A observação da prova é válida até 20 dias após a realização da mesma.4- LeituraAçúcar Dex Malt Sac Lac Galac TrealGás36
  37. 37. VI - Produção de Urease1- PrincípioÉ prova complementar de grande utilidade para confirmar a identificação dealgumas leveduras. Por exemplo, Cryptococcus spp., Trichosporon spp. e Rhodotorula spp.O dermatófito T. mentagrophytes são urease positivos.2- Material-Cultivo de 24-48 horas-Meio de uréia de Christensen3- TécnicaSemear cultivos de 24-48 horas na superfície do meio de uréia de Christensen.Incubar à temperatura de 30°C durante 24-48 horas e observar a viragem do indicador.4- LeituraVermelho = positivoAmarelo = negativoII - Produção de Cápsula1- PrincípioA formação de cápsula é observada em espécies de Cryptococcus, embora possaocorrer em outras espécies de leveduras. A observação de cápsula no exame direto de umalevedura necessita complementação posterior da identificação através de outras técnicas(prova da urease, cultivo em meio niger, auxanograma, etc.).37
  38. 38. 2- Material-Cultivo da levedura-problema-Lâmina-Lamínula-Água destilada esterilizada-Tinta da China3- TécnicaApós homogeneizar a levedura com uma gota de água destilada e uma gota de tintada China sobre uma lâmina, sobrepor uma lamínula e observar ao microscópio.4- LeituraAs preparações positivas irão mostrar a presença de uma área clara, a cápsula, emtorno da célula leveduriforme, sobre um fundo negro.VIII - Produção de pigmento no ágar-niger1- PrincípioQuando Cryptococcus neoformans é semeado num meio contendo extrato desemente de niger, girassol ou alpiste, as colônias tornam-se negras ou marrons devido aatividade de fenol oxidase da levedura. Colônias de outras leveduras, incluindo outrasespécies de Cryptococcus irão manter sua cor original. Esse meio deve ser utilizado natriagem para isolamento de C. neoformans.2- Material-Meio de ágar-niger-Alça de platina-Cultivo da levedura-problema38
  39. 39. 3- TécnicaSemear a levedura-problema em placa contendo meio de ágar-niger, pelo método doesgotamento. Observar o crescimento da levedura na placa incubada a 37oC.4- LeituraA colônia de C. neoformans apresenta coloração marrom ou negra.IX - Produção de ascosporos (Eugenio Reyes Arenas)1- PrincípioAlgumas espécies de leveduras formam ascos, que alojam esporos sexuados, asascosporas. A observação dessas estruturas é importante para a identificação da levedura.Para estimular a produção de ascosporas é necessário cultivar o isolado em meios especiais2- Material-Cultivo da levedura-problema-Placa contendo meio de Gesso, ou V-8.-Alça de platina-Bateria de Ziehl Nielsen-Lâmina3- TécnicaSemear a levedura-problema em meio de apropriado e incubar a 37°C ou àtemperatura ambiente, de acordo com a exigência do isolado. Após 5-7 dias, realizaresfregaço em lâmina, corar pela técnica de Ziehl Nielsen e observar ao microscópio comobjetiva de 100 x.39
  40. 40. 4- LeituraExaminar a forma e tamanho dos ascos e ascosporas e o número de ascosporas emcada asco.Principais estruturas microscópicas dos fungosHifa: Estruturas tubulares, constituídas de talo filamentoso (Segundo a cor, podem serclassificadas como hialina ou demácea) Septada; dividida em compartimentoscelulares através de septos parciais, completosou perfurados. Cenocítica; filamento contínuo não sendo“aparentemente” dividida por septos.2. Blastoconídio: Organismo unicelular globoso,ovóide ou elipsóide denominado levedura. Seorigina quando a célula mãe gera um ou maisindivíduos por um processo denominadobrotamento ou gemulação.3. Pseudohifa: Constituída pela sequência debrotamentos de leveduras sem separação entreas células filhas gerando uma estruturaalongada, de paredes não paralelas, sem septomas com ponto de contrição entre uma célula eoutra. Podem existir brotamentos lateraismúltiplos que nascem a partir do ponto decontricção, formando assim o pseudomicélio.40
  41. 41. 4. Artroconídios: São elementos retangulares deparedes grossas formados por fragmentaçãodas formas cilíndricas dos fungos previadivisão do material genético.5. Clamidoconídios: Estrutura de resistênciaproduzida pelo fungo como resposta frente àscondições adversas do meio. Células geralmenteglobosas ou ovóides, de volume aumentado,parede dupla e espessa. A localização no micéliopode ser intercalar, apical ou terminal. Os conídeostambém podem apresentar esta estrutura.Os fungos têm ciclos de reprodução assexual e sexual, onde os elementos de frutificaçãopodem ter uma disposição interna ou externa.1. Zygomycota: Esporos sexuados-zigosporas. Esporos endógenos assexuados-esporangiósporos, contidos em esporângios.3. Ascomycotina: Em algum estágio da vida, produzem esporos endógenos sexuados-ascosporos dentro de estruturas em forma de saco denominados ascos. Segundo amorfologia do asco adquire a denominação de peritécio, apotécio ou cleistotécio.4. Basidiomycotina: Esporos sexuados- basidiósporos situados externamente sobre acélula mãe-baside.5. Chytridiomycota:41
  42. 42. Reprodução Disposição EstruturasAssexuada Externa Conídios, picnidioconídiosInterna EsporangiósporosSexuada Externa BasidiósporosInterna Ascos simples, ascostroma, peritécio, cleistotécio,apotécio.Observe e descreva os caracteres microscópicos dos seguintes exemplos de reprodução dosfungos.Reprodução assexuada externaReprodução assexuada internaReprodução sexuada interna42
  43. 43. 2.- Observe e desenhe as seguintes estruturas microscópicas dos seguintes fungosfilamentosos:Trichophyton rubrum T. mentagrophytes T. tonsuransMicrosporum gypseum Microsporum canis Epidermophyton floccosumAspergillus spp Penicillium spp Paecilomyces spp43
  44. 44. Fusarium spp Rhizopus spp Mucor sppPhialophora spp Cladosporium spp Fonsecaea pedrosoiAlternaria spp Curvularia spp Nattrassia mangiferae44
  45. 45. Sporothrix schenkii Histoplasma capsulatum Paracoccidioides brasiliensis25° 25° 25°37° 37° 37°45
  46. 46. 6.- Referências bibliográficasArango M.; Castañeda E. Micosis Humanas Procedimentos Diagnósticos Exámenesdirectos. 1995.Ellis D.H. Clinical Mycology. The human opportunistic Mycoses. P. Fazer Inc. GuillinhamPrinters Pty. Ltd. Australia 1994.Hoog G.S. et al Atlas of clinical fungi. Contraolbureau oor Schimmelcultures,Netherlands/Universitat Rovira Virgili , Spain. 2000.Kern M. A. Medical Mycology. A Self-Instructional Text. F. A. Davis Company.Philadelphia, 3 er ed 1988.Lacaz C.Z.; Porto E.; Martin J. C. Micología Médica: Fungos, actinomicetos e algas deinterese médico 7 de. São Paulo: Sarvier, 1984.Richardson M.D. & Warnock D.W. Fungal Infection. Diagnosis and managment.Blockwell Scientific publication, london. 1er ed 1993.46
  47. 47. AutoresAgenor Messias JuniorArnaldo Lopes ColomboEugenio Reyes ArenasOlga Fischman GompertzPatrício Godoy MartinezVictor Silva VargasColaboradoresCledja Soares deAmorimEdméa Helena de OliveiraFabiane Camargo G. NunesLeila Paula de AlmeidaLuis Zaror CornejoMarly ForjazZelinda Maria Nakagawa47

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